发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服猪瘟细胞苗的生产所存在的不足，提供一种新的猪瘟活疫苗的制备方法，该方法能够快速、准确的测定疫苗效价，所制备的疫苗安全性好、免疫效力高，对猪瘟强毒攻击具有完全的免疫保护作用。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种猪瘟活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)、培养猪源传代细胞系；(2)、将猪瘟活疫苗生产种毒接种猪源传代细胞系，筛选得到猪瘟弱毒疫苗株；(3)、将猪瘟弱毒疫苗株进行病毒增殖；(4)、采用免疫荧光方法测定增殖病毒悬液的(TCID50)毒价；(5)、向检测合格后的病毒液中加入冻干保护剂和抗生素进行配苗、冷冻干燥，即得。
本发明针对猪瘟细胞苗在生产中所存在的一系列问题，从经过如下几个阶段进行改进：(1)、猪源传代细胞系的筛选与鉴定：将猪瘟兔化弱毒接种不同猪源传代细胞系，至37℃培养4～5日，收获病毒，将收获病毒传代，应用免疫荧光方法对接种不同猪源传代细胞系的各代次病毒进行检测，检测结果显示猪瘟兔化弱毒可在PT细胞系，MPK细胞系，SK6细胞系，PK 2a细胞系，CPK细胞系或RKC细胞系上增殖。(2)、毒种的制备：将猪瘟兔化弱毒在PT细胞系上进行传代，适应PT细胞系。应用有限稀释法进行两轮克隆纯化，筛选到一株合适的猪源传代细胞系的猪瘟弱毒疫苗株，其微生物保藏号是：CGMCC No.3891；分类命名是：猪瘟病毒；保藏时间是：2010年5月27日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。(3)免疫荧光方法的建立：应用抗CSFV单克隆抗体建立免疫荧光方法，应用此方法进行病毒TCID50的测定。
优选的，步骤(1)所述的猪源传代细胞系的培养方式为单层贴壁培养、悬浮培养或固定化培养。
步骤(2)中将猪瘟活疫苗生产种毒以感染剂量(MOI)0.1-0.5接种到PT单层细胞系上进行培养，接种5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液，收获不超过5次。
步骤(4)中采用免疫荧光方法测定增殖病毒的(TCID50)毒价时，所采用的单克隆抗体优选为抗CSFV单克隆抗体(北京健翔和牧生物科技有限公司对外有售)，所采用的标记物优选为FITC或IPMA；所用到的固定液优选为预冷的80％丙酮、10％甲醛或75％乙醇。更优选的，所述的免疫荧光方法包括以下步骤：
(1)细胞传代，准备细胞培养板：选取生长良好的PT细胞，经胰酶-EDTA消化后，加入细胞生长液制备细胞悬液，应用台盼兰稀释计数，调整细胞密度为2.5～3.5×105个/ml，以100ul/孔接入96孔细胞培养板。
(2)疫苗毒样品的稀释：将要滴定的猪瘟活疫苗病毒悬液作10倍倍比稀释，注意在从上一个稀释度移至下一个稀释度时要更换吸头，每次稀释均要漩涡混匀。
(3)病毒接种(同步接毒)：接入100μl样本，每个稀释度6～8个重复。加入100μl培养基作为阴性对照，每块板至少设2列阴性对照。盖上盖子在37℃±1℃，4～6％CO2培养箱中培养3～5天。
(4)免疫荧光检测
①倾去板子中的液体于强碱性溶液中，用PBST洗涤2次，拍干残余液体，每孔加50～100μL预冷的固定液(80％丙酮或10％甲醛或75％乙醇)固定20min。
②直接免疫荧光：PBST洗涤2次，拍干残余液体，每孔加入工作浓度的FITC标记CSFV单克隆抗体50μL，置湿盒中37℃孵育30～45min，去除抗体，用PBST洗涤3次；
③间接免疫荧光：PBST洗涤2次，拍干残余液体，每孔加入工作浓度的CSFV单克隆抗体50μL，置湿盒中37℃孵育45～60min，去除一抗，用PBST洗涤3次，每孔加入工-作浓度的FITC标记抗鼠二抗(SIGMA)50μL，闭光37℃孵育30～45min，去除二抗，用PBST洗涤3次；
④在荧光显微镜下观察有无特异性荧光斑出现，记录于试验记录纸上并应用Spearman Karber方法并计算病毒滴度。
(5)结果有效的判定：所有试验中阴性孔荧光阴性；参考对照必须在正常的范围内；如果样本在最小稀释度阳性孔低于50％或在最高稀释度阳性孔高于50％，可报告结果低于或高于该滴度50％。
本发明用细胞系替代牛睾丸原代细胞制造猪瘟活疫苗，可解决牛源外源病原污染的问题，通过原材料和培养条件的严格控制，保证生产出来的疫苗纯粹，确保疫苗的安全性。用细胞系生产猪瘟活疫苗各批间质量差异小，具有生产工艺简单稳定、易操作、产量大、成本低等特点，具备工业化大生产的可行性和可放大性。此外，本发明采用单克隆抗体的免疫方法检测猪瘟细胞毒液病毒含量，检测敏感，快速，特异，准确，重复性高，结果可靠。利用本发明生产并应用新型冻干保护剂配制的猪瘟活疫苗冻干后疫苗可在4℃保存。经生产，检验，保存的一系列改善，可以大大提高猪瘟活疫苗的免疫效力，经免疫攻毒试验结果显示，本发明所制备的猪瘟活疫苗对猪瘟强毒攻击可100％保护。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 猪源传代细胞系的筛选与鉴定
将猪瘟兔化弱毒接种不同猪源传代细胞系，至37℃培养4～5日，收获病毒，将收获病毒传代，应用免疫荧光方法对接种不同猪源传代细胞系的各代次病毒进行检测，检测结果显示猪瘟兔化弱毒可在PT细胞系，MPK细胞系，SK6细胞系，PK 2a细胞系，CPK细胞系，RKC细胞系上增殖。本发明是用细胞系(PT、MPK、SK6、PK 2a、CPK、RKC)培养猪瘟兔化弱毒，收获细胞病毒液，采用免疫荧光法测定增殖病毒悬液的毒价，向检测合格后的病毒液中加入冻干保护剂和抗生素进行配苗、冷冻干燥，制成猪瘟传代细胞苗。
实施例2 用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法
(1)制苗用细胞的传代与培养：PT细胞系经胰酶-EDTA细胞分散液消化传代，一比五进行传代。以细胞生长液于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；
(2)细胞毒种的繁殖：用细胞维持液，将新鲜脾毒制成0.3％的病毒悬液，接种生长良好的PT细胞系单层，置37℃继续培养。隔5日收获细胞培养毒液作为生产用毒种；细胞毒种鉴定：细胞毒种鉴定完全符合猪瘟兔化弱毒株毒种标准，对猪安全无副作用，细胞毒种每1ml含病毒＞100，000个家兔感染量；
(3)制苗毒液的繁殖：取已形成良好单层的PT细胞系培养瓶，弃去营养液，接种含3％生产用细胞毒种(在转瓶中培养，细胞密度达到5-10×107/ml；在生物反应器中添加附着载体的悬浮培养或无载体的悬浮培养，细胞密度达到5-10×107-8/ml；固定化培养将上述细胞系与水不溶性载体(纸片、无纺聚酯纤维载片)结合进行培养，细胞密度达5-10×107-8/ml)，置37℃继续培养，接毒后第5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液1次，收获的毒液置-15℃以下保存；制苗毒液的检验：按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15、19页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液对猪安全无副作用，各收次病毒培养液分别用家兔测定，每1ml含病毒＞100，000个家兔感染量；
上述所用营养液的配方是：92％DMEM液、5-8％犊牛血清、加适量的抗菌素，pH值调整为7.0。上述所用维持液的配方是：95％DMEM液、3.5-5％犊牛血清、加适量的抗菌素，pH值调整为7.2。
试验例1应用单克隆抗体的免疫荧光方法检验猪瘟活疫苗的病毒滴度
1、细胞传代，准备细胞培养板：选取生长良好的PT细胞，经胰酶-EDTA消化后，加入细胞生长液制备细胞悬液，应用台盼兰稀释计数，调整细胞密度为2.5～3.5×105个/ml，以100ul/孔接入96孔细胞培养板。
2、疫苗毒样品的稀释：将要滴定的猪瘟活疫苗病毒悬液作10倍倍比稀释，注意在从上一个稀释度移至下一个稀释度时要更换吸头，每次稀释均要漩涡混匀。
3、病毒接种(同步接毒)：接入100ul病毒样本，每个稀释度6～-8个重复。加入100ul培养基作为阴性对照，每块板至少设2列阴性对照。盖上盖子在37℃±1℃，4～6％CO2培养箱中培养3～5天；
4、免疫荧光检测
①倾去板子中的液体于强碱性溶液中，用PBST洗涤2次，拍干残余液体，每孔加50～100μL预冷的固定液(80％丙酮或10％甲醛或75％乙醇)固定20min。
②直接免疫荧光：PBST洗涤2次，拍干残余液体，每孔加入工作浓度的FITC标记CSFV单克隆抗体50μL，置湿盒中37℃孵育30～45min，去除抗体，用PBST洗涤3次；
③间接免疫荧光：PBST洗涤2次，拍干残余液体，每孔加入工作浓度的CSFV单克隆抗体50μL，置湿盒中37℃孵育45～60min，去除一抗，用PBST洗涤3次，每孔加入工作浓度的FITC标记抗鼠二抗(SIGMA)50μL，闭光37℃孵育30～45min，去除二抗，用PBST洗涤3次；
④在荧光显微镜下观察有无特异性荧光斑出现，记录于试验记录纸上并应用Spearman Karber方法并计算病毒滴度。
(5)结果有效的判定：所有试验中阴性孔荧光阴性；参考对照必须在正常的范围内；如果样本在最小稀释度阳性孔低于50％或在最高稀释度阳性孔高于50％，可报告结果低于或高于该滴度50％。
试验例2猪瘟病毒培养条件的优化试验
1 方法
1.1 接毒方式研究
1.1.1 同步接种 选用生长良好的PT细胞2转瓶消化，按1∶3进行传代，其中1瓶作为阴性对照，2瓶传代后以MOI值0.1接种病毒，置37℃转瓶机内进行培养，接种5日后收获病毒液，冻融2次，测定病毒含量(TCID50)。
1.1.2 单层接种 1.1.1消化传代的细胞中，2瓶待细胞长满单层后以M0I 0.1接种猪瘟病毒，加入维持液，置37℃转瓶机内进行培养，接种5日后收获病毒液，冻融2次，测定病毒含量(TCID50)。
1.2 MOI研究
选用生长良好的PT细胞，按MOI值0.01，0.05，0.1、0.3和0.5接入病毒液，每个MOI值接种2个转瓶，同时设一个转瓶为阴性对照。接种5日后收获病毒液，冻融2次，测定病毒含量(TCID50)。
1.3 病毒收获时间，收获次数的研究
选生长良好的PT细胞，按MOI值0.1加入猪瘟病毒液，分别在接毒后第1日，2日，3日，4日，5日取上清样品，测定病毒含量(TCID50)，在接毒后5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液一次，于每个收次每天取上清样品，测定病毒含量(TCID50)，收获不超过5个收次。
2 试验结果
2.1 接毒方式研究结果表明，单层接毒方式猪瘟病毒滴度高于同步接毒方式，详见表1。
表1 同步与单层接种比较结果
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2.2 MOI研究试验结果表明MOI为0.1～0.5时病毒滴度最高，详见表2。
表2 MOI研究结果
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2.3 病毒收获时间及收获次数研究试验结果表明，病毒接种后5日作第一次收获换液，以后每隔4日，收获不超过5次病毒滴度较高，详见表3、4、5、6、7。
表3 病毒接种后第一次收获研究结果
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表4 病毒接种后第二次收获研究结果
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表5 病毒接种后第三次收获研究结果
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表6 病毒接种后第四次收获研究结果
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表7 病毒接种后第五次收获研究结果
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3 小结
根据以上实验结果，本发明确定猪瘟纯化病毒在PT细胞上的最佳培养条件为：细胞单层时接毒，MOI值为0.1～0.5，接种5日作第一次收获换液，以后每隔4日，收获不超过5次。
试验例3 猪瘟活疫苗的毒价测定试验
一、试验材料
1、供试样品：按照本发明实施例1的方法制备了三批猪瘟活疫苗(细胞系源，批号为试PT200801、试PT200802、试PT200803；
2、猪瘟活疫苗(细胞源)购自生物公司，批号为20080415、20080621、20081005；
二、试验方法
将兔检合格的三批猪瘟活疫苗(细胞系源)与三批猪瘟活疫苗(细胞源)应用直接免疫荧光方法进行病毒TCID50测定，结果见表8。
表8
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由表8可以看出应用牛睾丸原代细胞制造的三批猪瘟活疫苗(细胞源)，批间差异大，病毒含量低，应用猪源传代细胞系制造的三批猪瘟活疫苗(细胞系源)，批间差异小，病毒含量高于猪瘟活疫苗(细胞源)。
试验例4 本发明猪瘟活疫苗的免疫效果试验
一、试验材料
1、供试疫苗：按照实施例1的方法生产三批猪瘟活疫苗(细胞系源)，批号为试PT200801、试PT200802、试PT200803；
2、对照疫苗：三批猪瘟活疫苗(细胞源)购自生物公司，批号为20080415、20080621、20081005；
3、IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒购自北京爱德士元亨生物科技有限公司
二、试验方法
取三批供试疫苗(细胞系源)与三批对照疫苗(细胞源)在两个猪场做免疫对比试验，将六批疫苗分别按使用说明将其稀释至1头份，供试疫苗(细胞系源)病毒含量为104.0TCID50/头份，对照疫苗(细胞源)病毒含量＞3000RID/头份，肌肉接种21-30日龄仔猪。于免疫后21天和27天用IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒进行抗体效价检测(阻断率≥40％为抗体阳性)；免疫后28天抽取免疫动物(5头/批)与对照动物(3头)进行攻毒。
三、试验结果
免疫后21天，对照疫苗(细胞系源)抗体合格率为85％，对照疫苗(细胞源)抗体合格率为68％；免疫后27天供试疫苗(细胞系源)抗体合格率为91％，对照疫苗(细胞源)抗体合格率为76％，表明对照疫苗(细胞系源)抗体产生效果明显好于猪瘟活疫苗(细胞系源)
免疫28天后，抽取免疫组猪(5头/批)与对照动物(3头)一同注射猪瘟石门系血毒(104.0TCID50/ml)，1ml/头猪，攻毒试验于攻毒后16天结束，结果见表9。
表9
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结论：本次试验表明供试疫苗(细胞系源)免疫效果明显好于对照疫苗(细胞源)。
试验例5应用单克隆抗体的免疫荧光方法检验猪瘟活疫苗的敏感性和特异性试验
一、免疫荧光检测方法的敏感性：
敏感性检验：用细胞维持液将CSFV稀释为103、102、101、1TCID50四个稀释度，每个稀释度病毒液接种长满90％单层PT细胞的96孔细胞培养板10孔，同时接种不加病毒的细胞维持液对照10孔，37℃培养3～4天，固定后进行直接荧光抗体染色，洗涤，镜检。10个病毒阴性对照孔，均检测不到特异性荧光，每个稀释度的接毒细胞孔均可检测到特异性荧光。以抗猪瘟单克隆抗体建立的免疫荧光方法可以检测到1个TCID50单位的猪瘟病毒粒子，敏感性良好，结果见图2：
二、免疫荧光检测方法的特异性：
特异性试验：用细胞维持液将伪狂犬病病毒(PRV)、狂犬病病毒(RV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV)稀释为1000TCID50，每种稀释病毒液接种长满90％单层PT细胞的96孔细胞培养板10孔；同时设置10个猪瘟病毒(CSFV)阳性对照孔和10个不接种病毒阴性对照孔，37℃培养3～4天，固定后进行荧光抗体染色，洗涤，镜检。PRV、RV、PPV、PCV接毒细胞孔及阴性对照孔均检测不到特异性荧光，CSFV接种孔均可以检测到特异性荧光。以本公司制备的抗猪瘟单克隆抗体建立的免疫荧光方法特异性良好，结果见图3。
试验例6免疫荧光方法与兔体温法检测猪瘟兔化弱毒的比较试验
由表10可以看出，用兔体温法检测猪瘟兔化弱毒(牛睾丸细胞毒)，稀释倍数为五万倍组检测结果为不合格，而稀释倍数为十万倍组(病毒含量低于前者)检测结果却为合格；同样兔体温法检测猪瘟兔化弱毒(实施例1所制备)(PT细胞毒)，稀释倍数为一万倍组检测结果为不合格，稀释倍数为五万倍和十万倍组检测结果为合格(病毒含量低于前者)。说明用兔体定型热反应法测毒，结果易受兔体个体差异和天气条件影响，兔热法测毒属于一种非特异性反应，用其测毒不能准确定量，而用免疫荧光方法测定猪瘟病毒TCID50可以准确定量。
表10
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