发明内容
本发明的目的是提供鸦胆子油乳注射液在抗肿瘤方面的新用途。
本发明提供了鸦胆子油乳注射液在抗血液系统肿瘤方面的新用途。
1)鸦胆子油乳注射液能剂量依赖性的抑制人白血病U937的成活率。
2)鸦胆子油乳注射液剂量依赖性的诱导U937细胞发生凋亡，说明鸦胆子油乳注射液具有抗白血病的潜力。
3)鸦胆子油乳注射液剂量依赖性的抑制人白血病NB4的成活率。
4)鸦胆子油乳注射液能剂量依赖性的抑制人白血病HL-60的成活率。
5)鸦胆子油乳注射液能剂量依赖性的诱导HL-60细胞发生凋亡，说明鸦胆子油乳注射液具有抗白血病的潜力。
6)鸦胆子油乳注射液能剂量依赖性的诱导从白血病患者血液中分离的白血病细胞发生凋亡，说明鸦胆子油乳剂具有临床应用于治疗白血病的潜力。
7)鸦胆子油乳注射液对从健康志愿者血液中分离的正常外周血淋巴细胞的细胞毒作用较低，说明鸦胆子油乳剂可能对白血病患者的毒副作用较低，具有临床应用于治疗白血病的潜力。
8)鸦胆子油乳注射液对人癌异种移植瘤(U937肿瘤模型)具有明显的抑制作用，进一步说明了鸦胆子油乳注射液具有抗白血病的潜力。
本发明还提供了鸦胆子油乳注射液在抗泌尿生殖系统肿瘤方面的新用途。
附图说明：
图1为鸦胆子油乳注射液对人白血病细胞系和人前列腺癌细胞系成活率的影响
结果以Mean±SEM表示。(***p＜0.001加药组与空白组进行比较)
其中A为鸦胆子油乳注射液对三种人白血病细胞系成活率的影响；
B为鸦胆子油乳注射液对人前列腺癌细胞Dul45成活率的影响。
图2为鸦胆子油乳注射液对人白血病细胞U937细胞周期的影响
图3为鸦胆子油乳注射液对人白血病细胞株U937凋亡相关蛋白影响
图4为鸦胆子油乳注射液对正常人外周血淋巴细胞和白血病细胞U937成活率的影响
结果以Mean±SEM表示。(***p＜0.001加药组与空白组进行比较)
图5为鸦胆子油乳注射液对正常人外周血淋巴细胞和白血病细胞系U937细胞周期的影响
图6为鸦胆子油乳注射液对正常人外周血淋巴细胞和白血病细胞系U937线粒体膜电位的影响
图7为鸦胆子油乳注射液对人癌异种移植模型瘤重和瘤体积的影响
(***p＜0.001加药组与空白组进行比较)
具体实施方式：
试验例1
鸦胆子油乳注射液处方及制备工艺
1.1执行标准：
部颁标准中药成方制剂第十四册WS3-B-2739-97
药典业发(1999)第254号
1.2处方
精制鸦胆子油 10000ml
精制豆磷脂 1500g
甘油 2500ml
加注射用水至 100000ml
制成 10000支
1.3制备工艺
取处方量的精制豆磷脂与温热的甘油与适量注射用水混合，转入到高速组织捣碎机内(8000转/分)，分散二次，第一次5分钟，第二次2分钟，使其分散均匀，加入温热的鸦胆子油，搅拌3次，每次2分钟，使成初乳剂，加入注射用水至10000ml，再转入到高压乳匀机内(40MPa)匀化三次，滤过，取滤液，灌封，灭菌，即得鸦胆子油乳注射液。
试验例2以人源性白血病HL-60，NB4及U937细胞株，人源性前列腺癌Du145细胞株为靶细胞进行鸦胆子油乳注射液对这些细胞的抑制作用实验
1材料
人源性白血病HL-60、NB4及U937细胞株，人源性前列腺癌Du145细胞株：由ATCC提供。RMPI 1640干粉：购自Invitrogen/Gibco。胎牛血清：购自TBD公司。胰酶：购自北京华美生科生物技术有限公司。四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)：购自购自北京华美生科生物技术有限公司。
2方法
将由ATCC提供的人源性白血病HL-60、NB4及U937细胞株、人源性前列腺癌Du-145细胞株用胰酶消化后，悬浮于含10％胎牛血清的培养液中，轻轻吹打成细胞悬液，显微镜下用细胞计数板计数活细胞。将肿瘤细胞接种于无菌的96孔培养板，每孔加肿瘤细胞悬液100μl。将细胞置于37℃、体积百分比为5％的CO2培养箱中贴壁过夜后，弃去上清液，然后加入不同浓度的鸦胆子油乳注射液药物分别作用一定时间后，转移上清液，在每孔中加入0.5mg/ml四唑盐(MTT)的无血清培养液100μl，37℃、体积百分比为5％的CO2培养箱中继续培养4小时，弃去上清液，每孔加入100μl DMSO，测定各孔吸光度，然后按下式计算平均抑制率。结果采用Mean±SEM表示，数据统计采用ANOVA对组间均数比较进行方差齐性分析，并运用Dunnett’s t-test进行组间比较。
计算公式：(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值X100
3结果
结果如表1所示，鸦胆子油乳注射液对人源性白血病HL-60，U937细胞株和人源性前列腺癌Du-145细胞株具有抑制作用，并随剂量的递增而提高。鸦胆子油乳注射液作用白血病HL-60及U937细胞6小时后，其IC50分别为312.7，271.5，265.4μg/ml。鸦胆子油乳注射液作用前列腺癌Du145细胞48和72小时后，其IC50分别为455.96和334.00μg/ml。
此结果表明，鸦胆子油乳注射液具有抗血液系统肿瘤以及泌尿生殖系统肿瘤的潜力。
试验例3以人源性白血病U937细胞株为靶细胞进行鸦胆子油乳注射液对于U937细胞株细胞周期的影响实验
1材料
碘化吡啶(PI)染料：购自Sigma公司。Rnases A：购自Sigma公司。流式细胞仪：Becton Dickinson公司。
2方法
将处于对数生长期的白血病U937细胞调整细胞密度为1～1.5×105cells/ml，加入一定浓度的药物后，于培养中孵育6小时。然后从培养箱中取出，1000rpm离心沉淀细胞，并用PBS洗涤1次。然后使用70％的酒精于-20度冰箱内固定过夜。待检测时，离心收集细胞，PBS洗涤一边后，加入20mg/ml的RnaseA 37℃孵育45min，然后加入1mg/ml的PI燃料，4℃孵育10分钟后，即可用流式细胞仪进行检测。
3结果
结果如图2所示，鸦胆子油乳注射液(125μg/ml，250μg/ml和500μg/ml)均可使U937细胞株的亚凋亡峰增加，并具有剂量依赖性。细胞的亚凋亡峰为凋亡发生时的重要特征之一，可部分证明鸦胆子油乳注射液可诱导U937细胞发生凋亡。
试验例4以人源白血病U937细胞为靶细胞进行鸦胆子油乳注射液对凋亡蛋白的影响实验
1材料
PARP，procapase-3，procaspase-8，procaspase-9抗体：均购自CellSignaling公司。ECL：购自Thermo Scientific公司。山羊抗兔二抗及山羊抗小鼠二抗：均购自宝信生物科技有限公司。
2方法
Western blot方法。选择依托泊苷注射液为阳性药。鸦胆子油乳注射液作用6小时后，提取细胞蛋白进行实验。
3结果
结果如图3所示：Caspase-3，Caspase-9以及Caspase-8均为凋亡通路上的重要执行蛋白，鸦胆子油乳注射液作用后，均能使他们发生活化。而PARP，作为Casapse-3的作用底物，当Capsase-3被活化时，能够启动凋亡并使PARP发生裂解。结果表明，鸦胆子油乳注射液能够使PARP发生裂解，从而进一步证明了凋亡的发生。
试验例5以从白血病患者体内分离的白血病细胞为靶细胞进行鸦胆子油乳注射液对分离的白血病细胞细胞周期的影响试验
1材料
淋巴分离液：购自天津TBD公司
2方法
取新诊断的白血病患者的外周血5ml，将其分成两等份。与等量PBS混合后，逐滴加入到2.5ml的淋巴分离液中。然后2500rpm离心15分钟后，吸取位于淋巴分离液与血清中的淋巴细胞层。用PBS洗涤后，培养于RMPI 1640培养液中，胎牛血清10％。然后加入指定浓度的鸦胆子油乳注射液，6小时后收集细胞进行细胞周期的测定。
3结果
表1中为14名白血病患者的临床指标，以及鸦胆子油乳注射液作用后，白血病细胞的细胞周期的变化。实验结果表明，鸦胆子油乳注射液可显著升高14名患者白血病细胞的亚凋亡峰。结果表明，鸦胆子油乳注射液可诱导白血病患者的白血病细胞发生凋亡。
表1白血病患者的临床指标以及鸦胆子油乳注射液作用后的凋亡百分比
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试验例6以正常外周血淋巴细胞(PBL)为靶细胞进行鸦胆子油乳注射液对正常外周血淋巴细胞成活率的影响试验
1材料
淋巴分离液：购自天津TBD公司
2方法
取健康志愿者的外周血5ml，将其分成两等份。与等量PBS混合后，逐滴加入到2.5ml的淋巴分离液中。然后2500rpm离心15分钟后，吸取位于淋巴分离液与血清中的淋巴细胞层。用PBS洗涤后，培养于RMPI 1640培养液中，胎牛血清10％。然后加入指定浓度的鸦胆子油乳注射液，6小时后采用MTT法进行细胞成活率的测定。
3结果
结果如图4所示，同样浓度的鸦胆子油乳注射液作用对正常人外周血淋巴细胞成活率的影响要明显小于白血病细胞系U937。这表明，鸦胆子油乳注射液对正常人血液系统的毒副作用较低。
试验例7以正常外周血淋巴细胞为靶细胞进行鸦胆子油乳注射液对正常外周血淋巴细胞细胞周期的影响试验
1材料
PI染料：美国Sigma公司。淋巴分离液：购自天津TBD公司
2方法
取健康志愿者的外周血5ml，将其分成两等份。与等量PBS混合后，逐滴加入到2.5ml的淋巴分离液中。然后2500rpm离心15分钟后，吸取位于淋巴分离液与血清中的淋巴细胞层。用PBS洗涤后，培养于RMPI 1640培养液中，胎牛血清10％。然后加入指定浓度的鸦胆子油乳注射液，6小时后收集细胞，并使用70％酒精于-20度冰箱内固定过夜。待检测时，离心收集细胞，PBS洗涤一边后，加入20mg/ml的RnaseA 37℃孵育45min，然后加入1mg/ml的PI燃料，4℃孵育10分钟后，即可用流式细胞仪进行检测。
3结果
结果如图5所示，相同剂量鸦胆子油乳注射液作用后，白血病细胞系U937的细胞周期出现了明显的亚凋亡峰，而正常人外周血淋巴细胞的细胞周期却几乎不受影响。这表明，鸦胆子油乳注射液可能有选择性作用于肿瘤细胞的特性，提示鸦胆子油乳注射液可作为一个高效低毒的抗肿瘤药物用于治疗白血病。
试验例8以正常外周血淋巴细胞为靶细胞进行鸦胆子油乳注射液对正常外周血淋巴细胞细胞周期的影响试验
1材料
Rh123染料：美国Sigma公司。淋巴分离液：购自天津TBD公司
2方法
取健康志愿者的外周血5ml，将其分成两等份。与等量PBS混合后，逐滴加入到2.5ml的淋巴分离液中。然后2500rpm离心15分钟后，吸取位于淋巴分离液与血清中的淋巴细胞层。用PBS洗涤后，培养于RMPI 1640培养液中，胎牛血清10％。然后加入指定浓度的鸦胆子油乳注射液，6小时后收集细胞，细胞(106个)经PBS洗涤后，加入Rh123至终浓度为0.2μg/mL，于室温避光孵育20分钟。细胞样品经PBS洗涤后经流式细胞仪检测其荧光强度(激发波长为495nm，吸收波长为535nm)。
3结果
结果如图6所示，相同剂量鸦胆子油乳注射液作用后，白血病细胞系U937的线粒体膜电位发生了明显的下降，而正常人外周血淋巴细胞线粒体膜电位的下降程度却远远低于U937细胞。这表明，鸦胆子油乳注射液可能有选择性作用于肿瘤细胞的特性，提示鸦胆子油乳注射液可作为一个高效低毒的抗肿瘤药物用于治疗白血病。
试验例9以人癌异种移植模型来进行考察鸦胆子油乳注射液体内抗白血病作用的实验
1试验材料
PBS缓冲液，游标卡尺
2方法
从北京国家啮齿类动物中心购买体重范围为22～25mg的雄性裸小鼠，动物运抵中国医科大学SPF级实验室后需渡过7天的检疫期，每隔1天对动物进行称重，观察动物是否出现疫病。收集对数生长期的U937细胞，使用高压灭菌后的PBS调整细胞密度为5×107，于小鼠右侧腋下皮下接种0.2mL细胞悬液。使用游标卡尺测量动物皮下生长的瘤块，当瘤块体积达50～80mm3时，将动物随机分成空白组，阳性药组，低剂量组，中剂量组和高剂量组。用生理盐水对药物进行稀释，并通过尾静脉注射给予动物剂量分别为5.5mg/kg，16.5mg/kg和49.5mg/kg的药物。阳性药为2.Smg/kg的依托泊苷注射乳。连续给药10天，每天给药前称量动物体重。每隔一天称量动物的摄食和饮水，并使用游标卡尺测量动物皮下生长的瘤块。于第11天脱颈处死动物，进行剥瘤，称量瘤重为肿瘤组织拍照。并使用以下公式计算瘤体积：瘤长度×瘤宽度2/2。
3实验结果
结果如图7所示，尾静脉注射鸦胆子油乳注射液10天，可以显著抑制肿瘤的增长。鸦胆子油乳注射液处理组的瘤重和瘤体积均显著小于空白组。这表明鸦胆子油乳注射液在人癌异种移植模型中也具有较好的抗白血病作用，提示鸦胆子油乳剂可以作为一个抗肿瘤药物用于治疗白血病。