神经生长因子的病毒灭活方法
技术领域
本发明涉及一种神经生长因子的病毒灭活方法。
背景技术
目前对于血液制品，国内外较为成熟的病毒灭活方法，主要有物理和化学法两大类，其中物理法包括加热、巴氏灭活、光照等方式，多数蛋白在此条件下不稳定，应避免采用；柱层析和过滤方法也有很好的去除病毒作用，但存在使用范围有限的缺陷，如纳米膜过滤仅适用于分子量较小(直径较小)的蛋白，且价格昂贵。化学法主要有有机溶剂/去污剂(S/D)、辛酸钠、低PH等方式，S/D法最早用于血液制品病毒灭活，在室温下需要6小时，对产品收率有影响，且有机溶剂/去污剂去除较为麻烦；辛酸钠法是新发展的病毒灭活方法，具有安全、快速和高效的特点；低pH法仅适用于对酸不敏感的样品，一般需要较长的灭活时间。
神经生长因子(NGF)是神经营养因子中最早被发现，目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。神经生长因子在人体内主要分布于脑、神经节、虹膜、心脏、脾、胎盘等组织及成纤维细胞、平滑肌、骨骼肌、胶质细胞、雪旺氏细胞等，其他制备来源有雄性小鼠颌下腺、牛精浆、蛇毒、豚鼠前列腺等，其中来源小鼠颌下腺的鼠神经生长因子与人类NGF有90％同源性。
自2003年以来，国家对生物提取产品增加了病毒灭活/去除的要求。在中国专利CN1752102A中，公开了采用S/D法制备鼠神经生长因子的工艺，虽然可以有效灭活潜在病毒，但是该处理方法需要在一定温度范围内处理4～6小时，对产品收率有影响，且有机溶剂/去污剂的去除较为麻烦。
因此，尚缺乏一种能安全、快速和高效的对神经生长因子病毒灭活的方法。
发明内容
因此，本发明的目的在于，提供一种神经生长因子的病毒灭活方法。
本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供一种神经生长因子的病毒灭活方法，该方法采用辛酸钠进行病毒灭活。
优选地，所述方法中辛酸钠进行病毒灭活的条件为：辛酸钠浓度0.2-0.4％，pH为5.0±2，温度为20-30℃，时间为60-120分钟；更优选地，辛酸钠浓度为0.3％，pH为5.0±1，温度为25℃，时间为90分钟。
优选地，所述方法还包括辛酸钠的去除步骤；更优选地，所述辛酸钠的去除采用透析的方法。
优选地，所述透析条件为：在注射用水中，2～8℃充分透析24小时。
本发明所提供的神经生长因子的病毒灭活方法，包括以下步骤：1)制备神经生长因子中间体；2)采用辛酸钠对步骤1)所制备的神经生长因子中间体进行病毒灭活处理；3)去除步骤2)中的辛酸钠。
优选地，所述神经生长因子包括鼠神经生长因子、人神经生长因子、牛神经生长因子、蛇毒神经生长因子，优选为鼠神经生长因子。
另一方面，本发明提供上述方法制备的神经生长因子，优选为鼠神经生长因子。
又一方面，本发明提供辛酸钠在神经生长因子病毒灭活中的用途。
再一方面，本发明提供一种病毒灭活溶液，该溶液为辛酸钠溶液，其浓度为0.2-0.4％。
还一方面，本发明提供所述的病毒灭活溶液在对于神经生长因子进行病毒灭活中的用途。
由此可见，本发明人根据各种病毒灭活方法的特点，选择辛酸钠法对神经生长因子进行病毒灭活，即在NGF中间体中加入0.3％的辛酸钠，pH调整为5.0±1，室温下培养90分钟，再通过透析去除辛酸钠。
综上所述，本发明提供了独有的病毒灭活工艺，从而保障了临床用药的安全性。辛酸钠法是新发展的病毒灭活方法，具有安全、快速和高效的特点，在PH5.0±1时，室温下0.3％的浓度仅需要数分钟即可杀灭多数脂包膜病毒。经检验，本发明病毒灭活工艺处理的鼠神经生长因子对伪狂犬病毒(PRV)和Sindbis病毒的下降滴度均大于4Logs，10分钟后二种指示病毒均被灭活到最小的检测水平以下；同时第60、90分钟的样品进行盲传三代，均未检测出病毒。鼠神经生长因子蛋白的质量，包括比活、纯度等，与未灭活原液相比，无明显差异。对在-30℃冰箱中贮存6个月的样品进行检验，也表明蛋白质量稳定。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为实施例3中未灭活和灭活原液的电泳纯度扫描图谱，其中图1A和图1B为未灭活原液，图1C为灭活原液。
图2为实施例3中未灭活和灭活原液的等电点照片，其中图2A为未灭活原液，图2B为灭活原液。
图3为实施例4中不同批号未灭活原液的活性照片，其中图3A为20051101，图3B为20051001，图3C为20051102。
图4为实施例4中不同批号灭活原液的活性照片，其中图4A为20051101-1，图4B为20051001-1，图4C为20051102-1。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明所提供的神经生长因子的病毒灭活方法进行详细说明。
实施例1
本实施例为本发明所提供的神经生长因子病毒灭活的工艺路线及具体操作步骤，详细如下。
工艺路线：
小鼠颌下腺→匀浆、离心→CM柱I纯化→解聚→离心→CM柱II纯化→病毒灭活→透析→浓缩→柱III纯化→原液
具体操作步骤如下：
(1)mNGF中间体的制备：将小鼠颌下腺加入缓冲液，用组织破碎机破碎匀浆，得匀浆液，于4℃，8000rpm离心30分钟去沉淀后，所得上清液上离子交换柱纯化，用0.05M醋酸钠缓冲液平衡离子交换柱(CM柱I)，充分平衡后，将上清液以线速度≤60cm/小时的速度上样，再以平衡液洗脱，收集A280＞0.5的流穿液。流穿液中加入醋酸在酸性条件下解聚，4℃，8000rpm离心30分钟，收集上清液。用0.05M醋酸钠缓冲液充分平衡离子交换柱(CM柱II)，上清液以线速度≤60cm/小时速度上柱，用平衡液洗脱弃杂蛋白，用0.05M Tris-HCl缓冲液洗脱弃杂蛋白，最后以含0.4M NaCl的0.05M Tris-HCl缓冲液洗脱，收集峰样，得到mNGF中间体；
(2)mNGF中间体的病毒灭活处理：在步骤1)所制备的mNGF中间体中，加入0.3％的辛酸钠，pH调整为5.0±1，室温25℃灭活90分钟，再通过透析去除辛酸钠，透析液再经分子筛柱(柱III)层析分离，制得mNGF原液。
实施例2
本实施例为对实施例1所制备的mNGF原液进行病毒灭活效果验证。
经实验认证，辛酸钠法对伪狂犬病毒(PRV)和Sindbis病毒的下降滴度均大于4Logs，10分钟后二种指示病毒均被灭活到最小的检测水平以下；同时对辛酸钠法第60、90分钟的样品进行盲传三代，均未检测出病毒。
实施例3
本实施例为对实施例1所制备的mNGF原液进行蛋白质量对比研究。
未灭活mNGF原液批号：20051001、20051101、20051102
灭活mNGF原液批号：20051001-1、20051101-1、20051102-1
mNGF蛋白的比活、纯度和等电点(具体检验方法见《(中国药典)》)对比：取贮存周期为0个月的样品，按规定进行检验。结果见表1。电泳纯度扫描图谱见图1，等电点照片见图2。
表1病毒灭活mNGF原液与未灭活mNGF原液的检验结果
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结论：以上检验结果表明，经灭活mNGF原液的蛋白质量与未灭活mNGF原液相比，无明显差异。
实施例4
本实施例为对实施例1所制备的mNGF原液进行蛋白稳定性对比研究。
在规定的储存条件下，考察病毒灭活原液与未灭活原液的纯度和比活性，以此来表明其稳定性变化情况。
未灭活mNGF原液批号：20051001、20051101、20051102
灭活mNGF原液批号：20051001-1、20051101-1、20051102-1
取贮存在-30℃，贮存周期分别为0个月、1个月、2个月、3个月、6个月的未灭活和灭活样品，对蛋白电泳纯度、比活等项目按规定进行检验。
未灭活mNGF原液的结果见表2。活性照片见图3。
表2未灭活mNGF原液的检验结果
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灭活mNGF原液的结果见表3。活性照片见图4。
表3灭活mNGF原液的检验结果
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结论：以上检验结果表明，在-30℃冰箱中贮存6个月，经灭活mNGF原液与未灭活mNGF原液的蛋白电泳纯度、比活都无明显变化，二者相比也无明显区别，稳定性一致。