明胶酶 A 抑制性多肽的修饰物的应用 技术领域 本发明涉及一种明胶酶 A 抑制性多肽 (M205C4)， 具体涉及一种明胶酶 A 抑制性多 肽 (M205C4) 的修饰物的应用。明胶酶 A 抑制性多肽的修饰物， 简称为 M205C4-PEG。
背景技术 局部侵袭和远处转移是恶性肿瘤的主要生物学特征， 也是导致肿瘤患者较高死亡 率的主要原因。目前的研究认为在肿瘤的侵袭、 转移过程中， 细胞外基质 (extracellular matrix， ECM) 的破坏是关键环节。在参与破坏细胞外基质的酶类中基质金属蛋白酶类 (matrix metalloproteinases， MMPs) 是最重要的蛋白水解酶， 尤其是 MMP2、 MMP9 在癌细 胞侵袭转移过程中不仅可以酶解细胞间基质成分， 还能酶解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原。 所以设计寻找针对 MMPs 拮抗药物就尤为重要。目前已有人工合成的 MMPs 抑制物， 如： Marimastat、 Batimastat、 Mtastat、 BAY12-9566、 AG-3340、 CGS-27023A 和 SC-204092 等， 正 在进行不同阶段临床试验。虽然这类小分子化合物可以有效抑制基质金属蛋白酶的酶解 作用， 但同时所产生的细胞毒作用会给试用者带来强烈的副作用。由此研究人员把目光转 向了基质金属蛋白酶类的组织抑制因子 （tissue inhibitors of metalloproteinases , TIMPs） 家族。TIMPs 的主要功能是天然地抑制 MMPs 的活性， 在调节细胞外基质的代谢中起 到了重要作用。其中 TIMP-1 被认为是组织中 MMPs 活性主要调节者， 控制着大多数的 MMPs 家族成员。 然而 TIMPs 对肿瘤却是把双刃剑， 一方面， 通过对抗 MMPs 蛋白的水解作用抑制肿 瘤的浸润。但肿瘤也需要对抗自身的过度水解， 所以 TIMPs 对肿瘤生长同样是必须的。另 外， 还对肿瘤细胞增殖、 凋亡、 血管形成等方面起到了关键作用， 因此对肿瘤的发展具有双 向性。因此寻找结合了小分子化合物和 TIMPs 蛋白优势的新型药物是我们的研究重点。
多 肽 类 药 物 具 备 高 效、 低 毒 和 特 异 性 强 的 显 著 性 优 势。M205C4 是 通 过 噬 菌 体展示技术筛选的特异性 MMP2 抑制性结合肽， 拮抗作用完全模拟了 TIMPs 对 MMPs 活 性调节的方式， 可以有效的抑制肿瘤细胞的侵袭转移并于 2006 年成功报批国家专利 （ZL200610085779.7） 。经后期实验证明， M205C4 对多种肿瘤细胞的生长及血管新生没有明 显的促进作用， 符合我们的新药筛选标准。 但同时也存在肽类药物在体不稳定、 易降解的问 题， 无法使药物在体发挥其特有的生物学活性。而对于药物的修饰同时要考虑到其自身空 间结构改变所导致的活性变化和体内代谢行为两个重要因素以外， 修饰的工艺化问题也是 不容忽视的。所以修饰及其制备方法的选择对于药物的后期研究至关重要。
发明内容 发明目的 ： 针对现有技术中的不足， 本发明的目的是提供一种 M205C4 的修饰物的 应用， 修饰后药物保留了原有生物学活性的同时， 降低了免疫原性， 延长了其在生物体内的 半衰期。
技术方案 ： 为了实现上述发明目的， 本发明采用的技术方案为 ： 一种明胶酶 A 抑制性多肽的修饰物， 为 mPEG-sc 对多肽 M205C4 组氨酸氨基端的单点修
饰产物， 结构式为 ， 分 子 量 为 11000~13000 ；结 构 式 中， HNWTRWLLHPDRGGGS 为多肽 M205C4 的氨基酸序列。 明胶酶 A 抑制性多肽的修饰物的修饰方法， 包括以下步骤 ： （1） 按摩尔比为 1:1~5 分别称取 M205C4 和 mPEG-SC， 定溶于 pH5.0-8.0 的 PBS 缓冲液 中， M205C4 的反应浓度为 100 uM ； 在静音混合器上， 4℃反应 2.5h 以上， 制得 M205C4-PEG 混 合液 ； （2） 采用 SunfireTM C18 OBDTM 制备色谱柱对步骤 （1） 制得的 M205C4-PEG 混合液进行 液相分离和浓缩， 制得浓缩液 ； 对浓缩液进质谱检测， 纯度及分子量符合标准后， 将浓缩液 分装至 2ml EP 管中， 在液氮中过夜保存 ； （3） 将过夜保存在液氮的制备样品放入冻干仪中浓缩至冻干粉末， 即可。
步骤 （1） 中， 优选 ： 按摩尔比约为 1:3 分别称取 M205C4 和 mPEG -SC， 定溶于 pH7.4 的 PBS 缓冲液中， M205C4 的浓度为 100 uM ； 在静音混合器上， 4℃反应 3h。
为 mPEG 的 结 构 式，上述的明胶酶 A 抑制性多肽的修饰物在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。
有益效果 ： 本发明的明胶酶 A 抑制性多肽的修饰物的应用， 克服 M205C4 活性肽的 稳定性差和体内代谢快的不足， 其具有活性高、 稳定性好、 半衰期长等优点， 并且在胰腺癌 动物模型中发挥了良好的抗肿瘤作用， 为其在人体的治疗应用提供了重要基础和保证。
附图说明 图 1 是 M205C4 和 M205C4-PEG 的色谱图及质谱图。A、 B、 C 和 D 图均为色谱图， E图 为质谱图。
图 2 为基质金属蛋白酶 II 酶活检测实验结果图。P 图为修饰后的结果图， Q 图为 未修饰的结果图。
图 3 是 ICR 小鼠的药代动力学检测结果图。I 图式修饰后的结果图， II 图是未修 饰的结果图。
图 4 是比格犬实验中药物经修饰后提高了药代动力学行为检测结果图。G 图式修 饰后的结果图， F 图是未修饰的结果图。
图 5 是给药干预 45 天后测量各组原位肿块 （PNAC-1） 大小的结果图。
图 6 是给药干预后部分改善了肿瘤细胞侵袭所致的肝功能异常结果图。H 图是天 门冬氨酸氨基转移酶 （AST） 测定结果图， K 图是丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 测定结果图。
图 7 是两种胰腺癌细胞株原位荷瘤鼠的生存曲线结果图。 M 图是腺胰癌 PANC-1 细 胞株， N 图是腺胰癌 CFPAC-1 细胞株。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。
以下实施例所使用的方法和药品具体如下 ：M205C4 活性肽为在中国专利 ZL200610085779.7 公开的活性肽， 由上海吉尔生化公司 合成， mPEG-SC（10KD） 购于北京键凯公司。
SDS-PAGE 电泳法 ： 将所要检测的样品与 4× 非还原性上样缓冲液按 3:1 的体积比 混合， 室温放置 15 分钟后进行电泳。胶体共分为 3 层， 上层为浓缩胶 （4%） ， 中层为间隔胶 （10%） ， 下层为分离胶 （16%） 。 首先采用 80V 恒压进行电泳， 待样品全部进入浓缩胶并压缩成 直线后， 改用 120V 恒压继续进行电泳。电泳结束后， 将胶体浸入固定液 （50% 甲醇 +10% 乙 酸） 中， 室温浸泡 30 分钟后置于染色液 （10% 乙酸 +0.025% 考马斯亮蓝 R250） 中， 室温下染 色过夜， 将胶体转入脱色液 （10% 乙酸） 中， 室温脱色至样品条带清晰为止。 用 BIO-RAD 凝 胶成像系统 Universal Hood Ⅱ对凝胶进行成像。
冻干仪 ： FreeZone（2.5L） ， 购于 LABCONCO 公司 ； 其他没有药品和设备均为市售药品或常用药品和设备。
实施例 1 单修饰 M205C4-PEG 的制备 用分析天平分别精密称取 M205C4 和 mPEG-SC 干粉 1mg 及 15mg( 摩尔比约为 1:3)， 定溶 于 5ml PBS 缓冲液 (pH7.4) 中， M205C4 的工作浓度为 100 uM， 4℃反应 3h， 整个反应在静音 混合器上完成。
制 备 液 相 分 离 和 纯 化 M205C4-PEG ： 型号： Waters 2545-2767-UV2489 ； 柱子： SunfireTM C18 OBDTM 制备色谱柱 (30*150 mm, 5 μm) ； 流动相 ： 甲醇 - 水 - 三氟乙 酸 (60:40:0.1) ； 流速 ： 1.0ml/min ； 柱温 ： 25 ℃ ； 检测器 ： Waters 2489 （双波长， 220nm 及 330nm） ； 将回收的溶液浓缩并分装至 2ml EP 管中， 进行质谱检测后在液氮中过夜保存。
M205C4-PEG 冻干粉的制备 ： 将过夜保存在液氮的制备样品放入冻干仪中浓缩至 冻干粉末。
如图 1 所示， A图 ： M205C4 标准品直接进样 ； B图 ： M205C4 和 mPEG- SC 的反应样品 ； C 图 ：M205C4 和 mPEG-SC 的反应样品的 ELSD 检测结果 ； D图： 制备的 M205C4-PEG 样品直接 进样 ； E图： M205C4-PEG 质谱结果， mPEG-SC 为分子量 9000-11000 的长链混合物， 由此所得 到的修饰后产物的分子量区间为 11000-13000， 峰值在 12000 左右。 其中 1 号峰为 M205C4， 2 号峰为 M205C4-PEG， 3 号峰为 PEG。
mPEG-SC 的分子量约为 9000~11000， 制得的修饰产物为 M205C4-PEG， 是 mPEG-sc 对 多肽 M205C4 组氨酸氨基端的单点修饰产物， 其分子量为 11000~13000。M205C4-PEG 的结构 式为 ： ， 结构式中， 基酸序列。
为 mPEG 的结构式， HNWTRWLLHPDRGGGS 为多肽 M205C4 的氨实施例 2 基质金属蛋白酶 II 酶活检测实验 试剂盒 : MMP-2 Fluorimetric Drug Discovery Kit (Biomol)仪器 ： 荧光酶标仪 （Molecular Devices 公司、 Gemini EM） 操作方法参照试剂盒说明， 结果如图 2 所示， 为基质金属蛋白酶 II 酶活检测实验结果 图， 由此可得， 修饰后产物对基质金属蛋白酶 II(MMP2) 的半数抑制浓度 （IC50） 为 101.4uM， 是未修饰多肽的 4.1 倍， 即修饰后产物的生物学活性下降到 24.3%。
实施例 3 M205C4-PEG 在动物中药代动力学行为 一、 M205C4-PEG 在 ICR 小鼠中药代动力学行为 （1） 血药样品的采集 ： ICR 小鼠 ： 雌性， 6 周龄， 体重 22-24g/ 只。
分组 ： 共 60 只， 随机分成 10 组 （10 个时间点） ， 每组 6 只。
给药及血样的采集 ： 尾静脉注射给药， 20mg/kg/ 只 (M205C4/M205C4-PEG)， 眼眦取 -1 血， 置于肝素钠抗凝的干燥 2ml EP 管中， 3000 r??min 离心 5min， 每只小鼠取血清 200ul， 用 600ul 乙腈沉淀蛋白， 12000r??min-1 离心 5min， 取上清 600ul 加入 300ul 超纯水及 300ul 氯仿， 涡旋 1min， 静止分层后取上层水相 200ul 浓缩至冻干粉用作含量测定。
采血的时间点 ： 给药前采集空白血样， 给药后 5min， 15min， 30min， 1h， 2h， 4h， 8h， 16h， 24h。 （2） 血药浓度的测定 ： 样品处理 ： 将每个样品 （冻干粉） 1mg 溶解于 50ul 超纯水， 12000r??min-1 离心 5min， 去 上清 30ul 进样。
色谱条件 ： 型号 ： Waters 2690/5 ； 柱子 ： GL science C18 (4.6*250mm， 5um) ； 流动 相： 甲醇 - 水 - 三氟乙酸 (10:90:0.1) ； 流速 ： 0.8ml/min ； 柱温 ： 30℃； 检测器 : Waters 2998 （220nm） 。
质谱条件及样品处理 质谱仪型号 ： Ultraflex II MALDI-TOF/TOF 样品的处理 （溶剂法制样） ： 分别称取 1mg M205C4-PEG， 4mg 冻干粉 （血浆） ， 溶于 lmL TFA 中， 振荡溶解， 得到淡黄色透明溶液。称取 5mg PA6T 分别溶于不同的样品溶剂 (TFA， THF， FA， ACN， 60％ ACN ／ 5％ TFA) 中， 振荡至充分溶解， 得到白色悬浊液。取 2ul 样品溶液点于 Anchorchip 靶板 PAC96 上， 在空气中自然风干后， 再取 2ul 基质溶液点于风干后的样品上， 待溶剂完全挥发后将样品靶送入靶仓。
质谱条件 ： MALDI-TOF 质谱仪的脉冲氮激光 (337nm) 为离子解吸电离源。采用线 性和高分辨率反射分析模型， 加速电压为 20 kV， 平均每次测定样品的激光脉冲次数为 120。 采用外标法标定多肽质谱峰峰位。
如图 3 所示， 在 ICR 小鼠实验中药物经修饰后显著性的提高了药代动力学行为， 其 半衰期是未修饰多肽的 40.1 倍。
二、 M205C4-PEG 在比格犬中药代动力学行为 （1） 血药样品的采集 比格犬及其分组 ： 6 月龄， 共 10 条， 雌雄各 5 只， 体重 8-10kg/ 条， 购于上海交通大学。
给药及血样的采集 ： 右前肢静脉给药， 15mg/kg (M205C4/M205C4-PEG) ， 左前肢静 脉取血， 置于肝素钠抗凝的干燥 15ml EP 管中， 3000 r??min-1 离心 5min， 每只比格犬取血
清 1ml， 用 4ml 乙腈沉淀蛋白， 12000 r??min-1 离心 5min， 取上清 4ml 分别加入 2ml 超纯水 及氯仿， 涡旋 1min， 静置分层， 取上层水相 1.6ml 浓缩至冻干粉用作含量测定。
（2） 血药浓度的测定， 方法同 “M205C4-PEG 在 ICR 小鼠中药代动力学行为” 的方法。
如图 4 所示， 在比格犬实验中药物经修饰后提高了药代动力学行为， 其半衰期是 未修饰多肽的 7.8 倍。
实施例 4 M205C4-PEG 的抗肿瘤作用 一、 胰腺癌细胞系原位动物模型建立 细胞系 ： 胰腺癌细胞 （PANC-1/CFPAC-1） ； BALB/c 裸鼠 ： 雌性， 6 周龄， 约 20g/ 只， 购于上海斯莱克公司。
建立皮下移植肿瘤模型 ： 消化对数生长期的细胞， 冷 PBS 洗 3 次， 离心浓缩 （900 转， 5 分钟） ， 用无血清无双抗的 DMEM 培养液重悬成 108 个 /ml 的单细胞悬液。将 0.1ml 悬 液接种于裸鼠右腋下。
建立原位移植肿瘤模型 ： 三周左右待皮下瘤块长至 1cm 大小时， 脊椎脱位处死荷 瘤鼠， 消毒皮肤， 剥离肿块， 侵入含有青霉素和链霉素的高糖无血清 DMEM 培养液中， 去除死 3 皮及中央坏死组织， 选取正常肿瘤组织， 剪成约为大小约 5mm 肿块供原位移植用。 1% 戊巴比妥钠溶液 （50mg/kg） 腹腔注射麻醉裸鼠， 75% 酒精消毒皮肤， 于左上腹直 肠旁行 1cm 的纵行切口， 分开胃和脾之间的薄膜， 暴露胰腺， 剪开胰腺被膜， 将 5mm3 肿块植 入胰体尾处， 以 8-0 可吸收线缝合胰腺被膜。将胰腺送回腹腔， 6-0 可吸收线单层缝合腹壁 肌及皮肤。所有操作均在超净台内进行， 术者佩戴外科手术放大镜。
二、 给药干预后的有益效果 术后十天进行给药干预 分组 ： 以肿瘤生长的均一性为标准， 从 40 只术后荷瘤鼠中， 挑选 32 只， 进行随机性分 组， 每组 8 只， 共 4 组。
给药方式 ： 腹腔注射， 每 12 小时给药一次 ； 给药剂量 ( 药物均溶于 PBS 缓冲液 ) ； 治疗组 ： M205C4-PEG 50mg/kg ； 对照组 1 ： PEG 45.3 mg/kg ； 对照组 2 ： PBS0.25ml/ 只 ； 对照组 3: M204C4-PEG 5Omg/kg。 M204C4 为体外实验活性较弱的相关肽， 在 CN1869063A 中 公开。
M205C4-PEG 对裸鼠原位移植的胰腺癌细胞株 PANC-1 的生长抑制作用 ： 待荷瘤鼠 2 发病自然死亡后， 取出腹部肿块。肿瘤的大小 = 长径 × 短径 如图 5 所示， 为试验结果图。图中明显得出， M205C4-PEG 可减缓肿瘤的生长， 与对照组 2 比较治疗组的抑瘤率为 32.7%(P<0.05)。
M205C4-PEG 对胰腺癌细胞株 PANC-1 荷瘤鼠肝功能的作用 ： 测定荷瘤鼠血浆中的 天门冬氨酸氨基转移酶 （AST） 、 丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 的含量 。试剂盒购于 USCNLIFETM 公司。方法参照该试剂盒。如图 6 所示， 为试验结果图。给药干预后可部分逆转癌细胞诱 发的肝功能异常。
M205C4-PEG 对荷瘤鼠的生存率的影响 ：： 生存率为对照组 1 和 2 存活率变为最低 时所对应的治疗组的存活率的均值。如图 7 所示， M205C4-PEG 分别显著性的提高了两种胰 腺癌细胞株荷瘤鼠 40% 和 30% 的生存率， 延缓肿瘤的恶性发展。