优化的TACIFC融合蛋白用于制备治疗系统性红斑狼疮药物的应用.pdf

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1、10申请公布号CN102085368A43申请公布日20110608CN102085368ACN102085368A21申请号201110021344722申请日20110119A61K39/395200601A61P37/0220060171申请人烟台荣昌生物工程有限公司地址264006山东省烟台经济技术开发区荣昌路1号72发明人房健民54发明名称优化的TACIFC融合蛋白用于制备治疗系统性红斑狼疮药物的应用57摘要本发明涉及应用B淋巴细胞刺激因子受体抗体融合蛋白治疗自身免疫性疾病领域，更具体地说，涉及优化的TACIFC融合蛋白用于制备治疗系统性红斑狼疮药物的应用。本发明所述的药物对于治疗系。

2、统性红斑狼疮安全有效，并且利于降低本类重组蛋白质药物的成本，适用于工业化推广应用。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书23页序列表2页CN102085371A1/1页21优化的TACIFC融合蛋白用于制备治疗系统性红斑狼疮的药物的应用，所述融合蛋白的TACI部分包括来自TACI胞外区从氨基酸残基13开始的氨基末端区序列，富半胱氨酸区的全部序列，和柄区的部分序列，融合蛋白的免疫球蛋白FC包括铰链区，CH2区和CH3区，TACI序列与FC序列之间是直接融合或经连接序列融合。2根据权利要求1所述的应用，所述融合蛋白的TACI序列选自TACI的第13至10。

3、8氨基酸序列或第13至118氨基酸序列。3根据权利要求1所述的应用，所述的免疫球蛋白FC序列选自人或动物的免疫球蛋白FC，选自IGG，IGM，IGD，IGA，每种免疫球蛋白类型包括各亚型。4根据权利要求1所述的应用，所述的免疫球蛋白FC序列选自IGG1。5根据权利要求1所述的应用，所述的融合蛋白的TACI序列与免疫球蛋白FC序列之间经连接序列9GLY融合。6根据权利要求1所述的应用，所述的优化的TACIFC融合蛋白优选序列表中的序列1。7根据权利要求1所述的应用，所述融合蛋白制备的治疗系统性红斑狼疮的药物包含作为活性物质的权利要求16中任一项所述的优化的TACIFC融合蛋白和药学上可接受的载体。

4、。8根据权利要求7所述的应用，所述融合蛋白制备的治疗系统性红斑狼疮的药物为口服制剂或注射制剂。权利要求书CN102085368ACN102085371A1/23页3优化的TACIFC融合蛋白用于制备治疗系统性红斑狼疮药物的应用技术领域0001本发明涉及应用B淋巴细胞刺激因子受体抗体融合蛋白治疗自身免疫性疾病领域，更具体地说，涉及优化的TACIFC融合蛋白用于制备治疗系统性红斑狼疮药物的应用。技术背景0002系统性红斑狼疮SYSTEMICLUPUSERYTHEMATOSUS，SLE是一种慢性、多系统受累的自身免疫性疾病，以B淋巴细胞异常激活并异常分化为浆细胞和记忆性效应细胞，产生大量的自身抗体为。

5、特征，严重威胁了人类健康。目前临床上缺乏针对SLE特异性的治疗药物，对于SLE的常规治疗主要还是糖皮质激素和免疫抑制剂为主，皮质激素是全部治疗方案的基础，环磷酰胺是目前治疗重症狼疮性肾炎的重要药物，但不良反应较大限制了其临床使用。0003虽然SLE的发病机制目前尚不完全清楚，但近年来的研究结果显示，B细胞作为经典的免疫效应细胞在SLE自身免疫过程中发挥了不可替代的作用。SLE病人的B淋巴细胞高度活化并产生大量的自身抗体，引起溶血性贫血和肾小球肾炎等临床表现。B淋巴细胞还产生肿瘤坏死因子、IL4、IL10等多种促炎症细胞因子，影响其它效应细胞，产生炎症反应。SLE易感基因BLK和BANK1可能直。

6、接参与B细胞抗原受体BCR信号通路的活化、导致B细胞免疫耐受的丧失，提示BCR信号通路相关的B细胞失耐受是SLE发病的重要环节。B细胞参与SLE发病机制的分子水平的其他证据还包括FCGR基因的多态性对自身反应性B细胞激活、记忆B细胞的产生和维持、效应细胞抗体介导的免疫应答的影响；参与调控B细胞寿命及活化的分子如肿瘤坏死因子家族BLYS、参与凋亡产物和自身抗原加工和处理的相关分子等均在SLE发病机制中发挥作用。另外，B细胞还可能通过非抗体依赖的机制影响T细胞激活而参与自身免疫。因此，在SLE发病过程中，B淋巴细胞被认为与SLE的发病机制有更直接的关联，其治疗新药的研究热点也主要集中在B淋巴细胞。。

7、0004研究表明，BLYS基因敲除小鼠的成熟B淋巴细胞减少，免疫球蛋白降低，而BLYS转基因小鼠则出现严重B淋巴细胞增生、高滴度抗DSDNA自身抗体、蛋白尿和免疫复合物在肾脏沉积等狼疮样表现；在两种SLE小鼠模型MRL/LPR和NZB/WF1中，发病时均存在血清BLYS水平增高，并与肾脏损害相关，阻断BLYS的作用可显著改善狼疮样症状小鼠的生存。在一些SLE患者的血清和血浆中，BLYS的水平也较正常人显著升高，且生物学活性较正常水平明显增强。动物实验研究和人体外实验研究结果提示，BLYS过表达是参与SLE发病的重要机制之一，因此作用于BLYS靶点、清除B淋巴细胞就成为非常有希望的SLE治疗策略。

8、。0005目前，针对BLYS治疗SLE的靶向生物制剂已成研究热点。可能用于SLE治疗的BLYS拮抗剂包括BLYS单克隆抗体、由BLYS受体与IGGFC段构成的融合蛋白、能结合于BAFFR但不能启动信号传导的BLYS拟似物以及非激动性BLYS受体抗体等。0006B淋巴细胞刺激因子BLYMPHOCYTESTIMULATORS，BLYS是1999年发现的TNF超家族新成员，主要由单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞分泌产生。BLYS通说明书CN102085368ACN102085371A2/23页4过与其相应受体结合发挥其调控B淋巴细胞成熟、促进免疫球蛋白类别转换、辅助T细胞活化和参与自身免疫。

9、等功能。BLYS由285个氨基酸组成，作为II型跨膜蛋白表达于细胞表面，剪切后释放的17KB可溶性片段具有生物活性，以同源三聚体形式参加循环。目前已知BLYS受体有三个BCMABCELLMATURATIONANTIGEN、BAFFRBAFFRECEPTOR，BR3、和TACITRANSMEMBRANEACTIVATERANDCALCIUMMODULATORANDCYCLOPHILINLIGANDINTERACTOR，TACI。BAFFR是BLYS的专有受体，而TACI和BCMA除与BLYS结合外，还能与APRIL结合。BLYS的三种受体在与BLYS结合时发挥的作用不同。BLYS促进小鼠过渡期B。

10、细胞成熟、延长小鼠和人成熟B细胞的寿命以及辅助T细胞活化的作用主要是通过BAFFR实现的。TACI受体对小鼠B细胞的活化具有双重效应一方面TACI缺陷的小鼠表现为外周B细胞增多、抗原合成增加，出现自身免疫甚至致死性淋巴增殖现象，提示TACI为BLYS的抑制性受体；另一方面TACI又参与T细胞非依赖性抗原TI的免疫应答。BCMA则具有维持浆母细胞存活和促进成熟B细胞的抗原呈递作用。由于TACI受体对BLYS和APRIL这两者均有很强的亲和力，因此TACIFC融合蛋白较其他两种融合蛋白为优，是首选的药物结构。0007TACI最早是由美国著名学术机构STJUDE儿童医院科学家VONBULOW和BRA。

11、M发现的，但后来的研究发现，TACI细胞外区的自然序列存在蛋白质易于降解的问题，不适合作为药物生产。此后，有几家公司对TACI原分子做了改进，包括美国著名的生物技术公司基因泰克GENENTECH、AMGEN和ZYMOGENETICS。目前，ZYMOGENETICS公司与瑞士默克雪兰诺公司合作的TACI融合蛋白ATACICEPT已针对SLE、类风湿性关节炎、淋巴瘤等疾病进行临床试验，结果表明ATACICEPT具有明确的生物学活性，无明显的副作用。0008申请人采用蛋白质前体加工酶人工神经网络计算机软件系统的独特方法找到了TACI自然序列降解的原因，进而用基因工程构建了优化的TACIFC融合蛋白C。

12、N2007101111622，研究结果表明优化的TACIFC融合蛋白具有更好的生物学活性，具有抑制自身免疫疾病的作用，对SLE、类风湿性关节炎等自身免疫病有潜在的治疗前景。发明内容0009本发明的目的是提供优化的TACIFC融合蛋白用于制备治疗系统性红斑狼疮药物的应用。申请人研究了优化的TACIFC融合蛋白的具体作用机制并确认其对系统性红斑狼疮的疗效，本发明所提供的治疗系统性红斑狼疮药物具有生物学活性高、用量小、安全有效的优点。0010申请人通过蛋白质前体加工酶人工神经网络分析找到了天然TACI降解的位点，最大限度的保留TACL氨基末端区的大部分氨基酸残基，使优化的TACIFC融合蛋白解决了T。

13、ACI降解的难题并具有更好的生物学活性。0011本发明所述的优化的TACIFC融合蛋白的TACI部分包括来自TACI胞外区从氨基酸残基13开始的氨基术端区序列，富半胱氨酸区的全部序列，和柄区的部分序列，融合蛋白的免疫球蛋白FC包括铰链区，CH2区和CH3区，TACI序列与FC序列之间是直接融合或经连接序列融合。0012本发明所述的优化的TACIFC融合蛋白的TACI序列优选TACI的第13至108氨基酸序列或第13至118氨基酸序列。0013本发明所述的免疫球蛋白FC序列选自人或动物的免疫球蛋白FC，是FC全长或是说明书CN102085368ACN102085371A3/23页5部分序列，FC。

14、选自IGG，IGM，IGD，IGA，每种免疫球蛋白类型包括各亚型，如IGG1，IGG2，IGG3，IGG4，优选IGG1。0014本发明所述的优化的TACIFC融合蛋白的TACI序列与免疫球蛋白FC序列之间可以直接融合或经连接序列融合，如果经连接序列融合优选9GLY。0015本发明所述的优化的TACIFC融合蛋白优选由TACI的第13至118氨基酸序列和免疫球蛋白IGG1FC融合而成，即序列表中序列1，以下简称RCT18。0016本发明所述的优化的TACIFC融合蛋白可与药学上可接受的载体以本领域常规方法制备治疗系统性红斑狼疮的药物，所述载体包括赋形剂、稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、。

15、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、稳定剂等。0017本发明所述药物可制成临床上可接受的各种剂型，包括但不限于口服制剂或注射制剂，优选注射剂。0018申请人通过体外给药对血蓝蛋白KEYHOLELIMPETHEMOCYANIN，KLH模型以T细胞活化为主要病理表现的动物模型小鼠T、B淋巴细胞，BLYS或抗CD3抗体刺激的T、B淋巴细胞活性和功能的影响，探讨优化的TACIFC融合蛋白对免疫细胞的作用特点及其药效作用机制。优化的TACIFC融合蛋白体外用药抑制KLH诱导小鼠的T、B淋巴细胞活性和功能，抑制BLYS或抗CD3抗体刺激的T、B淋巴细胞活性和功能，调节细胞因子和抗体产生，同样对异常活化的T、。

16、B淋巴细胞增殖、抗体及细胞因子产生以及T、B淋巴细胞亚群具有调节作用。0019药效学试验研究表明优化的TACIFC融合蛋白的药理作用与其以BLYS和APRIL为作用靶标的T、B淋巴细胞功能密切相关。整体给药对RA和SLE动物模型有明确疗效；体外用药能直接抑制KLH小鼠T细胞异常增殖活化功能、调节细胞因子和抗体产生，调节T细胞亚群；体外用药能直接抑制BLYS或CD3单抗刺激的T、B淋巴细胞增殖活性，调节细胞因子和抗体产生，调节T、B淋巴细胞亚群。整体和离体药效试验显示了优化的TACIFC融合蛋白的作用特点，其作用机制是其TACI胞外可溶性部分能中和淋巴细胞发育成熟的两个关键调节因子BLYS和AP。

17、RIL，高效阻断了BLYS和APRIL与其受体TACI、BCMA和BAFFR之间的相互作用，从而有效阻断B淋巴细胞的增生和T淋巴细胞的成熟，具有抑制自身免疫疾病的作用。0020动物药效试验表明优化的TACIFC融合蛋白对SLE小鼠红斑狼疮转基因小鼠MRL/LPR和CONA活化染色质诱导的狼疮样小鼠均有治疗作用，皮下注射给药对SLE模型小鼠的显著有效治疗剂量是75MG/KG，比对RA模型小鼠的显著有效治疗剂量大；优化的TACIFC融合蛋白体外给药直接抑制BLYS对T和B淋巴细胞的活性和功能；研究还证实SLE与其调节T、B淋巴细胞增殖和活化、细胞因子水平和抑制抗体产生密切相关，也与其降低外周循环血。

18、液和脾脏中升高的BLYS和APRIL水平密切相关，优化的TACIFC融合蛋白作用于B淋巴细胞生长发育阶段的从未成熟B细胞至长寿命浆细胞的各阶段，但对记忆B细胞没有作用。0021动物药代试验表明单次皮下注射给药在大鼠和恒河猴的药物动力学参数TMAX分别为716H和612H，T1/2分别为4050H和79129H；且体内的绝对生物利用度随着给药剂量的增加呈下降趋势；在大鼠和猴中的药动学行为没有性别差异。优化的TACIFC融合蛋白在大鼠皮下给药后，迅速分布到各组织，肾脏为最主要的分布器官，其次为心、肝、肺和说明书CN102085368ACN102085371A4/23页6性腺，再次为脾、胃、肠、肌肉。

19、、脂肪和胸腺，在脑组织中的分布最低；随着给药时间的延长，这些组织中的浓度逐渐下降，未观察到蓄积现象。在粪便、尿液和胆汁中的排泄率分别为1789326，7798495和1217349，表明皮下注射给药后优化的TACIFC融合蛋白主要通过尿液排泄，在粪便和尿液中的平均总排泄率为9587。多次给药的药动学实验还显示皮下注射给药在大鼠体内不存在明显的蓄积性，但在猴体内有一定的蓄积现象。0022动物的安全评价试验表明优化的TACIFC融合蛋白在所有试验动物上均表现出良好的耐受性和安全性。0023申请人将RCT18与文献ATACICEPT非临床SLE药效进行了对比，结果表明，RCT18的总给药剂量大于AT。

20、ACICEPT，但药效作用优于ATACICEPT。ATACICEPT对自发性SLE小鼠的药效试验文献显示在每只雌性NZBWF1小鼠IP给予20G或100GATACICEPT小鼠体重以每只20G计算，分别相当1MG/KG和5MG/KG，每周给药3次连续治疗5周，显著降低蛋白尿长达10周；高剂量组动物生存率显著增加，且该作用与外周血B细胞减少相关与对照组相比减少53，该药效可持续到末次给药后5周。但SLE特异性指标双链DNA抗体滴度水平各组间无差异，该结果提示需要更长的治疗时间GROSSJA，JOHNSTONJ，MUDRIS，ETALTACIANDBCMAARERECEPTORSFORATNFHO。

21、MOLOGUEIMPLICATEDINBCELLAUTOIMMUNEDISEASENATURE，2000，27404995999。国外类似药物研究结果显示，TACIIG腹腔注射给药可明显减少SLE模型小鼠蛋白尿的产生，小鼠脾脏和淋巴结缩小，B淋巴细胞显著减少，生发中心形成障碍，在NZB/NZWF1小鼠出现肾炎之前给药可延缓肾病出现并可推迟其死亡45个月RAMANUJAMM，WANGXB，HUANGWQ，ETALMECHANISMOFACTIONOFTRANSMEMBRANEACTIVATORANDCALCIUMMODULATORLIGANDINTERACTORIGINMURINESYSTEMI。

22、CLUPUSERYTHEMATOSUSIMMUNOLOGY，2004；17335243534。RCT18和ATACICEPT两者均在自发性SLE小鼠上进行了药效研究，均在SLE小鼠出现症状后给药，RCT18对MRL/LPR小鼠和ATACICEPT对NZBWF1小鼠的显效剂量分别为SC75MG/KG和IP5MG/KG；给药方法分别为2D/次连续8周共给药28次和3次/周连续5周共给药15次，两者总的给药剂量虽然RCT18大于ATACICEPT210MG/KG与75MG/KG，但两者的药效结果有差异。两者均能抑制SLE疾病的进程，可明显减少白发性SLE模型小鼠蛋白尿的产生，小鼠脾脏和淋巴结缩小，B。

23、淋巴细胞显著减少，生发中心形成障碍等；但对SLE特异性指标双链DNA抗体ANTIDSDNA滴度水平的作用不同，RCT18显著降低自发性SLE小鼠血清中升高的CREA、BUN、IGG1、BLYS、ANA、ANTIDSDNA和IL10水平，对ANA和BLYS水平的降低具有剂量依赖性，对SLE小鼠异常的血清抗体水平有治疗作用；而ATACICEPT对双链DNA抗体滴度水平没有显著作用，研究者推测可能是由于其用药时间不足的缘故。0024本发明所述的优化的TACIFC融合蛋白最大限度的保留TACI氨基末端区的大部分氨基酸残基，相对于现有技术大幅提高了融合蛋白与BLYS的亲和力，药物与靶标的亲和力增加即意味。

24、着药物所需有效浓度的下降，即可以用更少的药而达到同样的临床治疗目的，这对于价格昂贵的重组蛋白质药物来说尤为重要。本发明的推广应用有利于降低药物成本，更适用于工业化生产。说明书CN102085368ACN102085371A5/23页7具体实施方式0025以RCT18为例，对本发明作进一步说明。以下实施例是对本发明进行进一步的阐述和解释，而不应被看作是对本发明的限制。0026实施例1RCT18对红斑狼疮转基因小鼠MRL/LPR和CONA活化淋巴细胞的染色质诱导SLE样小鼠模型的治疗作用002711试验方法0028111对红斑狼疮转基因小鼠MRL/LPR的药效学试验方法0029MRL/LPR转基因。

25、小鼠60只，随机分为6组，每组10只，即模型组MRL/LPR组、RCT18组375、75、15MG/KG，SC、阳性对照组PRE组，5MG/KG，IG和IGGFC组75MG/KG，SC。每周检测MRL/LPR小鼠的尿蛋白含量，当动物尿蛋白含量大于30MG/DL时，RCT18给药组和IGGFC组动物皮下注射给药02ML/10G体重，隔日一次，连续给药8周，模型组皮下注射给予等量生理盐水，阳性对照组每天灌胃给药02ML/10G体重。观察并记录动物给药8周的行为活动、毛发状态、排泄物等体征异常变化，用目测尿蛋白试纸检测动物的尿蛋白变化，HE染色法检查动物的肾脏、脾脏和淋巴结病理改变，计算动物的脾脏和。

26、胸腺指数，3HTDR掺入法检测LPS和CONA诱导的B和T淋巴细胞增殖反应，生化法检测血清中肌酐CREA和尿素氮BUN水平，ELISA法检测小鼠血清中免疫球蛋白IGG1、IGG2A、抗核抗体ANA、抗双链DNA抗体ANTIDSDNA、B淋巴细胞刺激因子BLYS、白细胞介素10IL10和干扰素IFN水平，流式细胞术检测肠系膜淋巴结T淋巴细胞或脾脏T、B淋巴细胞亚群及活性。0030112对CONA活化淋巴细胞的染色质诱导SLE样小鼠模型的的药效学试验方法0031CONA活化淋巴细胞的染色质诱导SLE样小鼠模型的建立00321活化脾淋巴细胞的制备0033处死小鼠，无菌取脾脏，于RPMI164010小。

27、牛血清FCS中制备细胞悬液，台盼蓝计数存活率95，加入培养瓶中，使终浓度为CONA3MGL1，细胞2109个L1，每瓶20ML，直立培养25CM2瓶，于37，5CO2培养箱中培养48H后取出，倒置显微镜下25可见CONA活化瓶一个视野有5个以上大成团细胞未加入CONA瓶基本无成团细胞，离心收集活化脾细胞。00342染色质的制备0035将分离的活化脾细胞按15体积加入缓冲液A025M蔗糖、3MMMGCL2、10MMTRISHCL，06TRITONX100、01MMPMSF匀浆破核，离心800G/15MIN，4，弃上清，沉淀用缓冲液A18匀浆，涂片观察核的逸出，离心800G，15MIN，4，所得粗。

28、核悬浮于20倍体积的缓冲液B22M蔗糖、3MMMGCL2、10MMTRISHCL、01MMPMSF中轻轻匀化后，铺于1/4体积的缓冲液B上，超速离心51900G，90MIN，4，收集沉淀，用20倍体积缓冲液C10MMTRISHCL、1MMEDTA、PH79悬浮，匀浆破核，离心800G，15MIN，4，再将沉淀悬浮于150的1SSC溶液015MNACL，15MM柠檬酸钠中，离心800G，20MIN，4，收集底部染色质。00363模型诱导0037将活性染色质100G02ML分别于D0、D14、D28尾根部皮内注射雌性67周龄BALB/C小鼠。首次免疫将染色质干粉和生理盐水及BCG制备混悬液，将该悬。

29、液逐滴加说明书CN102085368ACN102085371A6/23页8入搅拌中的等体积弗氏不完全佐剂ICFA，4搅拌12H制成油包水乳剂，BCG终浓度为10GL1。D14以染色质和ICFA免疫但不含BCG，D28以染色质混悬液再次免疫。空白组未做任何处理。在制备和致敏的过程中注意将免疫制剂4保存。0038试验方法0039BALB/C小鼠，雌性，1820G，将经诱导为SLE模型的BALB/C小鼠随机分为7组，即模型组生理盐水，SC、RCT18三个剂量组375，75、15MG/KG，SC、阳性对照组醋酸泼尼松，5MG/KG，IG和IGFC75MG/KG，SC，另设正常对照组生理盐水，SC，每组。

30、10只。当小鼠初次免疫后D28开始给药，02ML/10G体重，隔日1次，连续给药8周。观察并记录动物给药8周的行为活动、毛发状态、排泄物等体征异常变化，用目测尿蛋白试纸检测动物的尿蛋白变化，HE染色法检查动物的肾脏、脾脏和淋巴结病理改变，计算动物的脾脏和胸腺指数，3HTDR掺入法检测LPS和CONA诱导的B和T淋巴细胞增殖反应，生化法检测血清中肌酐CREA和尿素氮BUN水平，ELISA法检测小鼠血清中免疫球蛋白IGG1、IGG2A、抗核抗体ANA、抗双链DNA抗体ANTIDSDNA、B淋巴细胞刺激因子BLYS、白细胞介素10IL10和干扰素IFN水平，流式细胞术检测肠系膜淋巴结T淋巴细胞或脾脏。

31、T、B淋巴细胞亚群及活性。004012试验结果0041对红斑狼疮转基因小鼠MRL/LPR有治疗作用0042RCT18皮下注射给药后能显著降低两种SLE小鼠升高的蛋白尿水平，有效改善MRL/LPR小鼠的毛发脱落，降低MRL/LPR小鼠的损伤指数能显著改善两种SLE小鼠的肾小球肾炎、脾脏和淋巴结增生等病理变化。00431RCT1875，15MG/KG皮下注射给药可显著降低MRL/LPR小鼠尿蛋白水平，有效改善毛发脱落，降低小鼠的损伤指数。00442RCT18375，75，15MG/KG皮下注射给药均可不同程度地减轻MRL/LPR小鼠肾脏、脾脏及淋巴结的病理变化。00453RCT1875，15MG/。

32、KG皮下注射给药可显著降低MRL/LPR小鼠升高的脾指数，显著抑制脾脏B淋巴细胞的增殖反应。00464RCT1875，15MG/KG皮下注射给药可显著降低MRL/LPR小鼠血清中CREA和BUN水平，显著改善小鼠的肾功能；RCT18375，75，15MG/KG给药可剂量依赖性地降低小鼠血清中高水平的ANA和BLYS水平，可显著降低小鼠血清中高水平的ANTIDSDNA水平和IGG1的表达；RCT18375，75，15MG/KG给药也可显著降低小鼠血清中较高的IL10和IFN水平。00475RCT18375，75，15MG/KG皮下注射给药可显著降低脾脏成熟B淋巴细胞CD19IGD和早期B淋巴细胞。

33、CD19IGM的比例，RCT1875，15MG/KG可显著降低总B淋巴细胞CD19的比例，而对表达补体受体B淋巴细胞CD1921和表达FC受体B淋巴细胞CD19CD23和记忆B淋巴细胞CD19CD27的比例无明显影响。RCT1815MG/KG皮下注射给药可显著升高MRL/LPR模型小鼠肠系膜淋巴结T淋巴细胞的活化TH淋巴细胞CD4CD25百分比，降低表达活化诱导分子TH淋巴细胞CD4CD69的表达，对总T淋巴细胞CD3、TH淋巴细胞CD3CD4、表达CD40L的TH细胞CD4CD154及未致敏TH淋巴细胞CD4CD62L等T淋巴细胞亚群细胞比例无明显影响。说明书CN102085368ACN10。

34、2085371A7/23页90048说明书CN102085368ACN102085371A8/23页100049说明书CN102085368ACN102085371A9/23页1100500051表4RCT18皮下注射给药对MRL/LPR小鼠肾脏病理评分的影响N10，说明书CN102085368ACN102085371A10/23页1200520053注表示与MRL/1PR组比较P0010054表5RCT18皮下注射给药对MRL/LPR小鼠淋巴结病理评分的影响N10，00550056注表示与MRL/LPR组比较P005，表示与MRL/LPR组比较P0010057表6RCT18给药对MRL/LP。

35、R小鼠胸腺指数及脾脏指数的影响N10，00580059注表示与BALB/C组比较P001；表示与MRL/LPR组比较P005，表示说明书CN102085368ACN102085371A11/23页13与MRL/LPR组比较P0010060表7RCT18对MRL/LPR小鼠胸腺淋巴细胞及脾脏淋巴细胞增殖的影响N5，00610062注表示与MRL/LPR组比较P005，表示与MRL/LPR组比较P0010063表8RCT18对MRL/LPR小鼠肌酐和尿素氮的影响N10，00640065注P001VSBALB/C；P005，P001VSMODELMRL/LPR0066表9RCT18对MRL/LPR小。

36、鼠ANA、ANTIDSDNA、IGG1、IGG2A水平的影响N10，00670068注P001VSMODELMRL/LPR；表示与RCT18375MG/KG组比较P0050069表10RCT18对MRL/LPR小鼠血清BLYS、IL10、IFN的影响N10，说明书CN102085368ACN102085371A12/23页1400700071注表示与MRL/LPR组比较P005，表示与MRL/LPR组比较P001；表示与RCT18375MG/KG组比较P005。说明书CN102085368ACN102085371A13/23页1500720073RCT18对CONA活化染色质诱导的狼疮样小鼠S。

37、LE样小鼠模型的影响00741RCT18给药对染色质诱导模型动物的体重无明显影响，动物给药期间无明显说明书CN102085368ACN102085371A14/23页16异常，各组动物均未见明显的皮肤结痂和血管炎。00752RCT1815MG/KG给药4周、RCT1875MG/KG给药6周时即可显著降低模型动物的尿蛋白水平。00763RCT18给药能显著改善染色质诱导模型动物的肾脏间质性肾炎和脾脏增生等病理变化。00774RCT1815MG/KG皮下注射给药可显著降低SLE样模型鼠异常升高的脾指数，RCT1875，15MG/KG给药可显著降低模型小鼠LPS诱导的脾脏B淋巴细胞增殖反应，而对CO。

38、NA诱导的胸腺T淋巴细胞增殖则无明显影响。00785RCT1875，15MG/KG皮下注射给药能显著降低模型小鼠显著升高的血清CRE和BUN水平，改善SLE样模型小鼠的肾功能；RCT18皮下注射给药均可显著降低SLE样小鼠血清中升高的ANA、ANTIDSDNA、IGG1、IGG2A、BLYS和IL10水平，而对IFN水平无明显影响。00796RCT18375，75，15MG/KG皮下注射给药可显著降低SLE样模型小鼠脾脏总B淋巴细胞CD19、表达补体受体B淋巴细胞CD1921和表达FC受体B淋巴细胞CD19CD23、成熟B淋巴细胞CD19IGD和早期B淋巴细胞CD19IGM的百分比，而对记忆B。

39、淋巴细胞CD19CD27的表达无明显影响。RCT1815MG/KG皮下注射给药可以显著升高SLE样小鼠脾脏T淋巴细胞的活化TH淋巴细胞CD4CD25百分比，而对TH淋巴细胞其它亚群的表达无明显影响。说明书CN102085368ACN102085371A15/23页1700800081表14RCT18对SLE样小鼠肾脏病理评分的影响N10，说明书CN102085368ACN102085371A16/23页1800820083表示与模型组动物比较，P005，表示与模型组动物比较，P0010084表15RCT18对SLE样小鼠脾脏组织病理学的影响N10，00850086表示与模型组比较P005，表示。

40、与模型组比较P001，表示与375MG/KG组比较P005。0087表16RCT18给药对SLE样小鼠胸腺指数及脾脏指数的影响N10说明书CN102085368ACN102085371A17/23页1900880089注表示与BALB/C组比较P001；表示与模型组比较P0050090表17RCT18对SLE样小鼠胸腺淋巴细胞及脾淋巴细胞增殖的影响N5，00910092注表示与BALB/C组比较P005；表示与模型组比较P0050093表18RCT18对SLE样小鼠肌酐和尿素氮的影响N10，009400950096注表示与BALB/C组比较P001；表示与模型组比较P005，表示与模型组比较P。

41、0010097表19RCT18对SLE样小鼠ANA、ANTIDSDNA、IGG1、IGG2A水平的影响N10，说明书CN102085368ACN102085371A18/23页2000980099注表示与BALB/C组比较P005，表示与BALB/C组比较P001；表示与模型组比较P005，表示与模型组比较P0010100表20RCT18对SLE样小鼠血清BLYS、IL10、IFN的影响N10，01010102注表示与BALB/C组比较P005，表示与BALB/C组比较P001；表示与模型组比较P005，表示与模型组比较P001；表示与RCT18375MG/KG比较P001说明书CN10208。

42、5368ACN102085371A19/23页2101030104表22RCT18对SLE样小鼠脾脏T淋巴细胞特征性表面抗原表达的影响N5，说明书CN102085368ACN102085371A20/23页2201050106注表示与模型组比较P005010713试验结论0108对SLE小鼠有治疗作用0109RCT18皮下注射给药后能显著降低两种SLE小鼠升高的蛋白尿水平，有效改善MRL/LPR小鼠的毛发脱落，降低MRL/LPR小鼠的损伤指数；能显著改善两种SLE小鼠的肾小球肾炎、脾脏和淋巴结增生等病理变化。0110能有效改善SLE小鼠的肾功能0111RCT18能显著降低两种SLE小鼠升高的血。

43、清CREA和BUN水平。0112可以显著降低SLE小鼠升高的自身抗体和炎性细胞因子水平0113RCT18能显著降低模型小鼠血清中升高的IGG1、BLYS、ANA、ANTIDSDNA和IL10水平，对ANA和BLYS水平的降低具有剂量依赖性；降低MRL/LPR小鼠IFN水平，降低SLE样小鼠IGG2A水平。0114抑制SLE小鼠脾脏B淋巴细胞增殖反应0115RCT18能降低两种SLE小鼠升高的脾脏指数，降低两种SLE小鼠脾脏B淋巴细胞亢进的增殖反应。0116抑制SLE小鼠脾脏B淋巴细胞亚群及活性0117RCT18能减少两种SLE小鼠脾脏B淋巴细胞亚群的总B淋巴细胞CD19、成熟B淋巴细胞CD19。

44、IGD和早期B淋巴细胞CD19IGM数量，降低CONA活化染色质诱导的狼疮样小鼠表达补体受体B淋巴细胞CD1921和表达FC受体B淋巴细胞CD19CD23比例，而对记忆B淋巴细胞CD19CD27数量无明显影响。0118调节SLE小鼠淋巴结或脾脏T淋巴细胞亚群及活性0119RCT18皮下注射给药能升高MRL/LPR小鼠肠系膜淋巴结和SLE样小鼠脾脏T淋巴细胞的活化TH淋巴细胞CD4CD25数量，降低MRL/LPR小鼠肠系膜淋巴结T淋巴细胞表达活化诱导分子TH淋巴细胞CD4CD69的表达，而对其它T淋巴细胞亚群活性无明显影响。0120RCT18皮下注射给药可以显著降低系统性红斑狼疮样模型小鼠升高的。

45、自身抗体和炎性细胞因子水平，有效改善小鼠的肾功能，降低小鼠的蛋白尿水平，减少脾脏总B淋巴细胞CD19、成熟B淋巴细胞CD19IGD和早期B淋巴细胞CD19IGM数量，升高脾脏说明书CN102085368ACN102085371A21/23页23或淋巴结中活化TH细胞CD4CD25百分比，明显改善模型小鼠肾小球肾炎和脾脏、淋巴结增生等病理变化。0121研究结果提示，RCT18皮下注射给药对系统性红斑狼疮小鼠具有治疗作用，其作用机制可能是由于RCT18皮下注射给药后可以与小鼠体内过高的BLYS结合，降低体内BLYS的水平，从而抑制B淋巴细胞的增殖和分化，减少了总B淋巴细胞和成熟B淋巴细胞数量，降低。

46、了B淋巴细胞分泌自身抗体的能力，同时下调IL10和IFN等炎性细胞因子水平，从而调节免疫功能改善炎症病变。0122实施例2RCT18在大鼠体内与恒河猴体内的药代动力学研究0123211大鼠药代动力学研究0124本研究建立了血浆中RCT18的125I同位素标记示踪测定方法，并应用建立的方法，研究了大鼠静脉注射IV1MG/KG和皮下注射SC三个单剂量组1，4和16MG/KG以及多次5次皮下注射一个剂量组4MG/KGRCT18冻干注射剂后，血浆中RCT18经时变化曲线，应用DAS20软件，采用房室模型和统计矩法分别进行了药物动力学分析。结果空白血浆CPM值较低且为一个稳定的值。血浆中RCT18的萃取。

47、回收率大于79，方法回收率大于99，批间和批内变异系数都小于10。RCT18的线性范围为0120G/ML，标准曲线的相关系数R均0999。RCT18的定量下限为01G/MLRSD10。血浆中RCT18在稳定性实验中均符合要求。药物动力学结果按统计矩法计算的药代动力学参数见表23。由表23可见，大鼠SC1、4和16MG/KGRCT18冻于注射剂后，三种剂量的CMAX与剂量呈线性相关R0999，AUC与剂量也呈现一定的相关性R0989。IV和SC三个单剂量组的T1/2Z不存在显著性差异。单剂量给药和5次多次给药后的AUC0，CLZ和CMAX都没有显著性差异，说明该药物在大鼠体内不存在明显的蓄积性。。

48、皮下给药的绝对生物利用度随着给药剂量的增加呈现明显的下降趋势。另外，该药物在大鼠中的药动学行为没有性别差异。0125表23RCT18皮下注射给药在大鼠体内的主要药代动力学参数01260127212大鼠组织分布试验0128本研究建立了大鼠组织匀浆样品中RCT18的125I同位素标记示踪测定方法，并应用建立的方法，研究了大鼠皮下注射SC4MG/KGRCT18冻干注射剂后，各组织中的RCT18分布情况。结果空白血浆的CPM值较低且为一个稳定的值；组织匀浆中RCT18在0012G/ML的浓度范围内呈现良好的线性关系；组织匀浆中的RCT18在室温放置5H内稳定。大鼠皮下注射RCT18后，其迅速分布到各组。

49、织。肾脏为最主要的分布器官，其次为心、肝、肺和性腺，再次为脾、胃、肠、肌肉、脂肪和胸腺，在脑组织中的分布最低。随着说明书CN102085368ACN102085371A22/23页24给药时间的延长，这些组织中的RCT18浓度逐渐下降，未观察到蓄积现象。0129213大鼠尿液、胆汁和粪便中的排泄试验0130本研究建立了粪便、尿液和胆汁中RCT18的125I同位素标记示踪测定方法，并应用建立的方法，研究了大鼠颈部皮下注射4MG/KGRCT18后，三种排泄途径的排泄率。研究发现在粪便、尿液和胆汁中的排泄率分别为1789326，7798495和1217349。结果表明，皮下注射给药后RCT18主要通过尿液排泄，在粪便和尿液中的平均总排泄率为9587。其中RCT18大部分在048H内排出体外，048H内经尿液的平均排泄率为5128551，经粪便的平均排泄率为575331。经胆汁的排泄也有一定的作用，084H内的总排泄率为1217349。013122恒河猴药物动力学研究0132本研究建立了恒河猴血浆中RC。