一种崖柏提取物及其在制备预防或治疗神经退行性疾病药 物中的应用 【技术领域】
本发明涉及崖柏提取物在预防与治疗帕金森症与老年痴呆药物中的应用。背景技术 神经退行性疾病 (neuro degenerative diseases， NDD) 是一类慢性、 进行性神 经疾病。虽然这类疾病的病变部位及病因各不相同， 但神经细胞退行性病变是它们的共同 点。该类疾病主要包括帕金森病 (Pakinson’ s disease， PD)、 老年痴呆症 (Alzheimer’ s disease， AD)、 舞蹈病 (Huntington disease) 和肌萎缩侧索硬化症 (amyotrophic lateral sclerosis， ALS) 等。 神经退行性疾病患者常有记忆力下降， 认知困难， 痴呆， 动作平衡失调， 运动能力丧失等症状， 病人生存质量严重下降。加上病程长， 无法治愈， 给病人及其家庭带 来极大的经济和心理压力。
目前， 治疗神经退行性疾病的药物大多数只能减轻症状， 达不到治愈的目的， 并有 较明显的副作用。例如， 到目前为止还没有任何一种药物或治疗方式能够完全阻断 PD 的疾 病进程 ； AD 治疗药物他克林 (tacrine)， 因其肝脏毒副作用及明显药物相互作用而淘汰， 多 奈哌齐 (donepezil)， 利斯的明 (rivastigmine) 和加兰他明 (galantamine) 三者的副作用 主要表现为恶心、 呕吐、 腹泻、 厌食。因此， 研究开发能同时保护神经细胞和改变疾病病程， 并且无副作用的神经退行性疾病治疗药成为当务之急。
崖柏 (Thuja sutchuenensis Franch.) 为柏科崖柏属常绿乔木， 为我国特有的珍 稀濒危植物。该物种在 1892 年被法国传教士首次发现， 曾被认为是已灭绝的 3 种中国特有 植物之一， 1999 年又被重新发现， 分布在我国重庆市东北的城口县大巴山自然保护区和开 县雪宝山自然保护区、 四川省万源市花萼山自然保护区和湖北省保康县五道峡自然保护区 ( 在甘肃天水地区也有发现 )。 《本草纲目》 中介绍柏有极高的药理价值 ： “柏性后调而耐久， 坚凝之质， 乃多寿之木， 可以服……无毒， 除风湿， 安五脏， 久服， 令人润泽美色……兴阳道， 益寿， 去百邪鬼魅， 润肝、 养心气， 润肾燥” 。
发明内容 本发明目的在于提供一种崖柏提取物的制备方法。
本发明的另一个目的是提供利用该方法提取的崖柏提取物在制备预防或治疗神 经退行性疾病的作用。
为了实现上述目的， 本发明通过下面的技术方案实现 ：
一种崖柏提取物， 由如下步骤制备而成 ：
(1) 取崖柏木材， 加工成饮片或木屑后， 加溶剂提取， 提取溶剂为水或乙醇或其混 合溶剂， 每次加提取溶剂 5 ～ 20 倍体积， 提取方法为浸提或加热回流提取， 提取液回收溶剂 得浸膏 ；
(2) 浸膏脱脂 ： 浸膏加入 5 ～ 20 倍体积水， 加热使充分溶解， 趁热滤过， 滤液浓缩
至相对密度 1.05 以上， 得脱脂后浸膏 ；
(3) 醇沉 ： 将脱脂后的浸膏加入乙醇使醇质量浓度至 50％～ 80％， 放置 1 小时～ 72 小时， 滤过， 滤液回收溶剂， 即得崖柏提取物。
其优化步骤为 ：
(1) 取崖柏木材， 加工成饮片或木屑后， 加水提取， 每次水 10 倍体积， 提取三次， 加 热回流提取， 提取液回收溶剂得浸膏， 相对密度 1.20 以上 ；
(2) 浸膏加入 10 倍体积水， 加热使充分溶解， 趁热滤过， 滤液浓缩至相对密度 1.05 以上， 得脱脂后浸膏 ；
(3) 将脱脂后的浸膏加入乙醇使醇质量浓度至 60％， 放置 24 小时， 滤过， 滤液回收 溶剂， 即得崖柏提取物。
与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果 ：
将本发明制备得到的崖柏提取物进行 PC12 细胞试验和抗老年痴呆线虫模型实 验， 结果表明崖柏提取物能显著抑制 MPP+ 致 PC12 细胞的凋亡， 能延长线虫的瘫患时间， 对 帕金森症和老年痴呆有预防和治疗作用。 附图说明
图 1 为崖柏提取物线虫抗老年痴呆模型实验图。具体实施方式
实施例 1 ： 崖柏提取物的制备
取崖柏木材 1kg， 加工成饮片后， 加水提取， 每次加水 10 倍体积， 提取三次， 热回流 提取， 提取液回收溶剂得浸膏 ； 浸膏加入 5 倍体积水， 加热使充分溶解， 趁热滤过， 滤液浓缩 至相对密度 1.05 以上， 得脱脂后浸膏 ； 将脱脂后的浸膏加入乙醇使醇质量浓度至 50％， 放 置 10 小时， 滤过， 滤液回收溶剂， 即得崖柏提取物。
实施例 2 ： 崖柏提取物的制备
取崖柏木材 1kg， 加工成木屑后， 加乙醇提取， 每次加乙醇 5 倍体积， 提取三次， 浸 提， 提取液回收溶剂得浸膏 ； 浸膏加入 20 倍体积水， 加热使充分溶解， 趁热滤过， 滤液浓缩 至相对密度 1.05 以上， 得脱脂后浸膏 ； 将脱脂后的浸膏加入乙醇使醇浓度至 80％， 放置 1 小时， 滤过， 滤液回收溶剂， 即得崖柏提取物。
实施例 3 ： 崖柏提取物的制备
取崖柏木材 1kg， 加工成饮片后， 加水提取， 每次加 50 质量％乙醇 10 倍， 提取三次， 浸提， 提取液回收溶剂得浸膏 ； 浸膏加入 12 倍体积水， 加热使充分溶解， 趁热滤过， 滤液浓 缩至相对密度 1.05 以上， 得脱脂后浸膏 ； 将脱脂后的浸膏加入乙醇使醇质量浓度至 70％， 放置 50 小时， 滤过， 滤液回收溶剂， 即得崖柏提取物。
实施例 4 ： 崖柏提取物的制备
(1) 取崖柏木材， 加工成木屑后， 加水提取， 每次水 10 倍体积量， 提取三次， 加热回 流提取， 提取液回收溶剂得浸膏 ( 相对密度 1.20 以上 ) ；
(2) 浸膏加入 10 倍体积水， 加热使充分溶解， 趁热滤过， 滤液浓缩至相对密度 1.05 以上， 得脱脂后浸膏 ；(3) 将脱脂后的浸膏加入乙醇使醇质量浓度至 60％， 放置 24 小时， 滤过， 滤液回收 溶剂， 即得崖柏提取物。
实施例 5 ： 崖柏提物抗帕金森症细胞实验
取以上实施例 1 ～实施例 4 中崖柏提取物进行实验。
采用 PC12 细胞 ( 大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞株 )， 于含体积分数为 5％马血 清， 5 ％胎牛血清， 100U/mL 青霉素， 100g/mL 链霉素的 DMEM 培养液中培养， 培养细胞置于 37℃、 饱和湿度 5％ CO2 浓度下， 2 ～ 3 天换液 1 次。取对数生长期生长状态良好的细胞以 5 1 ～ 5×10 个 /mL 接种于 96 孔培养板， 每孔 100μL。37℃、 5％ CO2 培养箱中孵育 24 小时， + 细胞贴壁生长后， 实验组加入 0.75mM 的 MPP 同时加入不同浓度的受试药物培养基， 每个浓 + 度设 8 个复孔。同时设正常对照组 ( 加不含受试药物及 MPP 的完全培养液 )、 造模组 ( 加 + 入 0.75mM 的 MPP 培养液 ) 和空白对照组 ( 无细胞孔中加入不含受试药物的培养液 )， 继续 培养 24 小时。MTT 法检测细胞活力， Hoechst33258 荧光染色法检测细胞凋亡。
崖柏提取物在 100μg/ml、 50μg/ml 和 25μg/ml 生药浓度下可提高 MPP+ 损伤的 PC12 细胞的细胞活性， 细胞活性分别提高 29.5％、 17.4％和 6.8％。100μg/ml 生药浓度的 崖柏提物处理组， 同组造模组相比， 细胞密度大、 细胞核型改变减少， 细胞凋亡状况较造模 + 组明显改善。崖柏提取物能显著抑制 MPP 致 PC12 细胞的凋亡。
实施例 6 ： 崖柏提取物抗老年痴呆线虫模型实验
取以上实施例 1 ～实施例 4 中崖柏提取物进行实验。
转基因秀丽隐杆线虫 CL4176 在涂布 OP50 大肠杆菌的 NGM 培养基上 15℃下传代 培养。培养 3 天后进行同步化处理， 用双蒸水将线虫和卵从培养皿上洗下来， 每次 1mL， 洗 两次 ； 用双蒸水补至 3.5mL 体积， 加入 0.5mL 5N NaOH 溶液和 1mL 5％ NaClO 溶液 ； 剧烈振 荡 30 秒， 静置 2min， 1300g 离心 60 秒， 弃上清 ； 加 5mL 双蒸水， 振荡， 1300g 离心 60 秒， 弃上 清； 将沉淀 ( 虫卵 ) 转移到新的涂布 OP50 大肠杆菌的 NGM 培养基中， 15℃下培养。同步化 24 小时后将虫用 1mL 双蒸水洗下来， 滴加到加受试药物的培养皿中每个皿 25 条左右。受 试药物崖柏提取物用 DMSO 溶解， 以石杉碱甲为阳性对照药， 给药后 12 小时将培养皿转移到 26℃下培养， 转温 36 小时后开始计数观察线虫瘫痪情况， 每 3 小时计数一次， 直到全部线虫 瘫痪。结果见图 1。表明崖柏提取物有抗老年痴呆作用。