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1、10申请公布号CN102068032A43申请公布日20110525CN102068032ACN102068032A21申请号201010577809222申请日20101208A24B3/14200601C11B9/0020060171申请人无锡华海香料有限公司地址214000江苏省无锡市新区梅村镇锡鸿路37号72发明人欧世春吴凡74专利代理机构无锡华源专利事务所32228代理人聂汉钦54发明名称利用真菌白地霉发酵香料烟籽制备烟用香料的方法57摘要本发明涉及利用真菌白地霉发酵香料烟籽制备烟用香料的方法，旨在筛选出转化香料烟籽油脂的高效微生物，应用最佳的发酵条件，开发以香料烟籽为原料的新型烟用。
2、香料。通过测定菌株对油脂的分解率，筛选出了高效率分解香料烟籽油脂的白地霉菌株。运用单因素和正交试验，确定了该菌株固体发酵香料烟籽的最佳生理条件，使油脂分解率达到672。发酵后大分子有机酸等被大量分解为小分子有机酸等致香物质。粗提物添加入卷烟后能增加烟香的丰富性、舒适性及自然烟草甜润，具有很好的卷烟用香料开发价值。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页CN102068033A1/1页21一种利用真菌白地霉发酵香料烟籽制备烟用香料的方法，所述发酵制备的步骤如下1）液体培养将真菌白地霉接入装有30ML液体种子培养基的250ML三角瓶中，种子培养基为MM。
3、培养基，以1浓度的香料烟种子油作为碳源，PH为60，28，200R/MIN振荡培养4D；2）固体培养将步骤1液体培养获得的菌种按510浓度接入固体培养基，培养基为细碎香料烟种子100G，加14G的蔗糖、150ML的蒸馏水，自然PH，培养基厚度为23CM，湿度控制在100，温度为2832，碳源补充量为28，发酵28D，发酵结束后进行致香成分提取；3）用95浓度乙醇按液固比31提取烟籽24次，合并提取液，过滤，减压浓缩，待除去约2/3体积的溶剂后冷冻，除去析出的油脂层，再减压浓缩，得到棕黄色液体提取物。2根据权利要求1所述利用真菌白地霉发酵香料烟籽制备烟用香料的方法，其特征在于所述步骤1中选择白地。
4、霉菌株GC4作为发酵菌株。3根据权利要求1所述利用真菌白地霉发酵香料烟籽制备烟用香料的方法，其特征在于所述步骤2中的菌株发酵时间为5天。4根据权利要求1所述利用真菌白地霉发酵香料烟籽制备烟用香料的方法，其特征在于所述步骤2中的菌株发酵温度为30。5根据权利要求1所述利用真菌白地霉发酵香料烟籽制备烟用香料的方法，其特征在于所述步骤2中的碳源补充量为5。权利要求书CN102068032ACN102068033A1/5页3利用真菌白地霉发酵香料烟籽制备烟用香料的方法技术领域0001本发明涉及烟用香料，具体涉及以烟籽为原料通过白地霉发酵制备烟用香料的方法。背景技术0002香料烟为复合型卷烟的重要原料。。
5、风干的香料烟籽呈棕褐色，含油脂3342，含蛋白质1930。云南为烟草生产大省，每年产生数十万吨的香料烟籽，是理想的烟用天然香料原料。但由于其含油脂较多，一般的化学方法处理得到的粗提产物难以直接应用于烟草加香，所以除少部分的烟籽用于育种外，大部分被作为废物堆放或遗弃，造成极大浪费。0003许多微生物能够大量产生脂肪降解酶。利用这些微生物降解香料烟籽中存在的大量油脂，将高级脂肪酸转化为低级脂肪酸或其他小分子有机酸开发新型烟用天然香料，具有广阔的前景。发明内容0004本发明的目的在于提供一种利用真菌白地霉发酵香料烟籽制备烟用香料的方法，通过筛选出转化香料烟籽油脂的高效微生物，应用最佳的发酵条件，开发。
6、以香料烟籽为原料的新型烟用香料。0005本发明的技术方案如下一种利用真菌白地霉发酵香料烟籽制备烟用香料的方法，所述发酵制备的步骤如下1）液体培养将真菌白地霉接入装有30ML液体种子培养基的250ML三角瓶中，种子培养基为MM培养基，以1浓度的香料烟种子油作为碳源，PH为60，28，200R/MIN振荡培养4D；2）固体培养将步骤1液体培养获得的菌种按510浓度接入固体培养基，培养基为细碎香料烟种子100G，加14G的蔗糖、150ML的蒸馏水，自然PH，培养基厚度为23CM，湿度控制在100，温度为2832，碳源补充量为28，发酵28D，发酵结束后进行致香成分提取；3）用95浓度乙醇按液固比31。
7、提取烟籽24次，合并提取液，过滤，减压浓缩，待除去约2/3体积的溶剂后冷冻，除去析出的油脂层，再减压浓缩，得到棕黄色液体提取物。0006其进一步的技术方案为所述步骤1中选择白地霉菌株GC4作为发酵菌株。0007所述步骤2中的菌株发酵时间为5天。0008所述步骤2中的菌株发酵温度为30。0009所述步骤2中的碳源补充量为5。0010本发明的有益技术效果是1、将白地霉接入香料烟籽，于适宜条件下进行发酵，可使香料烟烟籽中的油脂发生降说明书CN102068032ACN102068033A2/5页4解，产生多种对卷烟抽吸品质有重要影响的香味物质。00112、通过微生物发酵香料烟籽的提取物能与卷烟烟香较好。
8、谐调，使主体香气突出，香气更加圆润，具有良好的醇和烟气、改善吸味的效果。00123、采用白地霉发酵香料烟籽是一种有效利用废弃香料烟籽生产烟用香料的新途径，经济高效且可定向生产。具体实施方式0013下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明。0014实施例11）液体培养以真菌白地霉（GEOTRICHUMCANDIDUM）接入装有30ML液体种子培养基的250ML三角瓶中，种子培养基为MM培养基，以1浓度的香料烟籽油作为碳源，PH为60，28，200R/MIN振荡培养4D。00152）固体培养将以上液体培养获得的菌种按510接入固体培养基，培养基为细碎香料烟种子100G，加14G的蔗糖、150ML的。
9、蒸馏水，自然PH。培养基厚度为23CM，湿度控制在100，温度为28，碳源补充量为2，发酵时间为2D发酵结束后进行致香成分提取。00163）用95乙醇按液固比31提取烟籽2次，合并提取液，过滤，减压浓缩，待除去约2/3体积的溶剂后冷冻，除去析出的油脂层，再减压浓缩，得到棕黄色液体提取物。0017实施例21）液体培养以真菌白地霉（GEOTRICHUMCANDIDUM）接入装有30ML液体种子培养基的250ML三角瓶中，种子培养基为MM培养基，以1浓度的香料烟籽油作为碳源，PH为60，28，200R/MIN振荡培养4D。00182）固体培养将以上液体培养获得的菌种按510接入固体培养基，培养基为细。
10、碎香料烟种子100G，加14G的蔗糖、150ML的蒸馏水，自然PH。培养基厚度为23CM，湿度控制在100，温度为30，碳源补充量为5，发酵时间为8D发酵结束后进行致香成分提取。00193）用95乙醇按液固比31提取烟籽3次，合并提取液，过滤，减压浓缩，待除去约2/3体积的溶剂后冷冻，除去析出的油脂层，再减压浓缩，得到棕黄色液体提取物。0020实施例31）液体培养以真菌白地霉（GEOTRICHUMCANDIDUM）接入装有30ML液体种子培养基的250ML三角瓶中，种子培养基为MM培养基，以1浓度的香料烟籽油作为碳源，PH为60，28，200R/MIN振荡培养4D。00212）固体培养将以上液。
11、体培养获得的菌种按510接入固体培养基，培养基为细碎香料烟种子100G，加14G的蔗糖、150ML的蒸馏水，自然PH。培养基厚度为23CM，湿度控制在100，温度为32，碳源补充量为8，发酵时间为8D发酵结束后进行致香成分提取。00223）用95乙醇按液固比31提取烟籽4次，合并提取液，过滤，减压浓缩，待除去约2/3体积的溶剂后冷冻，除去析出的油脂层，再减压浓缩，得到棕黄色液体提取物。0023评吸取实施例13烟丝各100G，分别分成2等份。用乙醇将该提取物稀释10倍,按烟丝质量的02将稀释液均匀添加到一份烟丝中，同时在另一份试验烟丝上添加相同量的乙醇作为对照样，平衡24H，卷制成烟支，评吸。评。
12、吸按照卷烟感官技术要求的行业标准进行。说明书CN102068032ACN102068033A3/5页5评吸工作必须在通风、无异味、安静、不受干扰的环境下进行，评香师采用感官暗评计分。0024通过8位评香师的评吸，评吸结果表明未加提取物的空白烟香气平淡，刺激较大，杂气重，余味有明显涩感。而实施例13加提取物的卷烟香气量充足，烟气醇和细腻，杂气轻，略有刺激性，谐调一般，吸味好，具有香料烟型的风味特征。0025一、小试按照前面提供的技术方案，先进行实验室小试，优化反应条件，主要是对步骤2中的发酵时间、温度、碳源补充量等条件进行优化选择。实验如下1、菌株培养的优化选择将5颗菌株从保存斜面移接到斜面活化。
13、培养基上，28培养4D后，转接入装有30ML液体种子培养基的250ML三角瓶中，28，200R/MIN振荡培养4D，然后按5的接种量接入装有100ML发酵培养基的500ML三角瓶中，于28，200R/MIN振荡4D。发酵后，测定油脂分解率，得出的结果如下表1菌株优化实验结果菌株GC1GC2GC3GC4GC5油脂分解率（）4010645206563026540852807由此，最终选择白地霉菌株GC4为进一步固体发酵研究出发菌株。0026注上述白地霉菌株GC15均为市售商品。00272、发酵时间的优化选择以白地霉菌株GC4作为发酵菌株，确定步骤2中的接种量为5，温度为30，碳源补充量为5，其他条。
14、件稳定，将发酵时间分别设定为2天、4天、6天、8天进行平行试验。测定油脂分解率，得出的结果如下表2发酵时间优化实验结果发酵时间（天）2天4天6天8天油脂分解率（）2405123033080521802由此可以确定发酵时间选择在6天利于油脂的分解。00283、温度的优化选择确定步骤2中的接种量为5，发酵时间为6天，碳源补充量为5，其他条件稳定，将温度分别设定为25、28、30、32进行平行试验。测定油脂分解率，得出的结果如下表3温度优化实验结果温度（）25283032油脂分解率（）17303213052450320102由此可以确定发温度选择在30利于油脂的分解。00294、碳源补充量的优化选择。
15、确定步骤2中的接种量为5，发酵时间为6天，温度设定为30，其他条件稳定，将碳源补充量分别设定为2、5、8、10进行平行试验。测定油脂分解率，得出的结果如下表4碳源补充量优化实验结果碳源补充量（）25810油脂分解率（）20307312092651123511由此可以确定碳源补充量选择在5利于油脂的分解。0030综上所述，选择GC4作为发酵菌株，从实验室小试所筛选出来的较优条件如下菌株发酵时间为6天；菌株发酵温度为30；碳源补充量为5。说明书CN102068032ACN102068033A4/5页60031二、中试在实验室小试的基础上，进行中试，主要对步骤2中的温度、和发酵时间等条件进行优化选择。
16、。0032以真菌白地霉（GEOTRICHUMCANDIDUM）接入装有30L液体种子培养基的250L三角瓶中，种子培养基为MM培养基，碳源以1浓度的香料烟籽油代替，PH为60，28，200R/MIN振荡培养4D。将以上液体培养获得的菌种按5接入固体培养基，培养基为细碎香料烟种子10KG，加03KG的蔗糖、15L的蒸馏水，自然PH。培养基厚度为23CM，湿度控制在100，碳源补充量为5，温度为2832，发酵时间为28天发酵结束后进行致香成分提取。00331、发酵时间的优化选择以白地霉菌株GC4作为发酵菌株，确定步骤2中的接种量为5，温度为30，碳源补充量为5，其他条件稳定，将发酵时间分别设定为2。
17、天、4天、5天、8天进行平行试验。测定油脂分解率，得出的结果如下表5发酵时间优化实验结果发酵时间（天）2天4天5天8天油脂分解率（）2403116032990520602由此可以确定发酵时间选择在5天利于油脂的分解。00342、温度的优化选择确定步骤2中的接种量为5，发酵时间为6天，碳源补充量为5，其他条件稳定，将温度分别设定为25、28、30、32进行平行试验。测定油脂分解率，得出的结果如下表6温度优化实验结果温度（）25283032油脂分解率（）16303203042380319602由此可以确定发温度选择在30利于油脂的分解。0035综上所述，从实验室中试所筛选出的较优条件为步骤2中的发。
18、酵时间调整到5天，温度为30，与实验室小试结果基本吻合。0036三、大试在实验室小试和中试的基础上，进行大生产试验，主要对步骤2中的温度进行优化选择。0037以真菌白地霉（GEOTRICHUMCANDIDUM）接入装有600L液体种子培养基的5000L三角瓶中，种子培养基为MM培养基，碳源以1浓度的香料烟籽油代替，PH为60，28，200R/MIN振荡培养4D。将以上液体培养获得的菌种按5接入固体培养基，培养基为细碎香料烟种子200KG，加6KG的蔗糖、300L的蒸馏水，自然PH。培养基厚度为23CM，湿度控制在100，碳源补充量为5，发酵时间为6天，温度为2832，发酵结束后进行致香成分提取。
19、。0038确定步骤2中的接种量为5，发酵时间为6天，碳源补充量为5，其他条件稳定，将温度分别设定为25、28、30、32进行平行试验。测定油脂分解率，得出的结果如下表6温度优化实验结果温度（）25283032油脂分解率（）16303203042380319602可见，选择30作为最佳反应温度。说明书CN102068032ACN102068033A5/5页70039经过小试、中试和大生产的反复验证，得出微生物发酵烟籽制备烟用香料的工艺参数如下选择GC4作为发酵菌株，在30温度下，按5补充碳源，发酵5天，经提取制得的烟用香料能与卷烟烟香较好谐调，具有良好的醇和烟气和改善吸味的效果。0040上述实验。
20、中各发酵优化的方法为菌株培养和筛选将各待试菌株从保存斜面移接到斜面活化培养基上，发酵后,测定发酵液中油脂含量变化,据此确定固体发酵出发菌株。0041固体发酵条件优化按照单因素试验方法，以油脂降解率和香气成分变化为指标，对影响固体发酵的因素温度、接种量、碳源补充量和发酵时间进行了测试。0042油脂分解率测定液体发酵以8500R/MIN离心沉淀菌体，再用100ML石油醚萃取发酵液中油脂，旋转蒸发仪蒸去石油醚，称量油脂质量。0043固体发酵采用“索氏”脂肪提取法提取油脂，称量油脂质量。0044油脂分解率（发酵前油脂含量发酵后油脂含量）/发酵前油脂含量100固体发酵致香成分变化测定称取20G发酵样品，。
21、加入2ML的133MOL/L的H3PO4，搅拌均匀，乙醚萃取，分出乙醚层，加入1的NAHCO3溶液；静置，分出水相，减压浓缩至干，加入2ML无水乙醇及少量浓硫酸，酯化。用1ML正己烷萃取，分出有机相，加无水NA2SO4，干燥过夜；过滤，将滤液浓缩至1ML，用HP6890GC/5972MS气质联用仪进行分析。0045固体发酵产物的后提取以95乙醇室温下浸泡发酵产物5D，过滤，将滤液浓缩去除溶剂，即得到不含蛋白的可直接用于卷烟加香的粗产品。再通过实际卷烟加香吮吸与空白卷烟对比来综合评价。0046以上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。说明书CN102068032A。