一种猪多联抗血清复合制剂的制备方法.pdf

发明内容

为了提高猪多联抗血清制品的预防效果，并且为了克服现有猪多联抗血清制品中外源微生物分离技术成本大、技术设备要求高以及病毒、细菌及支原体灭活效果差等缺点，本发明提供一种猪多联抗血清复合制剂的制备方法。

解决上述技术问题，本发明所述的一种猪多联抗血清复合制剂的制备方法，是将黄芪多糖在121℃、100kPa条件下灭菌60分钟，灭菌后的黄芪多糖溶液加入到含有猪瘟病毒抗体、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体的抗血清中形成猪多联抗血清复合溶液，并使黄芪多糖在该复合溶液中的质量浓度为1%，再使用⁶⁰Co-γ射线辐照该猪多联抗血清复合溶液制得猪多联抗血清复合制剂，辐照温度为15～25℃，辐照剂量率为5～20Gy/min，辐照吸收剂量为9～19kGy。

为取得更好的效果，优选的辐照条件是：辐照温度为20℃，辐照剂量率为13.8Gy/min，辐照吸收剂量为12kGy。

该猪多联抗血清复合制剂选用黄芪多糖作为抗体保护剂及免疫增强剂，其与猪多联抗血清配合，首先其可以包裹在抗体周围形成保护层，在⁶⁰Co-γ射线辐照该复合制剂时保护抗体活性，其次黄芪多糖能够激活机体免疫系统，增强B细胞、T细胞的活化，增强其他吞噬细胞的杀伤作用，并且促进细胞分泌各种免疫因子（干扰素等），抑制病毒繁殖。

通过抽取高免猪的血液，再取血清就可以得到猪瘟病毒抗体、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体的抗血清。本发明用⁶⁰Co-γ射线辐照猪多联抗血清复合制剂灭活病毒、细菌及支原体的原理是：在辐照过程中，⁶⁰Co释放出的γ射线穿透西林瓶，作用于外源病毒、细菌及支原体，直接或间接破坏其DNA、RNA、蛋白质和酶等生命至关重要的物质，从而杀死病毒、细菌及支原体。直接作用是指γ射线辐照病毒、细菌及支原体内的核糖核酸、蛋白质和酶分子，使其激发或电离，激发态分子的共价键断裂或与其它分子反应经电子传递产生自由基，导致它们分子结构破坏而死亡。间接作用是指γ射线能量被病毒、细菌及支原体内生命重要分子的周围物质如水吸收而激发或电离，产生激发的水分子、电子或水离子，或裂解为氢自由基、羟自由基，由此产生一系列与核糖核酸、蛋白质、酶进行氧化还原等反应，致病毒、细菌及支原体死亡。各种微生物之间，对辐照敏感性差异很大，革兰氏阴性菌对辐照敏感，有一些革兰氏阳性菌对辐照异常顽固。芽孢比生长的细胞更能抗辐照。病毒比细菌芽孢对辐照更具有抵抗力，其抗辐照性能随着微生物个体的减少而增大，芽孢的抗辐照性能按次序比细菌、酵母、霉菌更强些。

辐照吸收剂量对病毒、细菌及支原体的灭活效果具有至关重要的影响，超出条件范围或者达不到灭活效果，或者会破坏抗血清本身的有效成分。药典中已将⁶⁰Co-γ射线辐照作为一种辐照灭菌方法，常用的灭菌辐照吸收剂量为25kGy，该项灭菌技术已广泛应用于中药材、中成药、抗生素、维生素等的灭菌，但在抗血清制品灭菌中还未见报道，就是由于辐照吸收剂量影响抗体效价和灭菌效果，辐照吸收剂量过大时虽然能达到灭菌效果，但抗体效价衰减过多，辐照吸收剂量过小时抗体效价衰减不明显，但灭菌效果不佳，所以既要保证灭菌效果，又要保证抗体效价不衰减，辐照灭菌吸收剂量难以确定。本发明组成员通过长期努力，经过大量实验确定了一种猪多联抗血清复合制剂的辐照条件，辐照过程在普通的室温条件下进行，可以有效地杀灭猪多联抗血清复合制剂中的病毒、细菌及支原体。

本发明对辐照吸收剂量分组进行了筛选，分别选取了三个辐照吸收剂量组：2～8kGy，9～19kGy，20～25kGy。短小芽孢杆菌孢子是⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌法的生物指示剂，所以选用短小芽孢杆菌作为辐照吸收剂量筛选指示剂。将短小芽孢杆菌孢子片（10⁷个）与猪多联抗血清复合制剂共同装于10ml西林瓶中，每瓶一片短小芽孢杆菌孢子片及10ml猪多联抗血清复合制剂（猪瘟病毒抗体OD值为2.860，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体OD值为3.042，猪伪狂犬病病毒抗体OD值为2.217），并设不辐照阳性对照组，分别进行三组辐照吸收剂量组的辐照灭菌，辐照温度为15～25℃，辐照剂量率为5～20Gy/min，辐照后分别用猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征ELISA抗体检测试剂盒和猪伪狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒检测猪多联抗血清复合制剂中猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪伪狂犬病病毒抗体效价水平，并且将短小芽孢杆菌孢子片取出放入胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基中35℃培养，每日观察情况，共培养7日。结果为下表：

表1：不同辐照区间三种病毒抗体OD值 

辐照吸收剂量为2～8kGy的猪多联抗血清复合制剂三种病毒抗体OD值变化不明显，培养短小芽孢杆菌孢子片的培养基48小时时浑浊；辐照吸收剂量为9～19kGy的猪多联抗血清复合制剂三种病毒抗体OD值下降幅度不大，培养短小芽孢杆菌孢子片的培养基7日后仍澄清透明；辐照吸收剂量为20～25kGy的猪多联抗血清复合制剂三种病毒抗体OD值急剧下降，抗体效价损失严重，培养短小芽孢杆菌孢子片培养基7日后仍澄清透明；不辐照阳性对照组三种病毒抗体OD值仍为原先值，不变，培养短小芽孢杆菌孢子片培养基24小时时浑浊。通过实验结果可以看出当辐照吸收剂量为20～25kGy时，虽然能够达到猪多联抗血清复合制剂杀灭短小芽孢杆菌孢子的要求但是猪多联抗血清复合制剂抗体效价急剧下降，故不能作为猪多联抗血清复合制剂杀灭病毒、细菌及支原体的辐照吸收剂量；当辐照吸收剂量为2～8kGy时，虽然猪多联抗血清复合制剂抗体效价变化不明显，但是未能达到猪多联抗血清复合制剂杀灭短小芽孢杆菌孢子的要求，故也不能作为猪多联抗血清复合制剂杀灭病毒、细菌和支原体的辐照吸收剂量；只有在辐照吸收剂量为9～19kGy时，既能达到猪多联抗血清复合制剂杀灭病毒、细菌和支原体的要求，又能使猪多联抗血清复合制剂抗体效价下降幅度不大，故该辐照吸收剂量为最佳剂量。

以下是⁶⁰Co-γ射线对猪多联抗血清复合制剂中抗体效价的影响所做的实验，取猪多联抗血清复合制剂（猪瘟病毒抗体OD值为2.860，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体OD值为3.042，猪伪狂犬病病毒抗体OD值为2.217）分别分装于无菌西林瓶中，每瓶10ml，每5瓶为一组，将分装后的猪多联抗血清复合制剂用⁶⁰Co-γ射线辐照，辐照吸收剂量分别为9kGy，10kGy，11kGy，12kGy，13kGy，14kGy，15kGy，16kGy，17kGy，18kGy，19kGy，辐照温度为20℃，辐照剂量率为13.8Gy/min。辐照后分别用猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征ELISA抗体检测试剂盒和猪伪狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒检测猪多联抗血清复合制剂中猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪伪狂犬病病毒抗体效价水平，结果如下表2、3、4所示。

表2：猪瘟病毒抗体OD值

表3：猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体OD值

表4：猪伪狂犬病病毒抗体OD值

从表2、3、4可见9～19kGy中的任意一个辐照吸收剂量都可以作为猪多联抗血清复合制剂病毒、细菌和支原体的灭菌剂量，其对血清抗体效价影响不明显。在以上条件范围之内，从大量实验中优选的辐照条件是：辐照温度为20℃，辐照剂量率为13.8Gy/min，辐照吸收剂量为12kGy。

本发明所述的猪多联抗血清复合制剂注射猪体能够使猪体迅速具有猪瘟病毒抗体、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体及猪伪狂犬病病毒抗体，使猪体达到被动免疫的效果；该猪多联抗血清复合制剂并同时具有增强机体免疫机能的作用，使猪能够更好的抵抗病毒性疾病的发生，而且通过60Co-γ射线辐技术不会有外源病毒和细菌感染的危险，该方法可以杀灭猪多联抗血清复合制剂中的病毒、细菌及支原体，辐照后的西林瓶呈棕褐色，此灭活病毒、细菌和支原体的技术较膜过滤、亲和吸附柱过滤技术成本降低约70%，操作极其简便，并且对猪多联抗血清复合制剂的抗体效价影响小，同时，在原有猪多联抗血清的基础上加入抗体保护剂及免疫调节剂——黄芪多糖。本发明所述的方法操作简便、成本低廉、既能保护抗体活性、还能增强机体自身免疫反应，使其达到良好的紧急预防免疫效果。