一种分子标记、 免疫保护性能增强的结核杆菌弱毒疫苗及 构建方法 技术领域 本发明提供了一种分子标记、 免疫保护性能增强的结核杆菌弱毒疫苗， 本发明还 公开了上述疫苗的构建方法， 属于分子生物学技术与免疫疫苗生产技术领域。
背景技术 近几年， 结核病发病率， 与死亡人数趋年攀升。该病唯一的弱毒活疫苗 ( 以下简 称： BCG) 是用牛结核杆菌在其不适培养基上连续培养 200 多代而成。在这个过程中， BCG 的 亲本株大部分毒力基因发生了钝化， 使 BCG 毒力相对减弱， 但是， 同时也把 BCG 的保护性基 因失去了活力， 致使 BCG 的保护性能低下 ( 成年人仅有 30％ )。
牛结核病的检测， 在我国主要靠血清学变态反应 (GB/T 18645-2002)， 该检测方法 人为操作因素大， 主要靠眼观， 主观因素较多， 误差较高。
BCG 的一个缺陷是接种 BCG 后的人与动物， 使用现有的检测方法很难从野毒感染 的人与动物中区分开。对流行病学调查， 疫源的布控带来了严重的干扰。所以， 研制出高保 护性的 BCG， 建立起能区分野毒感染与接种 BCG 的检测方法， 具有重要的现实意义。
发明内容 本发明提供了一种分子标记、 免疫保护性能增强结核杆菌弱毒疫苗， 是对 BCG 加 以分子标记， 拯救出的 BCG 免疫保护性 30KD 基因的活性， 增加其免疫保护性。
本发明还公开了该疫苗的构建方法， 克隆出结核杆菌的与 BCG 差异免疫性基因， 并表达出差异免疫原性蛋白， 以差异免疫原性蛋白为抗原， 建立起结核病快速诊断免疫胶 体金检测方法。
本发明的分子标记、 高免疫保护性的结核杆菌弱毒疫苗， 特征在于 ：
该疫苗是将结核杆菌外分泌免疫保护基因 30KD 替换其亲本株 BCG 的 MPT64 基因， 对其加以 MPT64 基因分子标记。
本发明结核杆菌弱毒疫苗的构建方法， 包括以下步骤 ：
以结核杆菌的弱毒疫苗株 BCG 为起始材料， 以 PCR 的方法从标准结核杆菌毒株的 基因组中扩增出要改造的目的基因 MPT64 的引导序列， 并把它克隆到 T 载体上， 进行基因改 造； 把经改造的引导序列克隆到 pBluescript SK+ 上而成重组质粒 ； 用同样的方法得 到结 核杆菌免疫保护性基因 30KD 的引导序列， 克隆到 T 载体上， 进行基因改造， 并把它连接到 pBluescript SK+ 重组质粒 ；
用电转化法把这两个自杀性质粒依次转入结核杆菌 BCG 中， 转入受体菌细胞内的 超螺旋的自杀质粒便会被线性化， 插入受菌体 BCG 的基因组中， 线性化的质粒与 MPT64 基因 发生置换， 即得疫苗。
本发明的具体构建方法主要包括以下步骤 ：
(1) 以结核杆菌弱毒疫苗基因组为模板， 设计引物， 用 PCR 的方法， 扩增出分子标
记目标基因与免疫保护基因的同源重组引导序列， 而后克隆到 T 载体上对目标基因改造 ；
(2) 用 (1) 得到的基因片段构建成同源重组载体 ( 自杀性质粒 ) ；
(3) 使步骤 (2) 得到的重组载体转化到 BCG 中去， 得到本发明的 BCG 基因突变 ；
本发明用 PCR 的方法扩增出 MPT64 基因， 连接到到 pET-28a 上， 转化到大肠杆菌 BL21 中， 用 IPTG 诱导、 高效表达出带有 His-tag 标签的融合蛋白 MPT64 蛋白。
本发明的积极效果在于 ： 使用基因定向改造的技术， 定向的改造已经沉默的 BCG 免疫保护性基因， 以提高 BCG 的免疫保护性。提供的结核杆菌弱毒疫苗具有分子标记、 免疫 保护性能增强的特点， 用血清学检测方法就能区分感染的人与动物是疫苗接种还是野生菌 感染 ； 该疫苗免疫保护性能较亲本株强。这对结核杆菌病监测、 诊断、 净化和控制具有重要 意义， 具有广泛的应用实践价值。 附图说明 图 1、 在基因打靶引诱序列上， 用 PCR 方法从△ BCG 基因组中扩赠出 30KD 在内的基 因片段电泳图。
图 2、 MPT64 在大肠杆菌中得到表达， 并纯化， 第 1 电泳道是 Marker， 2 是少量盐洗 脱， 3、 4、 5 是依次纯化的蛋白电泳图。
具体实施方式 下列实施例旨在进一步举例说明， 而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解 到， 在不背离本发明的精神和原则的前提下， 对本发明的任何平行改变和改动都将落入本 发明的待批权利要求范围内。
实施例 1
一、 同源重组载体 ( 自杀性质粒 ) 的构建
1 材料与方法
1.1 菌株、 质粒、 载体 结核杆菌标准毒株、 DH5a、 T-sacB， pBluescript SK+ 本研 究室保存 ； pMD18-T simple vector 购自 TakaRa 公司。
1.2 试剂 限制性核酸内切酶、 T4DNA 连接酶、 DNA 聚合酶 I(Klenow 大片段 )， 大 肠杆菌 DNA 聚合酶 I， LA-Taq DNA polymerase、 1kbp DNA Ladder Marker、 质粒 DNA 提取试 剂盒、 DNA 凝胶回收试剂盒均为 TaKaRa 公司产品。
1.3PCR 扩增
1.3.1 含有 MPT64 基因同源重组指导序列的扩增 根据 MPT64 基因的序列以及 pMD18-Tsimple vector 和 pBluescript SK Ⅱ (+) 载体特点， 设计引物从结核杆菌的基因组 中扩增目标基因。
1.3.2 含有结核杆菌 30KD 基因同源重组指导序列的扩增 设计引物。 从结核杆 菌 BCG 的基因组中扩增。
1.3.3sacB 基因的扩增 分别设计 5′端含有限制性内切酶 BamH I 的上游引物 与含有 Sal I 酶切位点的下游引物。以质粒 pIP279 为模板， 扩增 sacB 基因。
1.4 自杀性质粒的构建
1.4.1 含有 MPT64 基因同源序列自杀质粒的构建 把 1.4.1 中的扩增出的长
度的基因片段 ( 其中包含 MPT64 基因 )， 与 pMD18-T 相连得到重组质粒。把 1.4.4 扩增 出 sacB 基因片段与 pMD18-T 相连而成重组质粒 pSacB。再用限制性内切酶分别消化质粒 pBluescriptSK Ⅱ (+) 与上述重组质料， 并把 MPT64 片段与线性化的 pBluescript SK Ⅱ (+) 相连而成重组质粒 pBluescript-MPT64。 再用限制性内切酶 BamH I 与 Sal I 分别消化重组 质粒 pBluescript-MPT64 与 pSacB， 并把 sacB 基因片段与连接到线性化的 pBK-MPT64 而成 最终自杀质粒。
1.4.2 含有结核杆菌 30KD 基因同源序列自杀性质粒 pBBs 的构建把 1.4.2 中的扩 增出的的基因片段 ( 其中包含结核杆菌 30KD 基因 )， 与 pMD18-T 相连得到重组质粒 p-30KD。 并 把 的 p-30KD 用 内 切 酶 消 化 它， 凝 胶 回 收 目标 片 段， 使 之 与 用 消 化 过 的 pBluescript SK Ⅱ (+) 相连而成重组质粒 pB-30KD。再用限制性内切酶分别消化重组质粒 pB 结核杆菌 30KD 与 pSacB， 并把 sacB 基因片段与线性化的 pB-30KD 相连而成自杀质粒。
2 结果
从结核杆菌 BCG 株基因组扩增出含有 MPT64 基因在内的基因片段， 凝胶纯化后待 用； 从结核杆菌基因组扩增出含有结核杆菌 30KD 在内的基因片段， 凝胶纯化后待用 ； 从质 粒 pSP-Luc NF+ 扩增出 1700bp 大小的 Luc NF+ 基因片段， 凝胶纯化后待用 ； 从质粒 pIP279 扩增出 1400bp 大小 sacB 的基因片段， 凝胶纯化后待用。它们经琼脂糖电泳验证， 均可观察 到与理论值大小相符条带。
几个主要的重组质粒酶切电泳鉴定 pBb26 经 XhoI 单酶切， 电泳带与预期值相符 ； p-30KD 经 Xba I 单酶切， 电泳与预期值相符 ； pBK-MPT64 单酶切， 在 12000bp 左右有一条带， 与预期值相符。
二、 结核杆菌分子标记、 免疫保护基因疫苗株△ BCG 的构建
1.1 试剂 萤光素酶检测系统购自 Promega 公司， 其它试剂同上。
1.27H10 培养基 按照说明书配制后， 高压灭菌后备用。
1.3 电转化
1.3.1 感受态的制备 取 240mL 对数生长前中期 (OD600 ＝ 0.15) 结核杆菌液体 培养物放入预冷的 250mL 离心管中， 迅速将培养物置于冰水混和物中 40min， 不时的缓慢摇 匀保证内容物充分冷却。 然后 4℃ 1200×g 离心 15min， 回收细胞， 倒去培养液， 用冰冷 10％ 的丙三醇重悬沉淀， 以 1000×g 离心 15min 洗涤细胞 3 次。最后用 3mL 10％的丙三醇重悬 沉淀制成感受态。
1.3.2 电转化操作步骤 取 0.5μg 自杀质粒加入 100μL 上述制作的结核杆菌 电转感受态中混匀， 加入电击杯中， 以 E ＝ 13kv/cm 电击， 然后立即加入 37℃预热的 1mL 的 培养基中。放入生化培养培养 48h。取出 200mL 涂布于含有筛选标记的琼脂平板上， 12d 后 筛选出重组子， 挑选出单菌落， 进一步培养鉴定。
1.4 同源重组子的筛选
1.4.1 单交换子的筛选 把电转化受体菌涂布在含有筛选标记 (Amp 100mg/L， Kan50mg/L) 的琼脂平板上， 因同源重组载体上带有筛选标记基因， 所以很容易的筛选出单 交换子。
1.4.2 双交换子的筛选 将获得的同源重组单交换子液体培养 3d， 适当稀释， 涂布于添加 5％蔗糖的肝汤培养基平板上， 37℃培养 12d。所得细菌命名为△ BCG 菌株—即为改造的 BCG 菌株。
2 结果
2.1PCR 法法验证同源载体插入 BCG 染色体上与△ BCG 双交换子正确性， 用 PCR 方 法分别从 BCG、 同源载体插入后的 BCG、 △ BCG 的基因组中分别扩增出不同片段。
2.2PCR 方法验证改造后的结核杆菌 30KD 基因在△ BCG 双交换子的正确性用 PCR 方法分别从 BCG 基因组中扩赠出包含结核杆菌 30KD 在内的基因片段。证实△ BCG 基因改 造 成功见图 1。
三、 结核杆菌 MPT64 蛋白基因的克隆、 表达及纯化
结核杆菌 MPT64 蛋白是一种具有强免疫原性的分泌蛋白。它由细胞内向外释放， 具有可溶性， 相对于固定的外膜蛋白易于检测。本发明克隆了结核杆菌的 MPT64 蛋白基因， 并进行了表达， 表达产物通过亲和层析进行了纯化。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与、 质粒、 载体
结核杆菌 BCG、 大肠杆菌 DH5a、 大肠杆菌 BL21 和 pET28a+ 本研究室保存。 1.1.2 限制性内切酶及其它试剂
限制性内切酶 NdeI、 EcoRI、 SacI、 Hind Ⅲ、 Sal I 和 T4DNA 连接酶均购自 TaKaRa 公司。DNA 回收试剂盒同第一章 ； 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体购自鼎国生物公司 ； RNase 购于华美生物工程公司 ； IPTG 及 TMB 购自 Sigma 公司 ； PVDF 膜为 Millipore 公司 产品 ； 丙烯酸胺、 双甲基丙烯酞胺、 低分子量蛋白 Marker 购自 TaKaRa 公司 ； 结核杆菌阳性 牛血清本室研制， 辣根过氧化物酶标记兔抗羊 IgG 购自鼎国生物公司 ； 金属鳌合层析介质 Sepharose-4-B 购自 Pharmacia 公司。
1.1.4 主要试剂的配制
1.1.4.1SDS-PAGE 试剂
30％ (w/v)Acrylamide100mL ： 称取 29g Acrylamide 1g BIS 置于 100mL 烧杯中， 加入约 80mL 的去离子水后， 加热使之溶解， 加去离子水将溶液定容至 100mL， 用 0.45μm 过 滤膜过滤除杂质， 于棕色瓶中 4℃保存。
1.5mol/L(pH8.0)Tris-HCl 缓冲液 ： 18.17g Tris 加入 90mol/L dH2O 使之溶解， 用 浓 HCl 调 pH 值至 8.0， 最后加 dH2O 定容至 100mL ；
1.0mol/L(pH 6.8)Tris-HCl 缓冲液 ： 2.11g Tris 加入 90mL dH2O 使之溶解， 浓 HCl 调 pH 值至 6.8， 最后加 dH2O 定容至 100mL ；
10％ SDS ： 称取电泳级 SDS 10g， 加入 90mL dH2O 使之溶解， 调 pH 值至 7.2， 最后加 dH2O 定容至 100mL ；
10％ (w/v) 过硫酸胺 1mL ： 称取 100g 过硫酸胺， 加入 1mL 的去离子水后， 充分搅拌 溶解， 于 4℃保存， 不宜久放 ；
10× 电极缓冲液 ： 3g Tris、 14.4g 甘氨酸、 1g SDS， dH2O 定容至 1000mL ；
2×SDS 上样缓冲液 ： 2.0mL 甘油、 1mL 2- 巯基乙醇、 0.6g SDS、 1.0mL 1％溴酚蓝、 2.5mL 1.0mol/L pH 6.8Tris-HCl， dH2O 定容至 10mL ；
考马斯亮蓝 R-250 染色液 ： 称取 1g 考马斯亮蓝 R-250， 置于 1000mL 烧杯中， 加入
250mL 的异丙醇， 100mL 冰醋酸， 650mL 去离子水后， 充分搅拌溶解， 过滤除去颗粒物质后， 室 温保存 ；
脱色液 ： 量取 50mL 的乙醇、 100mL 冰醋酸、 850mL 去离子水， 置于 1000mL 烧杯中， 充 分混合后待用。
1.1.4.2Western blot 检测试剂
转移缓冲液 ： 甘氨酸 2.9g、 Tris base 5.8g、 SDS 0.37g、 甲醇 200mL， 调 pH8.3 加 水至 1000mL ；
封闭液 ： 含 3％ BSA 的 TBS ；
洗涤液 ： TBST(0.05％ Tween-20) ： 称取 8.8g NaCl， 加入于 800mL 去离子水， 充分溶 解后， 加入 20mL pH 8.01.0mol/LTris-HCl、 0.5mL Tween20， 定容至 1000mL。
1.1.5 培养基
LB 液体培养基 ： 在 950ml dH2O 中加入细菌培养用胰蛋白胨 10g， 细菌培养用酵母 提取物 5g， NaCl 10g， 完全溶解后用 5mol/L NaOH 调节 pH 值至 7.0， 加入去离子水至总体积 为 1L， 121℃高压下蒸汽灭菌 20min， 4℃保存。LB 固体培养基 ： 在 1L LB 液体培养基中加入 30g 的琼脂粉， 高压灭菌。 1.2 方法
1.2.1 目的基因的扩增与克隆
根据 MPT64 基因的序列以及 pMD18-T simple vector 和 pET28a+ 表达载体的特点 分别设计两端含有限制性内切酶 Nde I、 Sal I 酶切位点的引物 ：
用 PCR 的方法从 BCG 基因组中扩增出 MPT64 基因片段。回收 PCR 产物， 与 pMD18-T simple vector 相连构建重组质粒 pMDMPT64， 重组质粒 pMDMPT64 送上海生工生物公司进行 测序。1.2.2 重组表达质粒 pETMPT64 的构建、 表达质粒转入 BL21 表达菌用限制性内切酶 Nde I 与 Sal I 同时消化 pMDMPT64 与 pET28a+， 分别凝胶回收纯化 MPT64 与 pET28a+ 基因 片段。用 T4 连接酶使之联接， 构建重组质粒 pETMPT64。
将质粒快速转化受体菌， 用涂布棒均匀涂布菌液， 至平板表面的菌液被全部吸收。 37℃孵箱过夜培养。
1.2.3 融合蛋白 MPT64-His 的表达。
取单个转化菌落接种到 3ml 含有卡那霉素 (50ug/mL) 的 LB 培养液中。加入 IPTG 至终浓度 1mmol/L 进行诱导， 37℃继续震荡培养。4h 后， 收集菌体。
1.2.4Western-blot 免疫鉴定
把硝酸纤维素滤膜漂浮于一盘去离子水中， 借毛细作用使之从下往上湿润后， 将 之浸没于水中， 浸泡 5min 以上以驱除留于滤膜上的气泡。把 PVDF 膜放在滤纸上， 要保证精 确对齐， 而且在 3mm 滤纸与硝酸纤维素滤膜之间并不留有气泡。将阴极放于滤纸上， 石墨一 边朝下。接电源 ( 将阳极导线接于底部石墨电极 )。
按 0.1mL/cm2 的量加入第一抗体。将滤膜平放在平缓摇动的摇床上， 于 4℃温育 2h。用 50mlTBST 洗涤 3 次， 每次 10min。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 抗体 (1 ∶ 5000 稀释 )， 于室温平缓摇动 2h。用 50mlTBST 洗涤 4 次， 每次 10min。加入 0.4mlTMB 显色至目的条带清晰， 加蒸馏水终止反应。
1.2.7 亲和层析纯化重组蛋白
1.2.7.1 菌体的裂解
每 克 菌 ( 湿 重 ) 加 入 3ml 裂 解 缓 冲 液 (pH7.920mmol/L Tris-HCl， 5mmol/L imidazole， 0.5mmol/L NaCl)， 重悬细菌沉淀。 按每毫升裂解缓冲液加入 10μl MgSO4(1mol/ L)， 10μlDnase(2mg/mL)， 2μl PMSF(50mmol/L) 的 比 例， 加 入 上 述 三 种 试 剂， 冰上孵育 30min 5000 转离心 15min 收集沉淀， 按每克菌湿重加入 5ml 结合缓冲液的比例， 将沉淀用结 合缓冲液重悬， -70℃放置过夜。 将 -70℃放置的菌液冰上融化后， 超声破碎菌体。 5000rpm， 4℃离心 15min， 收集上清。-70℃保存或立即用于纯化。
样品的吸附与洗涤 ： 将待纯化的样品加到金属鳌合的柱中， 并以最佳流速让其流 过柱床。用洗涤缓冲液洗柱， 一直到流出样品的紫外监测值为基线水平。
2 结果 ： MPT64 在大肠杆菌中得到表达， 并纯化。纯化的蛋白质量见图 2。
实验例 1
△ BCG 分子标记功能的验证
△ BCG 分子标记功能是本发明的主要目的所在， 为了进一步验证本发明的正确 性， 设计实验， 验证本发明。 用结核杆菌与△ BCG 接种小鼠实验， 初步建立了这一诊断方法。
1 材料与方法 1.1 材料
1.1.1 菌株
结核杆菌本研究室保存 ； △ BCG 见上述。
1.1.2ELISA 试剂配制 ：
(1) 包被液碳酸盐缓冲液
Na2CO3( 无水碳酸钠 )1.6g， NaHCO3( 碳酸氢钠 )2.9g， 加去离子水至 1000mL。
(2) 洗涤液 pH9.2 磷酸盐缓冲液 (Tween-20)
Na2HPO4 12H2O 2.9g， KCl 0.2g， KH2PO4 0.2g， NaCl 18g， 吐温 -20 0.5mL 加去离子 水至 1000mL
(3) 甲 液 0.1mol/L 柠 檬 酸 4.2g/200mL， 乙 液 0.2mol/L Na2HPO4·12H2O 14.3g/200mL， 取甲液 24.3mL 与乙液 25.7mL 混合， 临用前加 20mg 邻苯胺 (OPD)， 加过氧化氢 (H2O2)0.02mL。
(4) 终止液 2mol/L H2SO4 溶液取分析纯浓硫酸 110mL， 加去离子水至 100mL。
1.1.3 实验动物
昆明鼠购自长春市生物制品所
1.2 方法
1.2.1 结核杆菌接种小鼠前的处理
用 PBS 洗 6 次， 然后用生理盐水稀释到 5000 株 /mL。
1.2.2 实验小鼠的接种
把布鲁菌结核杆菌与△ BCG 培养到对数生长期， 用生理盐水洗涤三次 ； 用生理盐 水稀释到目的浓度 ； 对小鼠采用腹腔注射。
1.2.3 被检动物血清的制备
对用结核杆菌与△ BCG 免疫 14 天的小鼠断尾采血， 血样在 37℃放置 3 个小时后， 取上清即为制备血清。
1.2.4 检测方法
(1)ELISA 检测 ： 按常规方法进行， 将纯化的目的蛋白稀释到 10ng/mL 后包被酶标 板， 用被检动物血清 1 ∶ 300 稀释作为一抗， 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG 1 ∶ 3000 稀释作为二抗。同时用标准阴性和标准阳性血清作对照。
(2) 操作过程 ： 用微量移液器向每个孔内加 100μL 包被液稀释的蛋白样品， 置湿 盒内于 37℃恒温培养箱中 1h， 然后于 4℃冰箱中包被过夜。次日， 用洗涤液洗涤二次， 甩去 洗涤液， 倒置在纱布上轻轻拍扣使孔内的液体充分流出， 每次间隔 3min。向孔内分别加入 用稀释液稀释好的 1 ∶ 100 阳性血清、 阴性血清 0.1mL， 置湿盒内于 37℃恒温箱中 反应 1h 后， 甩去血清， 用上面的方法洗涤 3 次， 再加入稀释好的 1 ∶ 200 酶标记兔抗牛 IgG 0.1mL， 置于湿盒内于 37℃恒温箱静置， 甩去残留的酶标记物溶液， 以同法洗涤三次。 加入底物溶液 100μL/mL， 置湿盒内于 37℃恒温箱中静置 30min， 取出后立即向孔内加入 0.02mL 终止液， 终止反应。
(3) 结果判定 ： 将培养板放入分光光度计读取 450 吸收波的 OD 值。 2 结果 ： 用 MPT64 蛋白区分接种结核杆菌与△ BCG 菌体的小鼠
将纯化的 MPT64 蛋白作抗原， 用 ELISA 法检测结核杆菌与△ BCG 接种 7d 的小鼠血 清中是否含有 MPT64 蛋白的抗体， 很易容区分结核杆菌和△ BCG 接种的小鼠。具体数具见 表 1。
表 1 结核杆菌与△ BCG 接种小鼠后 ELISA 检测血清结果
实验例 2、
△ BCG 免疫保护性鉴定
理论上讲， △ BCG 的免疫保护性比一般的 BCG 强。本发明以小鼠为实验动物， 接种 相同剂量的△ BCG 与 BCG， 而后攻入标准毒株， 而后检测观察小鼠的临床症状及最小致死数 量， 比较分析了它们的免疫保护性强弱。
1 材料与方法
1.1 细菌的处理
用无菌生盐水洗三次， 再分别稀释到每 mL 5 亿、 1 千万、 1 百万个菌。
1.2 接种小鼠的症状观察
取 1 万△ BCG 与 BCG 菌体接种的小鼠， 14 天后， 用标准毒株攻毒， 分别观察接种后 2d、 5d、 8d 小鼠的临床表现和死亡情况， 以此分析△ BCG 与 BCG 免疫保护性。2 结果 ： △ BCG 与其亲本株 BCG 相比， 免疫保护性明显增强。具体数据见下表 2。
表2