蓝萼乙素衍生物、 制备方法及其用途 技术领域 本发明涉及蓝萼乙素 (GLB) 衍生物， 特别涉及含有多肽的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物。
本发明还涉及所述含有多肽的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物的制备方法及其在治疗癌 症中的应用。
背景技术 香茶菜为唇形科香茶菜属植物， 广泛分布于河南、 湖北、 四川、 贵州、 陕西、 山西、 河 北等省。全草具有抗菌、 消炎等作用， 民间用于治疗急性黄疽型肝炎、 急性胆囊炎、 跌打损 伤、 毒蛇咬伤、 脓疙疹等。其药理作用未见报道。对鄂西香茶菜粗制剂进行了药理作用的研 究， 结果表明其对体内和体外的艾氏腹水癌肿瘤细胞有明显的抑制作用。
唇形科香茶菜属植物。在亚洲东部和非洲西部广为分布， 全世界约有 150 种， 我国 约有 90 种 25 个变种。其中约有 30 种民间作为药用， 作为清热解毒、 抗癌消炎、 健脾、 活血、 杭菌药来使用。 人们对该属植物的 - 菇类成分作了研究， 已从中提取了百余种药类成分。 经
药理筛选发现许多二萜化合物具有细胞毒、 抗肿瘤、 杭炎活性作用。 在研究中还发现该属植 物除含二萜成分外， 还富含三萜， 脂肪酸以及少量的黄酮、 倍半萜、 链烃等。
蓝萼香茶菜是唇形科香茶菜属植物， 分布在我国的东北、 华北， 朝鲜 . 日本， 原苏 联远东地区， 吉林省资源尤其丰富。 蓝萼香茶菜具有健胃、 清热解毒、 活血、 抗菌消炎和抗癌 活性， 用于胃炎、 肝炎初起、 感冒发热、 乳腺炎、 关节痛等疾病。现代研究发现全草对心血管 有一定的作用， 而其中的有效成分对血小板聚集及癌症有一定的影响。从上世纪 80 年代至 今各国学者对其药理及化学等各方面进行了研究， 以我国学者研究的较多。
1981 年许云龙等人从蓝萼香茶菜中提取出蓝萼甲素 (glaucocalyxinA) 和蓝萼乙 素 (glaucocalyxinB)， 从光谱中推断蓝萼甲素具有香茶菜属二萜典型的巧一氧 -16 一贝壳 杉烯 (ent-15-oxo-I6-kaurene) 骨架， 而蓝萼乙素是蓝萼甲素的 14 一乙酰化物， 把两者分 别乙酰化， 得到相同的乙酰化物， 从而证实了两者的相互关系。 随后赵全成也从吉林产蓝萼 香茶菜中分得这两种二萜。
1988 年刘晨江等从北京地区产蓝萼香茶菜中分得甲素和乙素外， 还分得蓝萼丙素 (glaucocalyxinC)， 结构为对映 -7p， 14a， 15a- 三羟基 -16- 贝壳杉 -3- 酮。Dongsa kimls， 除了从中分出蓝萼甲素、 蓝萼乙素和蓝萼丙素， 还分出了两种新二萜 glaucocalyxinD 和 glaucocalyxinE 并列出了这五种化合物的结构红外紫外吸收值、 最主要的 1H 一核磁共振、 13C 一核磁共振化学位移值及质谱数据值。
金永日等从蓝萼香茶菜根中分得了蓝萼甲素， 另外王先荣等从安徽产王枣子 〔 Isodonamethystoides(Benth)CyWuetHsuan〕 中也分得蓝萼甲素。王慧芬等人用反相高效 液相色谱法外标法对不同部位及不同采集期的蓝萼香茶菜中蓝萼甲素的含量进行了测定， 结果表明叶中蓝萼甲素远高于根、 茎。不同采集期以 7-8 月份含量高， 9 月末含量下降。张 元桐等也采用反相 HPLC 测定蓝萼甲素含量， 测得蓝萼甲素含量为 1.03 ％， 平均回收率为 99.2％。赵全成从蓝萼香茶菜中分得 p 一谷甾醇和熊果酸。蓝萼香茶菜用乙醇提取后经硅胶柱层析和 HPLC 制备柱层析分离得到 4 个化合物齐墩果酸， 阿江榄仁酸， 毛花猕猴酸 B 和 熊果酸。代桂明玉等人从蓝萼香茶菜中还分得芦丁和和胡萝卜甙。
杨学俭等用日本岛津 AA-670 型原子吸收分光光度计， 以中科院环化所提供的桃 叶为标准参照物， 对蓝萼香茶菜的根、 茎、 叶分别进行测定发现蓝尊香茶菜的茎、 叶中 Fe， Cu， Mn， Se 的含量都是较高的， 现代医学研究已经证明， 这些元素的存在对防治癌症及其它 一些疾病是有作用的， 提示蓝萼香茶菜在此方面有一定作用。后有人用 ICP-AES 仪测定了 河北蓝萼香茶菜不同部位多种元素的含量， 发现其叶中 5 种宏量元素 K， Na， P， Ca， Mg 的含 量高于根和茎， 8 种微量元素 Zn， Fe， S， Ba， Li， Al， V， Ti 的含量也是叶中偏高， 首次发现香 茶菜叶中含有稀土元素 Ce， Y， Yb， 数据提示多年生草本植物蓝萼香茶菜的最佳药用部分可 能是叶。
刘兰娣等研究了蓝萼香茶菜对大鼠全心缺血一再灌注时心肌 C-FOS 基因表达的 影响。采用 dortl 离体全心缺血一再灌注损伤模型， 免疫组化法， 用相应 C-fos 抗体检测心 肌细胞中 C-fos 基因表达情况， 用计算机图像分析系统分析 C-fos 基因表达情况， 蓝萼香茶 菜生药用乙醇回流 3 次提取， 提取液回收乙醇， 浓缩后加到 0.5％淀粉糊中， 挥去乙醇， 浓度 为 1Kg/L， 分为高中低三种不同浓度的香茶菜对缺血一再灌注全心进行预灌注， 结果发现其 能明显减少凋亡相关基因 C-fos 基因的表达， 表明心肌缺血一再灌注损伤轻， 心肌受到一 定的保护， 同时发现高浓度蓝萼香茶菜具有一定的心肌细胞毒性作用。其具有与剂量相关 的心肌保护作用， 但并非浓度越大越有效。 综上所述， 蓝萼香茶菜在我国资源丰富。 化学研究表明其含有二萜和三萜成分， 但 其中以二萜成分蓝萼甲素、 乙素、 丁素为其主要的活性成分， 具有抗血小板聚集的作用。因 其母核为对映贝壳杉烯型的， 相似于冬凌草甲素 (oridonin)， 故可能具有一定的抗癌作用。
发明内容 本发明的目的之一在于提供能治疗癌症、 特别是治疗肺癌、 肝癌、 鼻咽癌、 淋巴瘤、 黑色素瘤和骨髓性白血病的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物， 该蓝萼乙素 (GLB) 衍生物特别对肺癌 具有靶向作用， 从而提供一种即可以治疗多种癌症就可以针对性的治疗肺癌的药物。
本发明的目的之二在于提供一种制备蓝萼乙素 (GLB) 衍生物的制备方法， 从而避 免单纯的采用有机合成所带来的毒副作用较大的缺陷， 并且避免单纯的采用原料提纯多带 来的药效较低、 无法针对性治疗某一特定癌症的缺陷。
本发明所公开的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物是一种二萜类物质， 具有贝壳杉烷型结 构、 羰基、 多肽 cNGQGEQc 和 / 或羟基， 其分子结构的通式如下 ：
其中， R1 为 -cNGQGEQc、 -OH 或R2 为 -cNGQGEQc 或 -OH。其中， 以下四种结构对治疗癌症、 特别是治疗肺癌、 肝癌、 鼻咽癌、 淋巴瘤、 黑色素 瘤和骨髓性白血病具有良好的效果。其中通过乙酰化反应引入多肽 cNGQGEQc， 来对主体二 萜进行结构修饰， 从而使得修饰后的蓝萼乙素 (GLB)， 即蓝萼乙素 (GLB) 衍生物对肺癌具有 靶向作用。
所述蓝萼乙素 (GLB)(C22H30O5) 的分子结构如下 ：本发明采用香茶菜药材 ( 地上部分 ) 作为原料， 进行粉碎、 提取、 溶液处理、 过柱、 重结晶等得到蓝萼乙素 (GLB)， 再和多肽 cNGQGEQc 进行进一步的乙酰化反应， 得到所述蓝 萼乙素 (GLB) 衍生物。所述的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物的制备方法， 具体包含以下步骤 ：
步骤 1 ： 粉碎
取香茶菜药材 ( 地上部分 ) 粉碎至 20 目～ 50 目。
步骤 2 ： 提取
步骤 2.1 ： 将步骤 1 所得的粉碎物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 6 至 1 ∶ 10 混合， 加热， 在 80℃～ 90℃温度条件下回流 1 ～ 2 小时， 提取、 过滤， 得到提取液和剩余物。
步骤 2.2 ： 将步骤 2.1 所得的剩余物与 95 ％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 6 至 1 ∶ 10 混合， 加热， 在 80℃～ 90℃温度条件下回流 1 ～ 2 小时， 提取、 过滤， 得到提取液和剩 余物， 重复该步骤 1 ～ 3 次。
步骤 2.3 ： 合并步骤 2.1 和 2.2 所得的提取液。
步骤 3 ： 溶剂处理
步骤 3.1 ： 将步骤 2 所得的提取液加热， 在 55℃～ 65℃温度条件下减压浓缩， 回收 乙醇并得到粘稠的初级浓缩物。
步骤 3.2 ： 将步骤 3.1 所得的初级浓缩物与水按照体积比 1 ∶ 8 ～ 1 ∶ 10 混合， 在室温条件下以 60 ～ 120 转 / 分的速度搅拌 10 分钟， 随后静置 6 ～ 12 小时， 弃去上清液 得到下层固体。
步骤 3.3 ： 将步骤 3.2 所得的固体与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 在 25℃～ 35℃温度条件下以 60 ～ 120 转 / 分的速度搅拌溶解， 静置 1 ～ 3 小时， 过 滤得到滤液和不溶物。
步骤 3.4 ： 将步骤 3.3 所得的不溶物与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 在 25℃～ 35℃温度条件下以 60 ～ 120 转 / 分的速度搅拌溶解， 静置 1 ～ 3 小时， 过 滤得到滤液和不溶物， 重复该步骤 1 ～ 3 次。
步骤 3.5 ： 合并步骤 3.3 和 3.4 所得的滤液。
步骤 3.6 ： 将步骤 3.5 所得的滤液加热， 在 35℃～ 45℃温度条件下减压浓缩， 回收 乙酸乙酯 (A.R.)， 得到固体浓缩物。
步骤 4 ： 过柱
步骤 4.1 ： 将步骤 3 所得的固体浓缩物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合溶解， 得到溶液。
步骤 4.2 ： 将步骤 4.1 所得的溶液缓慢加到树脂柱中， 观察树脂的颜色， 在树脂柱
有 2/3 变色时， 停止加样， 并采用 200ml ～ 400ml 的 95％乙醇 (A.R.) 冲洗该树脂柱， 收集所 有流出液， 所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化钠饱和至 pH 值中性。
步骤 4.3 ： 将步骤 4.2 所得流出液加热， 并在 55℃～ 65℃温度条件下减压回流， 直 至溶剂干， 得到固体残留物。
步骤 5 ： 重结晶
步骤 5.1 ： 将上述残留物与 30℃的～ 40℃的极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 得到初级溶液， 加热， 在 30℃的～ 40℃温度条件下减压浓缩， 在 -5℃～ -8℃温度条件 下静置析晶， 过滤得到黄色针状结晶。
所述极性溶剂为按照体积比 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 2 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的 混合溶液。
步骤 5.2 ： 将步骤 5.1 所得的结晶与极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 在 -5℃～ -8℃温度条件下反复重结晶 2 ～ 4 次， 得到浓缩物。
所述极性溶剂为按照体积比 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 4 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的 混合溶液。
步骤 6 ： 分离提纯 步骤 6.1 ： 将步骤 5 所得的浓缩物加入 20ml 乙酸乙酯 (A.R.) 溶解， 加入 200-300 目硅胶， 混合均匀， 室温挥发干燥， 除去溶剂乙酸乙酯 (A.R.)。
所述硅胶的加入量为所述浓缩物重量的 3 倍。
步骤 6.2 ： 湿法填装一根层析硅胶柱， 所述硅胶用量为步骤 5 所得的浓缩物重量的 20 倍， 柱子径高比为 1 ∶ 12， 并采用 2BV 氯仿 (A.R.) 反复冲洗硅胶柱。
步骤 6.3 ： 将步骤 6.1 所得的混有硅胶的浓缩物加入到步骤 6.2 所得的硅胶柱中， 采用 2BV 氯仿 (A.R.) 冲洗且流速为 1.5BV/ 小时。
步骤 6.4 ： 采用 3BV 氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液冲洗所述硅胶柱， 并采 用 TLC 薄层分析方法检验目标馏分蓝萼乙素 (GLB)， 在检验到相应馏分的时候， 收集含有蓝 萼乙素 (GLB) 主成分的馏分。
所 述 的 3BV 的 氯 仿 (A.R.) 和 丙 酮 (A.R.) 的 混 合 溶 液 中， 氯 仿 (A.R.) 和 丙 酮 (A.R.) 的体积比为 20 ∶ 1。
步骤 6.5 ： 将步骤 6.4 所得的馏分合并， 在 30℃～ 40℃温度条件下减压浓缩， 回收 溶剂， 将所得的浓缩物用氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液重结晶， 等白色针状晶体蓝 萼乙素 (GLB)。
所 述 氯 仿 (A.R.) 和 丙 酮 (A.R.) 的 混 合 溶 液 的 用 量 与 所 述 馏 分 的 体 积 比 为 8 ∶ 1 ～ 12 ∶ 1。
所述的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液中， 氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的 体积比为 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 4。
步骤 7 ： 合成
步骤 7.1 ： 将步骤 6 所得的蓝萼乙素 (GLB) 和多肽 (cNGQGEQc) 按照每 8 ～ 17g 蓝 萼乙素 (GLB)、 0.7 ～ 2.3g 多肽 (cNGQGEQc) 和 80 ～ 150ml 无水极性溶剂的比例混合得到 混合液， 所述无水极性溶剂为甲醇 (A.R.)、 乙醇 (A.R.)、 二氯甲烷 (A.R.) 中的一种。
步骤 7.2 ： 将步骤 7.1 所得的混合溶液加热， 在 60℃～ 80℃温度条件下搅拌冷凝
回流 6 ～ 10 小时， 趁热抽滤， 室温下静置， 析出晶体， 过滤， 分离出晶体， 得到蓝萼乙素 (GLB) 衍生物。
步骤 8 ： 合成
步骤 8.1 ： 将步骤 6 所得的蓝萼乙素 (GLB) 按照每 8 ～ 17g 蓝萼乙素 (GLB)， 每 70 ～ 130ml 乙醇溶液的比例混合， 将蓝萼乙素 (GLB) 溶解在乙醇溶液中， 在室温下向其中滴 加 1mol/L 的氢氧化钠溶液， 调节 PH ＝ 13， 持续搅拌 5 分钟， 再减压浓缩， 除去乙醇溶液， 得 到浓缩物。
步骤 8.2 ： 将步骤 8.1 所得的浓缩物加入乙酸乙酯， 在室温下进行萃取， 得到乙酸 乙酯萃取层， 共萃取 2 次， 得到萃取物。
每次萃取中所述乙酸乙酯的使用量为步骤 8.1 中氢氧化钠溶液的使用量的 2 倍量 ( 体积比 )。
步 骤 8.3 ： 将 步 骤 8.2 所 得 的 萃 取 物 与 30 ℃ ～ 40 ℃ 的 极 性 溶 剂 按 照 体 积 比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 得到初级溶液。
将得到的初级溶液加热， 在 30℃～ 40℃温度条件下减压浓缩， 在 -5℃～ -8℃温度 条件下静置析晶， 过滤得到结晶。
所述极性溶剂混合为按照体积比 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 2 混合的氯仿和丙酮的混合溶液。 步骤 8.4 ： 将步骤 8.3 所得的结晶与极性溶剂混合， 反复重结晶 2 ～ 4 次， 得到晶体。 所述极性溶剂混合为按照体积比 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 2 混合的氯仿和丙酮的混合溶液。
步骤 8.5 ： 将步骤 8.4 所得的晶体按照每 8 ～ 17g 所得晶体、 0.7 ～ 2.3g 多肽 (cNGQGEQc) 和 80 ～ 150ml 无水极性溶剂的比例混合， 得到混合溶液。
所述无水极性溶剂为甲醇、 乙醇、 二氯甲烷中的一种。
步骤 8.6 ： 将步骤 8.5 所得混合溶液加热， 在 60℃～ 80℃温度条件下搅拌冷凝回 流 6 ～ 10 小时， 趁热抽滤， 室温下静置析晶， 过滤， 分离出晶体， 得到蓝萼乙素 (GLB) 衍生 物。
经高效液相色谱、 LC-MS、 NMR 分析确认所得晶体为含有多肽 cNGQGEQc 的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物。
本发明同时公开了所述含有多肽 cNGQGEQc 的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物在治疗癌症 中的应用， 特别是在治疗肺癌、 肝癌、 鼻咽癌、 淋巴瘤、 黑色素瘤和骨髓性白血病中的应用。 由于该蓝萼乙素 (GLB) 衍生物是以蓝萼乙素 (GLB) 为基础并采用多肽 cNGQGEQc 通过乙酰 化反应对蓝萼乙素 (GLB) 进行结构修饰所得到， 其对于肺癌具有良好的靶向作用。
本发明所公开的前述任一结构的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物可以采用药剂学上的常 规药物载体制成任何一种剂型， 包括但不限于片剂、 胶囊剂、 软胶剂、 喷雾剂、 凝胶剂、 凝胶 吸入剂、 口服剂、 混悬剂、 冲剂、 贴剂、 软膏、 丸剂、 散剂、 注射剂、 输液剂、 冻干注射剂、 脂质体 注射剂、 靶向给药注射剂、 栓剂、 缓释制剂或控释制剂。优选为冻干注射剂。
附图说明
图 1 是本发明的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物的分子结构通式。
图 2 是本发明的蓝萼乙素 (GLB) 的分子结构式。图 3 是本发明实施例八的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物的分子结构式。 图 4 是本发明的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物制备过程中的中间产物的分子结构式。 图 5a ～ 5c 是本发明实施例九的三种蓝萼乙素 (GLB) 衍生物的分子结构式。具体实施方式
根据本发明的权利要求和发明内容所公开的内容， 本发明的技术方案具体如下所 述。
实施例一蓝萼乙素 (GLB) 衍生物的制备 ：
以下所制备过程中所采用的各化学试剂如无特别标注， 则为分析纯。
采 用 香 茶 菜 药 材 ( 地 上 部 分 ) 作 为 原 料， 提 纯 蓝 萼 乙 素 (GLB)， 并采用多肽 cNGQGEQc 修饰其结构， 制备蓝萼乙素 (GLB) 衍生物的制备方法， 具体包含以下步骤 ：
步骤 1 ： 粉碎
取香茶菜药材 ( 地上部分 ) 粉碎至 20 目～ 50 目。
步骤 2 ： 提取
步骤 2.1 ： 将步骤 1 所得的粉碎物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 6 至 1 ∶ 10 混合， 加热， 在 80℃～ 90℃温度条件下回流 1 ～ 2 小时， 提取、 过滤， 得到提取液和剩余物。 步骤 2.2 ： 将步骤 2.1 所得的剩余物与 95 ％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 6 至 1 ∶ 10 混合， 加热， 在 80℃～ 90℃温度条件下回流 1 ～ 2 小时， 提取、 过滤， 得到提取液和剩 余物， 重复该步骤 1 ～ 3 次。
步骤 2.3 ： 合并步骤 2.1 和 2.2 所得的提取液。
步骤 3 ： 溶剂处理
步骤 3.1 ： 将步骤 2 所得的提取液加热， 在 55℃～ 65℃温度条件下减压浓缩， 回收 乙醇并得到粘稠的初级浓缩物。
步骤 3.2 ： 将步骤 3.1 所得的初级浓缩物与水按照体积比 1 ∶ 8 ～ 1 ∶ 10 混合， 在室温条件下以 60 ～ 120 转 / 分的速度搅拌 10 分钟， 随后静置 6 ～ 12 小时， 弃去上清液 得到下层固体。
步骤 3.3 ： 将步骤 3.2 所得的固体与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 在 25℃～ 35℃温度条件下以 60 ～ 120 转 / 分的速度搅拌溶解， 静置 1 ～ 3 小时， 过 滤得到滤液和不溶物。
步骤 3.4 ： 将步骤 3.3 所得的不溶物与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 在 25℃～ 35℃温度条件下以 60 ～ 120 转 / 分的速度搅拌溶解， 静置 1 ～ 3 小时， 过 滤得到滤液和不溶物， 重复该步骤 1 ～ 3 次。
步骤 3.5 ： 合并步骤 3.3 和 3.4 所得的滤液。
步骤 3.6 ： 将步骤 3.5 所得的滤液加热， 在 35℃～ 45℃温度条件下减压浓缩， 回收 乙酸乙酯 (A.R.)， 得到固体浓缩物。
步骤 4 ： 过柱
步骤 4.1 ： 将步骤 3 所得的固体浓缩物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合溶解， 得到溶液。
步骤 4.2 ： 将步骤 4.1 所得的溶液缓慢加到树脂柱中， 观察树脂的颜色， 在树脂柱
有 2/3 变色时， 停止加样， 并采用 200ml ～ 400ml 的 95％乙醇 (A.R.) 冲洗该树脂柱， 收集所 有流出液， 所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化钠饱和至 pH 值中性。
所述树脂柱采用 7 号树脂柱， 柱径比 1 ∶ 12。
步骤 4.3 ： 将步骤 4.2 所得流出液加热， 并在 55℃～ 65℃温度条件下减压回流， 直 至溶剂干， 得到固体残留物。
步骤 5 ： 重结晶
步骤 5.1 ： 将上述残留物与 30℃的～ 40℃的极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 得到初级溶液， 加热， 在 30℃的～ 40℃温度条件下减压浓缩， 在 -5℃～ -8℃温度条件 下静置析晶， 过滤得到黄色针状结晶。
所述极性溶剂为按照体积比 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 2 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的 混合溶液。
步骤 5.2 ： 将步骤 5.1 所得的结晶与极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 在 -5℃～ -8℃温度条件下反复重结晶 2 ～ 4 次， 得到蓝萼乙素 (GLB)。
所述极性溶剂为按照体积比 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 4 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的 混合溶液。
步骤 6 ： 分离提纯
步骤 6.1 ： 将步骤 5 所得的浓缩物加入 20ml 乙酸乙酯 (A.R.) 溶解， 加入 200-300 目硅胶， 混合均匀， 室温挥发干燥， 除去溶剂乙酸乙酯 (A.R.)。
所述硅胶的加入量为所述浓缩物重量的 3 倍。
步骤 6.2 ： 湿法填装一根层析硅胶柱， 所述硅胶用量为步骤 5 所得的浓缩物重量的 20 倍， 柱子径高比为 1 ∶ 12， 并采用 2BV 氯仿 (A.R.) 反复冲洗硅胶柱。
步骤 6.3 ： 将步骤 6.1 所得的混有硅胶的浓缩物加入到步骤 6.2 所得的硅胶柱中， 采用 2BV 氯仿 (A.R.) 冲洗且流速为 1.5BV/ 小时。
步骤 6.4 ： 采用 3BV 氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液冲洗所述硅胶柱， 并采 用 TLC 薄层分析方法检验目标馏分蓝萼乙素 (GLB)， 在检验到相应馏分的时候， 收集含有蓝 萼乙素 (GLB) 主成分的馏分。
所 述 的 3BV 的 氯 仿 (A.R.) 和 丙 酮 (A.R.) 的 混 合 溶 液 中， 氯 仿 (A.R.) 和 丙 酮 (A.R.) 的体积比为 20 ∶ 1。
步骤 6.5 ： 将步骤 6.4 所得的馏分合并， 在 30℃～ 40℃温度条件下减压浓缩， 回收 溶剂， 将所得的浓缩物用氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液重结晶， 等白色针状晶体蓝 萼乙素 (GLB)。
所 述 氯 仿 (A.R.) 和 丙 酮 (A.R.) 的 混 合 溶 液 的 用 量 与 所 述 馏 分 的 体 积 比 为 8 ∶ 1 ～ 12 ∶ 1。
所述的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液中， 氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的 体积比为 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 4。
步骤 7 ： 合成
步骤 7.1 ： 将步骤 6 所得的蓝萼乙素 (GLB) 和多肽 (cNGQGEQc) 按照每 8 ～ 17g 蓝 萼乙素 (GLB)、 0.7 ～ 2.3g 多肽 (cNGQGEQc) 和 80 ～ 150ml 无水极性溶剂的比例混合得到 混合液， 所述无水极性溶剂为甲醇 (A.R.)、 乙醇 (A.R.)、 二氯甲烷 (A.R.) 中的一种。步骤 7.2 ： 将步骤 7.1 所得的混合溶液加热， 在 60℃～ 80℃温度条件下搅拌冷凝 回流 6 ～ 10 小时， 趁热抽滤， 室温下静置， 析出晶体， 过滤， 分离出晶体， 得到蓝萼乙素 (GLB) 衍生物。
步骤 8 ： 合成
步骤 8.1 ： 将步骤 6 所得的蓝萼乙素 (GLB) 按照每 8 ～ 17g 蓝萼乙素 (GLB)， 每 70 ～ 130ml 乙醇 (A.R.) 溶液的比例混合， 将蓝萼乙素 (GLB) 溶解在乙醇 (A.R.) 溶液中， 在室温 下向其中滴加 1mol/L 的氢氧化钠溶液， 调节 PH ＝ 13， 持续搅拌 5 分钟， 再减压浓缩， 除去乙 醇 (A.R.) 溶液， 得到浓缩物。
步骤 8.2 ： 将步骤 8.1 所得的浓缩物加入乙酸乙酯 (A.R.)， 在室温下进行萃取， 得 到乙酸乙酯萃取层， 共萃取 2 次， 得到萃取物。
每次萃取中所述乙酸乙酯 (A.R.) 的使用量为步骤 8.1 中氢氧化钠溶液的使用量 的 2 倍量 ( 体积比 )。
步 骤 8.3 ： 将 步 骤 8.2 所 得 的 萃 取 物 与 30 ℃ ～ 40 ℃ 的 极 性 溶 剂 按 照 体 积 比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 得到初级溶液。
将得到的初级溶液加热， 在 30℃～ 40℃温度条件下减压浓缩， 在 -5℃～ -8℃温度 条件下静置析晶， 过滤得到结晶。
所述极性溶剂混合为按照体积比 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 2 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液。
步骤 8.4 ： 将步骤 8.3 所得的结晶与极性溶剂混合， 反复重结晶 2 ～ 4 次， 得到晶 体。
所述极性溶剂混合为按照体积比 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 2 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液。
步骤 8.5 ： 将步骤 8.4 所得的晶体按照每 8 ～ 17g 所得晶体、 0.7 ～ 2.3g 多肽 (cNGQGEQc) 和 80 ～ 150ml 无水极性溶剂的比例混合， 得到混合溶液。
所述无水极性溶剂为甲醇、 乙醇、 二氯甲烷中的一种。
步骤 8.6 ： 将步骤 8.5 所得混合溶液加热， 在 60℃～ 80℃温度条件下搅拌冷凝回 流 6 ～ 10 小时， 趁热抽滤， 室温下静置析晶， 过滤， 分离出晶体， 得到蓝萼乙素 (GLB) 衍生 物。
经高效液相色谱、 LC-MS、 NMR 分析确认所得晶体为含有多肽 cNGQGEQc 的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物。
实施例二蓝萼乙素 (GLB) 衍生物的制备 ：
采用以下技术参数改进实施例一的制备方法 ：
所述步骤 2.1 中， 是将所述粉碎物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 6.5 混合， 加热， 在 82℃温度条件下回流 1.8 小时， 再提取过滤。
所述步骤 2.2 中， 是将所述剩余物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 9.5 混合， 加热， 在 88℃温度条件下回流 1.2 小时， 再提取过滤， 重复该步骤 1 次。
所述步骤 3.1 中， 是将所述提取液加热， 在 57℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤 3.2 中， 是将所述初级浓缩物与水按照体积比 1 ∶ 8.5 混合， 在室温条件 下搅拌并随后静置 11 小时才分离上清液和固体。所述步骤 3.3 中， 是将所述固体与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5.5 混合， 在 27℃温度条件下搅拌溶解， 静置 1.5 小时再过滤。
所述步骤 3.4 中， 是将所述不溶物与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4.5 混合， 在 33℃温度条件下搅拌溶解， 静置 2.5 小时再过滤， 重复该步骤 3 次。
所述步骤 3.6 中， 是将所述滤液加热， 在 37℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤 4.1 中， 是将所述固体浓缩物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4.5 混 合溶解。
所述步骤 4.2 中， 采用的树脂柱为填充物为强碱性阴离子树脂、 并用氢氧化钠饱 和至 pH 值中性的树脂柱。
所述步骤 4.2 中， 当所述树脂柱有 2/3 变色时， 停止加样， 并采用 240ml 的 95％乙 醇 (A.R.) 冲洗所述树脂柱。
所述步骤 4.3 中， 是将所述流出液加热， 并在 57℃温度条件下减压回流。
所述步骤 5.1 和 5.2 中， 所述极性溶剂混合为按照体积比 1 ∶ 1.2 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液。
所述步骤 5.1 中， 是将所述残留物与 31℃的极性溶剂按照体积比 1 ∶ 5.5 混合。 所述步骤 5.1 中， 是将所述初级溶液加热， 在 31℃温度条件下减压浓缩， 在 -7℃温 度条件下静置析晶。
所述步骤 5.2 中， 是将所述结晶与极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4.5 混合， 在 -6℃温度 条件下反复重结晶 4 次。
所述步骤 6.5 中， 是在 32 ℃温度条件下减压浓缩， 减压浓缩过程中所述氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液的用量与所述馏分的体积比为 11.5 ∶ 1。
所述步骤 6.5 中， 所述的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液中， 氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的体积比为 1 ∶ 2。
所述步骤 7.1 中， 是按照每 10g 蓝萼乙素 (GLB)、 0.9g 多肽 (cNGQGEQc) 和 90ml 无 水极性溶剂的比例混合。
所述步骤 7.1 中， 所述无水极性溶剂为甲醇 (A.R.)。
所述步骤 7.2 中， 是将所述混合溶液加热， 在 64℃温度条件下搅拌冷凝回流 9.5 小 时， 趁热抽滤， 室温下静置析晶。
所述步骤 8.1 中， 是将步骤 6 所得的蓝萼乙素 (GLB) 按照每 10g 蓝萼乙素 (GLB)， 每 80ml 乙醇 (A.R.) 溶液的比例混合。
所述步骤 8.3 中， 是将步骤 8.2 所得的萃取物与 32 ℃的极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4.5 混合， 得到初级溶液。
将得到的初级溶液加热， 在 32℃温度条件下减压浓缩， 在 -5.5℃温度条件下静置 析晶， 过滤得到结晶。
所述极性溶剂混合为按照体积比 1 ∶ 1.2 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混 合溶液。
所述步骤 8.4 中， 所述极性溶剂混合为按照体积比 1 ∶ 1.2 混合的氯仿 (A.R.) 和 丙酮 (A.R.) 的混合溶液。
所 述 步 骤 8.5 中， 是 将 步 骤 8.4 所 得 的 晶 体 按 照 每 10g 所 得 晶 体、 0.9g 多 肽
(cNGQGEQc) 和 90ml 无水极性溶剂的比例混合。
所述步骤 8.6 中， 是将步骤 8.5 所得混合溶液加热， 在 64℃温度条件下搅拌冷凝回 流 9.5 小时。
经高效液相色谱、 LC-MS、 NMR 分析确认所得晶体为含有多肽 cNGQGEQc 的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物。
实施例三蓝萼乙素 (GLB) 衍生物的制备 ：
采用以下技术参数改进实施例一的制备方法 ：
所述步骤 2.1 中， 是将所述粉碎物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 7.5 混合， 加热， 在 84℃温度条件下回流 1.6 小时， 再提取过滤。
所述步骤 2.2 中， 是将所述剩余物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 8.5 混合， 加热， 在 86℃温度条件下回流 1.4 小时， 再提取过滤， 重复该步骤 1 次。
所述步骤 3.1 中， 是将所述提取液加热， 在 59℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤 3.2 中， 是将所述初级浓缩物与水按照体积比 1 ∶ 8.5 混合， 在室温条件 下搅拌并随后静置 10 小时才分离上清液和固体。
所述步骤 3.3 中， 是将所述固体与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5.5 混合， 在 29℃温度条件下搅拌溶解， 静置 1.5 小时再过滤。 所述步骤 3.4 中， 是将所述不溶物与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4.5 混合， 在 31℃温度条件下搅拌溶解， 静置 2.5 小时再过滤， 重复该步骤 3 次。
所述步骤 3.6 中， 是将所述滤液加热， 在 39℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤 4.1 中， 是将所述固体浓缩物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4.5 混 合溶解。
所述步骤 4.2 中， 采用的树脂柱为填充物为强碱性阴离子树脂、 并用氢氧化钠饱 和至 pH 值中性的树脂柱。
所述步骤 4.2 中， 当所述树脂柱有 2/3 变色时， 停止加样， 并采用 280ml 的 95％乙 醇 (A.R.) 冲洗所述树脂柱。
所述步骤 4.3 中， 是将所述流出液加热， 并在 59℃温度条件下减压回流。
所述步骤 5.1 和 5.2 中， 所述极性溶剂混合为按照体积比 1 ∶ 1.4 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液。
所述步骤 5.1 中， 是将所述残留物与 33℃的极性溶剂按照体积比 1 ∶ 5.5 混合。
所述步骤 5.1 中， 是将所述初级溶液加热， 在 33℃温度条件下减压浓缩， 在 -7℃温 度条件下静置析晶。
所述步骤 5.2 中， 是将所述结晶与极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4.5 混合， 在 -7℃温度 条件下反复重结晶 4 次。
所述步骤 6.5 中， 是在 34 ℃温度条件下减压浓缩， 减压浓缩过程中所述氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液的用量与所述馏分的体积比为 10.5 ∶ 1。
所述步骤 6.5 中， 所述的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液中， 氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的体积比为 1 ∶ 2。
所述步骤 7.1 中， 是按照每 12g 蓝萼乙素 (GLB)、 1.3g 多肽 (cNGQGEQc) 和 105ml 无水极性溶剂的比例混合。
所述步骤 7.1 中， 所述无水极性溶剂为乙醇 (A.R.)。
所述步骤 7.2 中， 是将所述混合溶液加热， 在 68℃温度条件下搅拌冷凝回流 8.5 小 时， 趁热抽滤， 室温下静置析晶。
所述步骤 8.1 中， 是将步骤 6 所得的蓝萼乙素 (GLB) 按照每 12g 蓝萼乙素 (GLB)， 每 90ml 乙醇 (A.R.) 溶液的比例混合。
所述步骤 8.3 中， 是将步骤 8.2 所得的萃取物与 34 ℃的极性溶剂按照体积比 1 ∶ 5.5 混合， 得到初级溶液。
将得到的初级溶液加热， 在 34℃温度条件下减压浓缩， 在 -6℃温度条件下静置析 晶， 过滤得到结晶。
所述极性溶剂混合为按照体积比 1 ∶ 1.4 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混 合溶液。
所述步骤 8.4 中， 所述极性溶剂混合为按照体积比 1 ∶ 1.4 混合的氯仿 (A.R.) 和 丙酮 (A.R.) 的混合溶液。
所 述 步 骤 8.5 中， 是 将 步 骤 8.4 所 得 的 晶 体 按 照 每 12g 所 得 晶 体、 1.3g 多 肽 (cNGQGEQc) 和 105ml 无水极性溶剂的比例混合。
所述步骤 8.6 中， 是将步骤 8.5 所得混合溶液加热， 在 68℃温度条件下搅拌冷凝回 流 8.5 小时。
经高效液相色谱、 LC-MS、 NMR 分析确认所得晶体为含有多肽 cNGQGEQc 的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物。
实施例四蓝萼乙素 (GLB) 衍生物的制备 ：
采用以下技术参数改进实施例一的制备方法 ：
所述步骤 2.1 中， 是将所述粉碎物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 8.5 混合， 加热， 在 86℃温度条件下回流 1.4 小时， 再提取过滤。
所述步骤 2.2 中， 是将所述剩余物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 7.5 混合， 加热， 在 84℃温度条件下回流 1.6 小时， 再提取过滤， 重复该步骤 3 次。
所述步骤 3.1 中， 是将所述提取液加热， 在 61℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤 3.2 中， 是将所述初级浓缩物与水按照体积比 1 ∶ 9.5 混合， 在室温条件 下搅拌并随后静置 8 小时才分离上清液和固体。
所述步骤 3.3 中， 是将所述固体与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4.5 混合， 在 31℃温度条件下搅拌溶解， 静置 2.5 小时再过滤。
所述步骤 3.4 中， 是将所述不溶物与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5.5 混合， 在 29℃温度条件下搅拌溶解， 静置 1.5 小时再过滤， 重复该步骤 1 次。
所述步骤 3.6 中， 是将所述滤液加热， 在 41℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤 4.1 中， 是将所述固体浓缩物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5.5 混 合溶解。
所述步骤 4.2 中， 采用的树脂柱为填充物为强碱性阴离子树脂、 并用氢氧化钠饱 和至 pH 值中性的树脂柱。
所述步骤 4.2 中， 当所述树脂柱有 2/3 变色时， 停止加样， 并采用 320ml 的 95％乙 醇 (A.R.) 冲洗所述树脂柱。所述步骤 4.3 中， 是将所述流出液加热， 并在 61℃温度条件下减压回流。
所述步骤 5.1 和 5.2 中， 所述极性溶剂混合为按照体积比 1 ∶ 1.6 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液。
所述步骤 5.1 中， 是将所述残留物与 37℃的极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4.5 混合。
所述步骤 5.1 中， 是将所述初级溶液加热， 在 37℃温度条件下减压浓缩， 在 -6℃温 度条件下静置析晶。
所述步骤 5.2 中， 是将所述结晶与极性溶剂按照体积比 1 ∶ 5.5 混合， 在 -6℃温度 条件下反复重结晶 2 次。
所述步骤 6.5 中， 是在 36 ℃温度条件下减压浓缩， 减压浓缩过程中所述氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液的用量与所述馏分的体积比为 9.5 ∶ 1。
所述步骤 6.5 中， 所述的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液中， 氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的体积比为 1 ∶ 3。
所述步骤 7.1 中， 是按照每 14g 蓝萼乙素 (GLB)、 1.7g 多肽 (cNGQGEQc) 和 125ml 无水极性溶剂的比例混合。
所述步骤 7.1 中， 所述无水极性溶剂为乙醇 (A.R.)。
所述步骤 7.2 中， 是将所述混合溶液加热， 在 72℃温度条件下搅拌冷凝回流 7.5 小 时， 趁热抽滤， 室温下静置析晶。
所述步骤 8.1 中， 是将步骤 6 所得的蓝萼乙素 (GLB) 按照每 14g 蓝萼乙素 (GLB)， 每 110ml 乙醇 (A.R.) 溶液的比例混合。
所述步骤 8.3 中， 是将步骤 8.2 所得的萃取物与 36 ℃的极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4.5 混合， 得到初级溶液。
将得到的初级溶液加热， 在 36℃温度条件下减压浓缩， 在 -7℃温度条件下静置析 晶， 过滤得到结晶。
所述极性溶剂混合为按照体积比 1 ∶ 1.6 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混 合溶液。
所述步骤 8.4 中， 所述极性溶剂混合为按照体积比 1 ∶ 1.6 混合的氯仿 (A.R.) 和 丙酮 (A.R.) 的混合溶液。
所 述 步 骤 8.5 中， 是 将 步 骤 8.4 所 得 的 晶 体 按 照 每 14g 所 得 晶 体、 1.7g 多 肽 (cNGQGEQc) 和 125ml 无水极性溶剂的比例混合。
所述步骤 8.6 中， 是将步骤 8.5 所得混合溶液加热， 在 72℃温度条件下搅拌冷凝回 流 7.5 小时。
经高效液相色谱、 LC-MS、 NMR 分析确认所得晶体为含有多肽 cNGQGEQc 的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物。
实施例五蓝萼乙素 (GLB) 衍生物的制备 ：
采用以下技术参数改进实施例一的制备方法 ：
所述步骤 2.1 中， 是将所述粉碎物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 9.5 混合， 加热， 在 88℃温度条件下回流 1.2 小时， 再提取过滤。
所述步骤 2.2 中， 是将所述剩余物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 6.5 混合， 加热， 在 82℃温度条件下回流 1.8 小时， 再提取过滤， 重复该步骤 3 次。所述步骤 3.1 中， 是将所述提取液加热， 在 63℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤 3.2 中， 是将所述初级浓缩物与水按照体积比 1 ∶ 9.5 混合， 在室温条件 下搅拌并随后静置 7 小时才分离上清液和固体。
所述步骤 3.3 中， 是将所述固体与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4.5 混合， 在 33℃温度条件下搅拌溶解， 静置 2.5 小时再过滤。
所述步骤 3.4 中， 是将所述不溶物与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5.5 混合， 在 27℃温度条件下搅拌溶解， 静置 1.5 小时再过滤， 重复该步骤 1 次。
所述步骤 3.6 中， 是将所述滤液加热， 在 43℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤 4.1 中， 是将所述固体浓缩物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5.5 混 合溶解。
所述步骤 4.2 中， 采用的树脂柱为填充物为强碱性阴离子树脂、 并用氢氧化钠饱 和至 pH 值中性的树脂柱。
所述步骤 4.2 中， 当所述树脂柱有 2/3 变色时， 停止加样， 并采用 360ml 的 95％乙 醇 (A.R.) 冲洗所述树脂柱。
所述步骤 4.3 中， 是将所述流出液加热， 并在 63℃温度条件下减压回流。
所述步骤 5.1 和 5.2 中， 所述极性溶剂混合为按照体积比 1 ∶ 1.8 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液。
所述步骤 5.1 中， 是将所述残留物与 39℃的极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4.5 混合。
所述步骤 5.1 中， 是将所述初级溶液加热， 在 39℃温度条件下减压浓缩， 在 -6℃温 度条件下静置析晶。
所述步骤 5.2 中， 是将所述结晶与极性溶剂按照体积比 1 ∶ 5.5 混合， 在 -7℃温度 条件下反复重结晶 2 次。
所述步骤 6.5 中， 是在 38 ℃温度条件下减压浓缩， 减压浓缩过程中所述氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液的用量与所述馏分的体积比为 8.5 ∶ 1。
所述步骤 6.5 中， 所述的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液中， 氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的体积比为 1 ∶ 3。
所述步骤 7.1 中， 是按照每 16g 蓝萼乙素 (GLB)、 2.1g 多肽 (cNGQGEQc) 和 140ml 无水极性溶剂的比例混合。
所述步骤 7.1 中， 所述无水极性溶剂为甲醇 (A.R.)。
所述步骤 7.2 中， 是将所述混合溶液加热， 在 76℃温度条件下搅拌冷凝回流 6.5 小 时， 趁热抽滤， 室温下静置析晶。
所述步骤 8.1 中， 是将步骤 6 所得的蓝萼乙素 (GLB) 按照每 16g 蓝萼乙素 (GLB)， 每 120ml 乙醇 (A.R.) 溶液的比例混合。
所述步骤 8.3 中， 是将步骤 8.2 所得的萃取物与 38 ℃的极性溶剂按照体积比 1 ∶ 5.5 混合， 得到初级溶液。
将得到的初级溶液加热， 在 38℃温度条件下减压浓缩， 在 -7.5℃温度条件下静置 析晶， 过滤得到结晶。
所述极性溶剂混合为按照体积比 1 ∶ 1.8 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混 合溶液。所述步骤 8.4 中， 所述极性溶剂混合为按照体积比 1 ∶ 1.8 混合的氯仿 (A.R.) 和 丙酮 (A.R.) 的混合溶液。
所 述 步 骤 8.5 中， 是 将 步 骤 8.4 所 得 的 晶 体 按 照 每 16g 所 得 晶 体、 2.1g 多 肽 (cNGQGEQc) 和 140ml 无水极性溶剂的比例混合。
所述步骤 8.6 中， 是将步骤 8.5 所得混合溶液加热， 在 76℃温度条件下搅拌冷凝回 流 6.5 小时。
经高效液相色谱、 LC-MS、 NMR 分析确认所得晶体为含有多肽 cNGQGEQc 的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物。
实施例六蓝萼乙素 (GLB) 衍生物的制备 ( 优选实施例 ) ：
采用以下技术参数改进实施例一的制备方法 ：
所述步骤 2.1 中， 是将所述粉碎物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 8 混合， 加 热， 在 85℃温度条件下回流 1.5 小时， 再提取过滤。
所述步骤 2.2 中， 是将所述剩余物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 8 混合， 加 热， 在 85℃温度条件下回流 1.5 小时， 再提取过滤， 重复该步骤 2 次。
所述步骤 3.1 中， 是将所述提取液加热， 在 60℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤 3.2 中， 是将所述初级浓缩物与水按照体积比 1 ∶ 9 混合， 在室温条件下 搅拌并随后静置 9 小时才分离上清液和固体。
所述步骤 3.3 中， 是将所述固体与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5 混合， 在 30℃ 温度条件下搅拌溶解， 静置 2 小时再过滤。
所述步骤 3.4 中， 是将所述不溶物与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5 混合， 在 30℃温度条件下搅拌溶解， 静置 2 小时再过滤， 重复该步骤 2 次。
所述步骤 3.6 中， 是将所述滤液加热， 在 40℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤 4.1 中， 是将所述固体浓缩物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5 混合 溶解。
所述步骤 4.2 中， 采用的树脂柱为填充物为强碱性阴离子树脂、 并用氢氧化钠饱 和至 pH 值中性的树脂柱。
所述步骤 4.2 中， 当所述树脂柱有 2/3 变色时， 停止加样， 并采用 300ml 的 95％乙 醇 (A.R.) 冲洗所述树脂柱。
所述步骤 4.3 中， 是将所述流出液加热， 并在 60℃温度条件下减压回流。
所述步骤 5.1 和 5.2 中， 所述极性溶剂混合为按照体积比 1 ∶ 1.5 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液。
所述步骤 5.1 中， 是将所述残留物与 35℃的极性溶剂按照体积比 1 ∶ 5 混合。
所述步骤 5.1 中， 是将所述初级溶液加热， 在 35℃温度条件下减压浓缩， 在 -6.5℃ 温度条件下静置析晶。
所述步骤 5.2 中， 是将所述结晶与极性溶剂按照体积比 1 ∶ 5 混合， 在 -6.5℃温度 条件下反复重结晶 3 次。
所述步骤 6.5 中， 是在 35 ℃温度条件下减压浓缩， 减压浓缩过程中所述氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液的用量与所述馏分的体积比为 10 ∶ 1。
所述步骤 6.5 中， 所述的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液中， 氯仿 (A.R.)和丙酮 (A.R.) 的体积比为 1 ∶ 2.5。
所述步骤 7.1 中， 是按照每 13g 蓝萼乙素 (GLB)、 1.5g 多肽 (cNGQGEQc) 和 115ml 无水极性溶剂的比例混合。
所述步骤 7.1 中， 所述无水极性溶剂为二氯甲烷 (A.R.)。
所述步骤 7.2 中， 是将所述混合溶液加热， 在 70℃温度条件下搅拌冷凝回流 8 小 时， 趁热抽滤， 室温下静置析晶。
经高效液相色谱、 LC-MS、 NMR 分析确认所得晶体为含有多肽 cNGQGEQc 的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物。
实施例七蓝萼乙素 (GLB) 衍生物的制备 ( 优选实施例 ) ：
采用以下技术参数改进实施例一的制备方法 ：
所述步骤 2.1 中， 是将所述粉碎物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 8 混合， 加 热， 在 85℃温度条件下回流 1.5 小时， 再提取过滤。
所述步骤 2.2 中， 是将所述剩余物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 8 混合， 加 热， 在 85℃温度条件下回流 1.5 小时， 再提取过滤， 重复该步骤 2 次。
所述步骤 3.1 中， 是将所述提取液加热， 在 60℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤 3.2 中， 是将所述初级浓缩物与水按照体积比 1 ∶ 9 混合， 在室温条件下 搅拌并随后静置 9 小时才分离上清液和固体。
所述步骤 3.3 中， 是将所述固体与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5 混合， 在 30℃ 温度条件下搅拌溶解， 静置 2 小时再过滤。
所述步骤 3.4 中， 是将所述不溶物与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5 混合， 在 30℃温度条件下搅拌溶解， 静置 2 小时再过滤， 重复该步骤 2 次。
所述步骤 3.6 中， 是将所述滤液加热， 在 40℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤 4.1 中， 是将所述固体浓缩物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5 混合 溶解。
所述步骤 4.2 中， 采用的树脂柱为填充物为强碱性阴离子树脂、 并用氢氧化钠饱 和至 pH 值中性的树脂柱。
所述步骤 4.2 中， 当所述树脂柱有 2/3 变色时， 停止加样， 并采用 300ml 的 95％乙 醇 (A.R.) 冲洗所述树脂柱。
所述步骤 4.3 中， 是将所述流出液加热， 并在 60℃温度条件下减压回流。
所述步骤 5.1 和 5.2 中， 所述极性溶剂混合为按照体积比 1 ∶ 1.5 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液。
所述步骤 5.1 中， 是将所述残留物与 35℃的极性溶剂按照体积比 1 ∶ 5 混合。
所述步骤 5.1 中， 是将所述初级溶液加热， 在 35℃温度条件下减压浓缩， 在 -6.5℃ 温度条件下静置析晶。
所述步骤 5.2 中， 是将所述结晶与极性溶剂按照体积比 1 ∶ 5 混合， 在 -6.5℃温度 条件下反复重结晶 3 次。
所述步骤 6.5 中， 是在 35 ℃温度条件下减压浓缩， 减压浓缩过程中所述氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液的用量与所述馏分的体积比为 10 ∶ 1。
所述步骤 6.5 中， 所述的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混合溶液中， 氯仿 (A.R.)和丙酮 (A.R.) 的体积比为 1 ∶ 2.5。
所述步骤 8.1 中， 是将步骤 6 所得的蓝萼乙素 (GLB) 按照每 13g 蓝萼乙素 (GLB)， 每 100ml 乙醇 (A.R.) 溶液的比例混合。
所述步骤 8.3 中， 是将步骤 8.2 所得的萃取物与 35℃的极性溶剂按照体积比 1 ∶ 5 混合， 得到初级溶液。
将得到的初级溶液加热， 在 35℃温度条件下减压浓缩， 在 -6.5℃温度条件下静置 析晶， 过滤得到结晶。
所述极性溶剂混合为按照体积比 1 ∶ 1.5 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的混 合溶液。
所述步骤 8.4 中， 所述极性溶剂混合为按照体积比 1 ∶ 1.5 混合的氯仿 (A.R.) 和 丙酮 (A.R.) 的混合溶液。
所 述 步 骤 8.5 中， 是 将 步 骤 8.4 所 得 的 晶 体 按 照 每 13g 所 得 晶 体、 1.5g 多 肽 (cNGQGEQc) 和 115ml 无水极性溶剂的比例混合。
所述步骤 8.6 中， 是将步骤 8.5 所得混合溶液加热， 在 70℃温度条件下搅拌冷凝回 流 8 小时。 经高效液相色谱、 LC-MS、 NMR 分析确认所得晶体为含有多肽 cNGQGEQc 的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物。
实施例八 ：
采用优选实施例六的制备方法制备的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物， 其分子结构式如 下：
其中， 所述的 -cNGQGEQc 是通过原蓝萼乙素 (GLB) 上的羟基与多肽 cNGQGEQc 的乙 酰化反应从而引入的。
该结构的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物对治疗癌症、 特别是治疗肺癌、 肝癌、 鼻咽癌、 淋 巴瘤、 黑色素瘤和骨髓性白血病具有良好的效果。 其中通过乙酰化反应引入多肽 cNGQGEQc， 来对主体二萜进行结构修饰， 从而使得修饰后的蓝萼乙素 (GLB)， 即蓝萼乙素 (GLB) 衍生物 对肺癌具有靶向作用。
实施例九 ：
采用优选实施例七的制备方法制备的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物， 其分子结构通式如
下：c 或 -OH， R2 为 -cNGQGEQc 或 -OH。其中， 所述的 -cNGQGEQc 是通过原蓝萼乙素 (GLB) 上的羟基与多肽 cNGQGEQc 的乙 酰化反应从而引入的。
其中， 以下三种结构对治疗癌症、 特别是治疗肺癌、 肝癌、 鼻咽癌、 淋巴瘤、 黑色素 瘤和骨髓性白血病具有良好的效果。其中通过乙酰化反应引入多肽 cNGQGEQc， 来对主体二 萜进行结构修饰， 从而使得修饰后的蓝萼乙素 (GLB)， 即蓝萼乙素 (GLB) 衍生物对肺癌具有 靶向作用。
实施例十蓝萼乙素 (GLB) 衍生物制剂的制备 ：
采用药剂学上的常规药物载体， 并采用药剂学上的常规制备方法， 将采用优选实 施例六和 / 或优选实施例七的制备方法制备的、 具有实施例八和 / 或实施例九的分子结构 的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物中的一种或多种， 制备成药剂学上的常规剂型， 包括但不限于片 剂、 胶囊剂、 软胶剂、 喷雾剂、 凝胶剂、 凝胶吸入剂、 口服剂、 混悬剂、 冲剂、 贴剂、 软膏、 丸剂、 散剂、 注射剂、 输液剂、 冻干注射剂、 脂质体注射剂、 靶向给药注射剂、 栓剂、 缓释制剂或控释 制剂。
其中优选制备剂型为冻干注射剂。
实施例十一蓝萼乙素 (GLB) 衍生物的应用 ：
根据实施例一至六中任意制备方法制备所得的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物， 用于癌症 的治疗， 特别是用于治疗肺癌、 肝癌、 鼻咽癌、 淋巴瘤、 黑色素瘤和骨髓性白血病。其中由于 所得的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物， 是通过乙酰化反应引入多肽 cNGQGEQc， 来对主体二萜进行
结构修饰的， 从而使得修饰后的蓝萼乙素 (GLB)， 即蓝萼乙素 (GLB) 衍生物对肺癌具有靶向 作用， 尤其适用是肺癌的治疗。
实施例十二蓝萼乙素 (GLB) 衍生物治疗肺癌的药效学实验 ：
采用根据优选实施例六的制备方法制备的、 具有实施例七的分子结构的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物的混合物 ( 以下简称 GH-02) 进行药效学实验， 考察 GH-02 对肺癌 A549 细胞的 影响。
1. 实验材料
1.1 药品与试剂 ： 四氮唑兰 (MTT)
1.2 仪器 ： 二氧化碳孵化箱， 显微镜， 酶标仪
1.3 动物 ： 无
1.4 瘤株 ： 肺癌 A549 细胞由复旦大学肿瘤医院肿瘤研究所罗建民老师惠赠
2. 实验方法
2.1A549 细胞培养
A549 细胞用含 20％胎牛血清的 DMEM 培养基， 置于 37℃、 5％ CO2 孵化箱中进行培 养。
2.2 细胞传代
取出已长满细胞的 25cm2 培养瓶， 倒去培养液， 先注入胰蛋白酶消化液 1ml， 轻轻摇 晃后弃去。再加入胰蛋白酶消化液 2ml， 将其浸润细胞后， 放入 CO2 孵化箱中消化 2-3min。 注入 5ml 培养液， 用滴管吸取培养瓶中的培养液反复吹打培养瓶基面。取 2 只无菌的培养 瓶， 将含有细胞的培养液均匀份入培养瓶中， 分别加入 10ml 新鲜培养液后培养。
2.3 细胞冻存
先制成含细胞 50 万 /ml 的细胞悬液， 后加 10 ％ DMSO， 装入冻存管中火封， 放置 于 -20℃冰箱内 3h 后取出， 置于 -60℃冰箱内过夜， 取出后装入固定架后投入液氮中保存。
2.4 细胞复苏
取出冻存管后， 迅速投入 37 ℃的温水化冻， 吸出细胞液， 离心 1000rpm， 10min， 弃 上清液， 除去 DMSO， 换入含 20％胎牛血清的培养液， 稀释细胞数为 20-50 万 /ml 分种于培养 瓶中， 置于 CO2 孵化箱中培养。
3. 实验结果
表 1GH-02 对 A549 细胞的影响 (X±S， n ＝ 4)
＊ 注： 表示与空白对照组比较， P ＜ 0.05。＊＊表示与空白对照组比较， P ＜ 0.01。 △表示与阳性对照 ( 阿霉素 ) 比较， P ＜ 0.01。▲表示与 PV 助溶剂比较， P ＜ 0.05。▲▲
表示与 PVP 助溶剂比较， P ＜ 0.01。
4. 结论 ：
GH-02 小剂量有一定的抑瘤作用， 而高剂量组则有明显的抗肿瘤作用， 与模型组相 比差异有显著性， 而与阳性对照组相比则差异无显著性。 GH-02 抗肿瘤作用虽然稍逊于阳性 对照阿霉素， 但仍显示出较强的抗肿瘤作用。
实施例十三蓝萼乙素 (GLB) 衍生物对小鼠 Lewis 肺癌影响的动物模型试验 ：
采用根据优选实施例六的制备方法制备的、 具有实施例七的分子结构的蓝萼乙素 (GLB) 衍生物的混合物 ( 以下简称 GH-02) 进行动物模型试验， 考察 GH-02 对小鼠 Lewis 肺 癌的影响。
1. 实验材料，
1.1 药品与试剂 ： GH-02( 质量分数 99.8％ )， 试验时用生理盐水稀释。
1.2 仪器 ： 显微镜， 酶标仪
1.3 动物 ： C57 纯系小鼠 64 只， 体重为 (20 士 2)9， 雌雄兼用， 由上海中医药大学实 验动物中心提供。实验室温度为 22 一 25℃， 常规饲料喂养， 饮水量不限。
1.4 瘤株 ： Lewis 肺癌实体型由复旦大学肿瘤医院肿瘤研究所罗建民老师惠赠
2. 实验方法
模型组 ( 生理盐水 10mL/kg)， 阳性对照组 ( 环磷酰胺 25mg/ml)， GH-02(25mg/ml) 分为腹腔注射组、 静脉注射组， 每组 8 只动物。实验按常规方法接种， 接种后次日按拟定剂 量 ip 给药， 每天 1 次， 连续 10d。腹水性肿瘤以生命延长率为疗效指标， 停药后继续观察 60d， 死亡动物以实际存活时间计算。实体型肿瘤以瘤质量抑制率作为疗效指标， 于停药次 日将肿瘤剖出精确称质量。实验结果用抑瘤率 x±s 表示， 组间比较用 t 检验。
3. 实验结果 ：
实验结果详见表 2GH-02 对小鼠 Lewis 肺癌的影响。
4. 结论 ：
GH-02 有明显的抑瘤作用和抗肿瘤作用， 与模型组相比差异有显著性， 而与阳性对 照组相比则差异无显著性。 GH-02 抗肿瘤作用强于阳性对照， 显示出较强的抗肿瘤作用。 腹 腔注射和静脉注射都有明显的抑瘤作用和抗肿瘤作用。
上述内容为本发明的具体实施例的例举， 对于其中未详尽描述的试剂、 设备、 操作 方法等， 应当理解为采取本领域已有的普通及常规试剂、 设备、 操作方法等来予以实施。
同时本发明上述实施例仅为说明本发明技术方案之用， 仅为本发明技术方案的列 举， 并不用于限制本发明的技术方案及其保护范围。 采用等同技术手段、 等同试剂等对本发 明权利要求书及说明书所公开的技术方案的改进应当认为是没有超出本发明权利要求书 及说明书所公开的范围。