一种制备注射用重组人血管内皮抑制素壳聚糖纳米粒的方 法 技术领域 本发明涉及一种注射用重组人血管内皮抑制素壳聚糖纳米粒的制备方法。
发明背景
重组人血管内皮抑制素与重组鼠血管内皮抑制素在氨基酸序列上有 85％的同源 性。 利用传统的大肠杆菌表达方法得到的重组人血管内皮抑制素难以复性并且易于形成沉 淀， 而用巴斯德毕赤酵母表达系统所耗费的生产成本巨大， 两种方法均未能解决将重组人 血管内皮抑制素进行工业生产的问题。山东先声麦得津生物制药有限公司 ( 先声药业控股 子公司 ) 通过修饰人血管内皮抑制素的核苷酸编码序列， 生产出 N 末端带有附加氨基酸序 列的注射用重组人血管内皮抑制素 ( 恩度， Endostar)， 大大简化了纯化步骤， 提高了产物 的纯度。所生产的重组人血管内皮抑制素由 192 个氨基酸构成， 其氨基酸序列为 ：
(M)GGSHHHHHHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLY SIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARlFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYC ETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK， 其中当由大肠杆菌表达时其 N 末 端的 Met 有时会被部分删除。
注射用重组人血管内皮抑制素保持内源性 endostatin 的所有生物活性， 同时解 决了 endostatin 在生产过程中的难题， 表达水平更高， 疗效更强， 并且没有因为附加 N 端 序列而导致体内免疫原性。但是作为外源性蛋白， 注射用重组人血管内皮抑制素在体内 很容易被免疫系统识别， 进而被降解， 因此体内半衰期很短， 患者需要频繁注射， 临床顺 应性很差。近期有研究发现动物体内小剂量持续给予 endostatin 的药效要优于间歇性 给 药 Minoru Kuroiwa， et al.J.Pediatr.Surg.38 ： 1499-1505， 2003 ； Oliver Kisker， et al.Cancer Res， 61 ： 7669-7674， 2001)。因此， 将其开发成注射一次可持续释药多日的长效 制剂非常必要。
近年来， 随着新型药物给药系统的发展， 可生物降解的聚合物纳米粒子， 特别是壳 聚糖纳米粒因具有无毒、 来源丰富、 具有良好生物相容性及生物可降解性、 可以达到靶向、 缓释、 增加药物吸收等作用， 成为包埋蛋白质一类生物活性大分子药物的理想载体。
发明内容
本发明的目的是提供一种大分子复合法制备注射用重组人血管内皮抑制素壳聚 糖纳米粒的方法， 即将荷电相反的阴离子聚合物同富含氨基阳离子的壳聚糖在溶液中进行 复合， 借两种聚离子之间的相互作用在一定条件下形成壳聚糖纳米粒。该方法可以避免使 同时获得粒径较小、 分布均匀、 载药量高的纳米粒。 用有机溶剂，
本发明的注射用重组人血管内皮抑制素壳聚糖纳米粒溶液的制备包括下列步 骤：
(1) 将壳聚糖加入醋酸溶液中， 搅拌至完全溶解 ；
(2) 配制阴离子大分子物质水溶液 ；(3) 将含有重组人血管内皮抑制素的缓冲液加入步骤 (1) 配制的壳聚糖醋酸溶液 中， 不断搅拌的条件下滴入步骤 (2) 配制的阴离子大分子物质水溶液， 使成乳光的透明乳 液；
(4) 将上述所得乳液离心， 滤除上清液， 即得重组人血管内皮抑制素壳聚糖纳米粒 溶液。
本发明中所述壳聚糖分子量范围在 10000 ～ 500000 道尔顿， 优选为 50000 ～ 200000 道尔顿。
本发明中醋酸溶液浓度为 0.5 ～ 2.0mg/mL， 优选为 1mg/mL， 壳聚糖醋酸溶液中壳 聚糖浓度为 1.0 ～ 5.0mg/mL.
本发明中阴离子大分子物质为 DNA、 羧甲基纤维素钠、 蛋白质、 丙烯酸树脂中一种， 优选羧甲基纤维素钠 ； 配制的阴离子大分子物质水溶液浓度为 0.5 ～ 5.0mg/mL。
本发明中重组人血管内皮抑制素溶解在缓冲液中， 其中缓冲液可以是醋酸盐缓冲 液、 磷酸盐缓冲液、 Tris 缓冲液、 甘氨酸 - 盐酸缓冲液中的一种， 优选醋酸盐缓冲液。由于 重组人血管内皮抑制素只在一定 pH 值下稳定， 缓冲液的 pH 值在 2 ～ 9 之间， 优选 4 ～ 7 之 间。 本发明中纳米粒的形成与壳聚糖及阴离子大分子物质的加入比例有关， 壳聚糖与 阴离子大分子物质的质量比为 2 ∶ 5 ～ 5 ∶ 2。
本发明中在搅拌过程中壳聚糖与阴离子大分子物质发生复合而形成纳米粒， 搅拌 可以采用磁力搅拌、 螺旋桨搅拌， 搅拌转速在 100 ～ 600 转 / 分， 搅拌时间在 1 ～ 30 分钟。
本发明中为了分离游离药物与纳米粒， 采用了离心的方法， 离心采用冷冻离心或 超滤离心。冷冻离心的离心转数 6000 ～ 16000 转 / 分钟， 离心时间在 10 ～ 60 分钟， 温度 控制为 0 ～ 10 摄氏度。超滤离心采用 50000 ～ 100000 道尔顿的超滤膜， 离心转数 3000 ～ 5000 转 / 分钟， 离心时间在 5 ～ 30 分钟， 温度控制为 0 ～ 10 摄氏度。
本发明中重组人血管内皮抑制素壳聚糖纳米粒中重组人血管内皮抑制素质量百 分数即载药量在 1％ wt ～ 50％ wt， 纳米粒平均粒径在 80nm ～ 300nm 之间。
本发明中所述的重组人血管内皮抑制素为重组人血管内皮抑制素 Endostar。
本发明的注射用重组人血管内皮抑制素壳聚糖纳米粒粉术的制备包括下列步 骤：
(1) 将壳聚糖加入醋酸溶液中， 搅拌至完全溶解 ；
(2) 配制阴离子大分子物质水溶液 ；
(3) 将含有重组人血管内皮抑制素的缓冲液加入步骤 (1) 配制的壳聚糖醋酸溶液 中， 不断搅拌的条件下滴入步骤 (2) 配制的阴离子大分子物质水溶液， 使成乳光的透明乳 液；
(4) 将上述所得乳液离心， 滤除上清液， 得到浓缩液。
(5) 将上述浓缩液加入冻干保护剂， 冷冻干燥， 即得重组人血管内皮抑制素壳聚糖 纳米粒粉末。
本发明中所述壳聚糖分子量范围在 10000 ～ 500000 道尔顿， 优选为 50000 ～ 200000 道尔顿。
本发明中醋酸溶液浓度为 0.5 ～ 2.0mg/mL， 优选为 1mg/mL， 壳聚糖醋酸溶液中壳
聚糖浓度为 1.0 ～ 5.0mg/mL.
本发明中阴离子大分子物质为 DNA、 羧甲基纤维素钠、 蛋白质、 丙烯酸树脂中一种， 优选羧甲基纤维素钠 ； 配制的阴离子大分子物质水溶液浓度为 0.5 ～ 5.0mg/mL。
本发明中重组人血管内皮抑制素溶解在缓冲液中， 其中缓冲液可以是醋酸盐缓冲 液、 磷酸盐缓冲液、 Tris 缓冲液、 甘氨酸 - 盐酸缓冲液中的一种， 优选醋酸盐缓冲液。由于 重组人血管内皮抑制素只在一定 pH 值下稳定， 缓冲液的 pH 值在 2 ～ 9 之间， 优选 4 ～ 7 之 间。
本发明中纳米粒的形成与壳聚糖及阴离子大分子物质的加入比例有关， 壳聚糖与 阴离子大分子物质的质量比为 2 ∶ 5 ～ 5 ∶ 2。
本发明中在搅拌过程中壳聚糖与阴离子大分子物质发生复合而形成纳米粒， 搅拌 可以采用磁力搅拌、 螺旋桨搅拌， 搅拌转速在 100 ～ 600 转 / 分， 搅拌时间在 1 ～ 30 分钟。
本发明中为了分离游离药物与纳米粒， 采用了离心的方法， 离心采用冷冻离心或 超滤离心。冷冻离心的离心转数 6000 ～ 16000 转 / 分钟， 离心时间在 10 ～ 60 分钟， 温度 控制为 0 ～ 10 摄氏度。超滤离心采用 50000 ～ 100000 道尔顿的超滤膜， 离心转数 3000 ～ 5000 转 / 分钟， 离心时间在 5 ～ 30 分钟， 温度控制为 0 ～ 10 摄氏度。
本发明中为获得纳米粒粉末需进行干燥处理， 干燥步骤采用冷冻干燥， 采用的冻 干保护剂包括甘露醇、 乳糖、 海藻糖、 葡萄糖、 蔗糖中的一种或几种， 优选海藻糖， 冻干保护 剂与重组人血管内皮抑制素壳聚糖纳米粒的质量比为 0.1 ∶ 1 ～ 10 ∶ 1。
本发明中重组人血管内皮抑制素壳聚糖纳米粒中重组人血管内皮抑制素质量百 分数即载药量在 1％ wt ～ 50％ wt， 复溶后纳米粒平均粒径在 100nm ～ 400nm 之间。
本发明中所述的重组人血管内皮抑制素为重组人血管内皮抑制素 Endostar。
本发明的优点有 ：
1、 载体材料壳聚糖具有良好的生物相容性、 生物可降解性， 无毒， 来源经济 ；
2、 制备方法中不使用有机溶剂， 可以避免影响蛋白活性， 同时方法操作简单 ；
3、 纳米粒粒径范围可控， 分布均匀， 载药量高。 附图说明
图 1 实施例一中纳米粒粒径分布图。 图 2 实施例二中纳米粒粒径分布图。 图 3 实施例三中纳米粒形态分布图。 图 4 实施例四中纳米粒释放曲线。具体实施方式
本发明通过以下实施例作更详细的描述， 但不能将其解释为限制本发明的保护范 围。
实施例一
称取分子量为 100000 道尔顿的壳聚糖 250mg， 溶于 100mL 1％的醋酸溶液中， 得到 2.5mg/mL 的壳聚糖溶液。 以蒸馏水配制 2.5mg/mL 的羧甲基纤维素钠溶液 40mL。 取含 200mg Endostar 醋酸盐缓冲液 (pH5.5) 加入壳聚糖溶液中， 磁力搅拌下缓慢滴加羧甲基纤维素钠溶液， 反应 10 分钟， 即得重组人血管内皮抑制素纳米粒溶液。用 nano-ZS90 马尔文粒径仪 测定纳米粒粒径。所测得平均粒径为 279nm， 粒径分布见图 1。
实施例二
称取分子量为 50000 道尔顿的壳聚糖 100mg， 溶于 50mL 1 ％的醋酸溶液中， 得 到 2mg/mL 的 壳 聚 糖 溶 液。 以 蒸 馏 水 配 制 1mg/mL 的 羧 甲 基 纤 维 素 钠 溶 液 20ml。 取 含 50mgEndostar 醋酸盐缓冲液 (pH5.5) 加入壳聚糖溶液中， 磁力搅拌下缓慢滴加羧甲基纤维 素钠溶液， 反应 5 分钟， 即得重组人血管内皮抑制素纳米粒溶液。将上述纳米粒溶液在 4 摄 氏度， 10000 转 / 分条件下离心 30 分钟， 分离纳米粒。将所得纳米粒重新分散于 50mL 水中， 加入 1g 蔗糖， 冷冻干燥， 得到粒径分布均匀的重组人血管内皮抑制素纳米粒。
将 离 心 分 离 后 的 上 清 溶 液 适 当 稀 释， 采 用 BCA 方 法 ( 试 剂 盒 来 自 于 TM ThermoScientific， 名为 BCA Protein Assay Kit) 测定其中的蛋白浓度即游离蛋白浓度， 计算纳米粒中重组人血管内皮抑制素质量百分数即载药量。其中载药量＝ ( 加入蛋白质 量 - 游离蛋白质量 )÷ 载药纳米粒总重。将冻干后的纳米粒用蒸馏水复溶， 用 nano-ZS90 马尔文粒径仪测定纳米粒粒径。所得纳米粒载药量为 36.3％， 平均粒径为 183nm， 粒径分布 见图 2。 实施例三
称取分子量为 100000 道尔顿的壳聚糖 250mg， 溶于 50mL 1％的醋酸溶液中， 得到 5mg/mL 的壳聚糖溶液。以蒸馏水配制 1mg/mL 的羧甲基纤维素钠溶液 75ml。取含 100mg Endostar 磷酸盐缓冲液 (pH5.0) 加入壳聚糖溶液中， 螺旋桨搅拌下 (300 转 / 分 ) 缓慢滴加 羧甲基纤维素钠溶液， 反应 10 分钟， 即得重组人血管内皮抑制素纳米粒溶液。用用透射电 镜观察纳米粒形态， 可观察到纳米粒呈球形。纳米粒形态见图 3。
实施例四
称取分子量为 100000 道尔顿的壳聚糖 250mg， 溶于 50mL 1％的醋酸溶液中， 得到 5mg/mL 的壳聚糖溶液。以蒸馏水配制 2.5mg/ml 的羧甲基纤维素钠溶液 25mL。取含 100mg Endostar 醋酸盐缓冲液 (pH5.5) 加入壳聚糖溶液中， 磁力搅拌下缓慢滴加羧甲基纤维素钠 溶液， 反应 5 分钟， 即得重组人血管内皮抑制素纳米粒溶液。 将上述纳米粒溶液在 4 摄氏度， 10000 转 / 分条件下离心 30 分钟， 分离纳米粒。将所得纳米粒重新分散于 50mi 水中， 加入 1.5g 海藻糖， 冷冻干燥， 得到粒径分布均匀的重组人血管内皮抑制素纳米粒。
载药量测定同实施例二。 取冻干后的纳米粒 50mg 加入 5mL 磷酸盐缓冲液 (pH7.4)， 37 度， 100 转下振荡释放 10 天， 分别于 1d、 2d、 4d、 6d、 8d、 10d 取样， 采用 BCA 方法 ( 试剂盒 TM 来自于 Thermo Scientific， 名为 BCA Protein Assay Kit) 测定其中的蛋白浓度即释放 的蛋白浓度， 计算累积释放率。所得纳米粒载药量为 25.6％， 10d 累积释放达 70％， 累积释 放曲线见图 4。