白介素 -13 抗体组合物 本申请是申请日为 2006 年 09 月 29 日、 申请号为 200680044973.9( 国际申请号为 PCT/GB2006/003650)、 发明名称为 “白介素 -13 抗体组合物” 的发明申请的分案申请。
本发明涉及一种药物组合物， 其包含白介素 -13 抗体， 更具体的说是白介素 -13 单 克隆抗体， 尤其是人白介素 -13 单克隆抗体。本发明还涉及纯化所述抗体的方法和使用所 述组合物来治疗白介素 -13 相关病症诸如哮喘的用途。
白介素 (IL)-13 是 114 个氨基酸的细胞因子， 未修饰时的分子量是大约 12kDa。 IL-13 与 IL-4 最密切相关， 二者在氨基酸水平具有 30 ％的序列同源性。人 IL-13 基因 位 于 染 色 体 5q31， 与 IL-4 基 因 邻 近 [McKenzie， A.N.et al.， JImmunol， 1993.150(12)， 5436-5444 ； Minty， A.et al.， Nature， 1993.362(6417)， 248-50]。
尽管最初将 IL-13 鉴定为 Th2CD4+ 淋巴细胞衍生细胞因子， Th1CD4+T 细胞、 CD8+T 淋巴细胞、 NK 细胞、 及非 T 细胞群诸如肥大细胞、 嗜碱细胞、 嗜曙红细胞、 巨噬细胞、 单核细 胞和气道平滑肌细胞也生成 IL-13。
已经将 IL-13 与许多疾病联系起来， 具体有由炎性应答引起的疾病。例如， 对
未曾接受治疗的未被致敏的 (non-sensitised) 啮齿类动物的气道施用重组IL-13 显示出引起哮喘表型的许多方面， 包括气道炎症、 粘液生成和气道高应答性 (AHR) [Wills-Karp ， M.et al. ， Science ， 1998.282(5397) ， 2258-2261 ； Grunig ， G.et al. ， Science， 1998.282(5397)， 2261-2263 ； Venkayya， R.， et al.， AmJ Respir Cell Mol Biol， 2002.26(2)， 202-208 ； Morse， B.et al.， Am J PhysiolL ung Cell Mol Physiol， 2002.282(1)， L44-49]。在肺中特异性过表达 IL-13 的转基因小鼠中观察到类似的表型。 在该模型中， 更长时间的暴露于 IL-13 还导致纤维化 [Zhu， Z.et al.， J Clin Invest， 1999.103(6)， 779-788]。
已经将 IL-13 基因的许多遗传多态性与变应性疾病联系起来。具体而言， 已经将 IL-13 基因第 130 位精氨酸残基被谷氨酰胺替代的的变体 (Q130R) 与支气管哮喘、 特应性 皮炎 (atopic dermatitis) 和血清 IgE 水平升高联系起来 [Heinzmann， A.et al.， Hum Mol Genet， 2000.9(4)， 549-559 ； Howard， T.D.et al.， Am J Hum Genet， 2002.70(1)， 230-236 ； Kauppi， P.et al.， Genomics， 2001.77(1-2)， 35-42 ； Graves， P.E.et al.， J Allergy Clin Immunol， 2000.105(3)， 506-513]。有些小组还将这种 IL-13 变体称为 Q110R 变体 ( 第 110 位精氨酸残基用谷氨酰胺替代 )， 因为它们从氨基酸计数中排除了 20 个氨基酸的信号序 列。
还已经将 IL-13 生成与变应性哮喘联系起来 [van der Pouw Kraan， T.C.etal.， Genes Immun， 1999.1(1)， 61-65]， 而且在患有特应性鼻炎 (atopic rhinitis)( 干草热 (hay fever))、 变应性皮炎 ( 湿疹 ) 和慢性 ( 鼻 ) 窦炎的人类受试者中测量到升高的 IL-13 水平。
在哮喘外， 已经将 IL-13 与其它纤维变性疾患联系起来。已经在患有系统性硬化 的患者的血清中和患有其它形式肺纤维化的患者的支气管 - 肺泡灌洗 (BAL) 样品中测量到 升高的 IL-13 水平， 达到比 IL-4 高 1000 倍 [Hasegawa， M.etal.， J Rheumatol， 1997.24(2)， 328-332 ； Hancock， A.et al.， Am J Respir Cell MolBiol， 1998.18(1)， 60-65]。已经证明了 IL-13 在小鼠肺中的过表达引起肺气肿、 粘液生成增加和炎症， 这 些症状反映了人慢性阻塞性肺病 (COPD) 的各个方面 [Zheng， T.et al.， JClin Invest， 2000.106(9)， 1081-1093]。
有人提出 IL-13 可能在炎性肠病的发病机理中发挥作用 [Heller， F.et al.， Immunity， 2002.17(5)， 629-38]， 而且在有些何杰金氏病 (Hodgkin’ s disease) 患者的血 清中检测到与正常对照相比升高的 IL-13 水平 [Fiumara， P.et al.， Blood， 2001.98(9)， 2877-2878]。
还认为 IL-13 抑制剂在治疗上可用于预防肿瘤复发或转移 [Terabe， M.etal.， Nat Immunol， 2000.1(6)， 515-520]。在动物模型中对 IL-13 的抑制还显示出增强抗病毒疫苗， 而且对于 HIV 和其它感染性疾病的治疗可能是有益的 [Ahlcrs， J.D.et al.， Proc Natl Acad Sci U S A， 2002.99(20)， 13020-13025]。
致力于 IL-13 抑制的抗体法已有记载。 例如， WO 2005/007699(CambridgeAntibody Technology Limited) 记载了一系列显示出中和 IL-13 活性的人抗 IL-13 抗体分子， 而且宣 称它们可在治疗 IL-13 相关病症方面可能有用。
依照本发明的第一个方面， 提供了一种药用组合物， 其包含 IL-13 抗体及一种或 多种制药学可接受赋形剂， 并用乙酸盐缓冲剂缓冲至 pH 4.5-6.0。 普遍知道抗体纯化规程通常需要多种分离技术， 诸如层析分离 ( 例如蛋白 A 层析、 离子交换层析、 诸如此类 )。这种分离方式的后果是需要使用多种不同缓冲液。例如， WO 2004/076485 中所记载的抗体纯化规程需要 50mM 甘氨酸 / 甘氨酸盐 pH8.0 用于蛋白 A 层 析、 50mM Tris-HCl pH8.0 和 20mM 磷酸钠 pH 6.5 用于 Q-Sepharose 层析、 及 25mM Tris-HCl pH8.6 用于 DEAE-sepharose 层析。
相反， 本发明只需要使用一种以固定浓度和预定 pH 存在于本发明组合物中的乙 酸盐缓冲剂， 其优点在于这种缓冲剂存在于所有 IL-13 抗体纯化步骤中。如此， 这种缓冲剂 不仅用于纯化过程开始时， 而且用于整个纯化过程， 因此缩短了操作时间、 降低了成本并提 高了产量。
应当领会， “抗体” 的术语包括免疫球蛋白， 无论是天然的或者是部分或完全合成 的。该术语还覆盖任何包含抗原结合结构域的多肽或蛋白质。
包含抗原结合结构域的抗体片段有诸如 Fab、 scFv、 Fv、 dAb、 Fd 和双抗体等分子。
有可能采用单克隆抗体和其它抗体， 并且采用重组 DNA 技术来生成保留最初抗体 特异性的其它抗体或嵌合分子。 这样的技术可涉及将编码免疫球蛋白可变区或互补决定区 (CDR) 的 DNA 导入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见例如 EP-A-184187 ； GB2188638A 或 EP-A-239400 ； 及大量后续文献。
或者， 可以生成携带 CDR 衍生序列的新 VH 或 VL 区， 即通过一种或多种选定 VH 和 / 或 VL 基因的随机诱变而在整个可变域中生成突变。Gram et al.， PNAS USA， 1992.89， 3576-3580 记载了这样一种技术， 他们采用错误倾向 PCR。 可使用的另一种方法是针对 VH 和 VL 基因 CDR 区的诱变。Barbas et al.， PNAS USA 1994.91， 3809-3813 和 Schier et al.， J.Mol.Biol.1996.263， 551-567 披露这样的技术。
因为可以以多种方法修饰抗体， 术语 “抗体” 应解释为覆盖任何包含具有所需特异 性的抗原结合结构域的特定结合成员或物质。 如此， 该术语覆盖抗体片段和衍生物， 包括任
何包含免疫球蛋白结合结构域的多肽， 无论是天然的或者是完全或部分合成的。因此还包 括包含免疫球蛋白结合结构域或等同物且其与另一多肽相融合的嵌合分子。P-A-0120694 和 EP-A-0125023 及大量后续文献中披露了嵌合抗体的克隆和表达。
抗体工程领域可利用的其它技术使之有可能分离人抗体和人源化抗体。例如， 可 以如 Kontermann et al.， [2001 ； Antibody Engineering， SpringerLaboratory Manuals] 所述来生成人杂交瘤。许多出版物， 诸如 Kontermann et al.(supra)and W092/01047 中 详细记载了为生成特定结合成员而建立的另一种技术， 噬菌体展示。小鼠抗体基因遭到灭 活并用人抗体基因功能性替换同时小鼠免疫系统的其它成分保持完整的转基因小鼠可用 于分离针对人抗原的人抗体。核糖体展示， 一种将突变导入已知基因序列的无细胞翻译 技术也可用于生成和 / 或优化特定结合成员 [Hanes and Plückthun PNAS USA， 1994.94， 4937-4942 ； He and Taussig Nucleic Acids Res.1997.25， 5132-5134 ； Schaffitzelet al.， J.Immunol.Methods， 1999.231， 119-135 ； He et al.， J.Immunol.Methods， 1999.231， 105-117 ； He et al.， Methods Mol.Biol.2004.248， 177-189]。
通过合成寡核苷酸并在合适的表达载体中进行装配， 再用所得基因进行表达， 可 以制备合成的抗体分子， 参见例如 Knappik et al.， J.Mol.Biol.2000.296， 57-86 ； Krebs et al.， Journal of Immunological Methods 2001.254， 67-84。
已经显示了完整抗体的片段可发挥结合抗原的功能。结合片段的例子有 (i) 由 VL、 VH、 CL 和 CH1 结构域组成的 Fab 片段 ； (ii) 由 VH 和 CH1 结构域组成的 Fd 片段 ； (iii) 由单一抗体的 VL 和 VH 结构域组成的 Fv 片段 ； (iv) 由 VH 或 VL 结构域组成的 dAb 片段 [Ward， E.S.et al.， Nature， 1989.341， 544-546 ； McCafferty et al.， Nature， 1990.348， 552-554 ； Holt et al.， Trends Biotechnol.2003.21(11)， 484-490] ； (v) 分离的 CDR 区 ； (vi)F(ab ′ )2 片段， 包含两个相连 Fab 片段的二价片段 ； (vii) 单链 Fv 分子 (scFv)， 其 中 VH 结构域与 VL 结构域通过肽接头相连接， 该肽接头容许这两个结构域相结合而形成 抗 原 结 合 位 点 [Bird etal.， Science， 1988.242， 423-426 ； Huston et al.， PNAS USA， 1988.85， 5879-5883] ； (viii) 双特异性单链 Fv 二聚体 (PCT/US92/09965) ； 和 (ix)“双抗 体 (diabody)” ， 通过基因融合构建的多价或多特异性片段 [WO 94/13804 ； P.Holliger et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 1993.90， 6444-6448]。Fv、 scFv 或双抗体分子可以通过掺 入连接 VH 与 VL 结构域的二硫键而加以稳定 [Y.Reiter etal.， Nature Biotech.， 1996.14， 1239-1245]。还可以生成包含 scFv 相连的 CH3 结构域的微型抗体 (minibody)[S.Hu et al.， Cancer Res.， 1996.56， 3055-3061]。
若使用双特异性抗体， 则可以是常规双特异性抗体， 其可以以多种方式来制备 [Holliger and Winter Current Opinion Biotechnol.1993.4， 446-449]， 例如以化学方法 或从杂合杂交瘤制备， 或者可以是任何上文所述双特异性抗体片段。双特异性抗体的例子 包括那些 BiTE 技术的双特异性抗体， 其中可以使用两个具有不同特异性的抗体的结合结 构域并经柔性短接头直接相连。这在一条短多肽链上联合两个 / 种抗体。双抗体和 scFv 可以构建成不含 Fc 区而只使用可变域， 从而有可能降低抗独特型反应的效应。
与双特异性完整抗体不同， 双特异性抗体也可能是特别有用的， 因为它们易于构 建并在大肠杆菌中表达。具有适宜结合特异性的双抗体 ( 和许多其它多肽诸如抗体片段 ) 易于通过噬菌体展示 (WO 94/13804) 从文库中选择。若双抗体的一条臂保持不变， 例如具有针对 IL-13 的特异性， 则可以将文库构建成另一条臂进行变化并选择具有适宜特异性的 抗体。 双特异性完整抗体可以通过隆起入空腔 (knobs-into-holes) 工程来构建 [Ridgeway et al.， Protein Eng.， 1996.9， 616-621]。
应当领会， “IL-13 抗体” 术语包括根据 WO 2005/007699 实施例 2-10 和 25 所列测 定法， 能够在低于 500nM 的浓度中和天然存在 IL-13 的完整抗体或抗体片段。
优选的是， IL-13 抗体以等于或优于由 BAK502G9VH 结构域 (WO2005/007699 中的 SEQ ID NO ： 15) 和 BAK502G9VL 结构域 (WO 2005/007699 中的 SEQ ID NO ： 16) 形成的 IL-13 抗原结合位点的效力中和天然存在的 IL-13。
优选的是， IL-13 抗体是单克隆 IL-13 抗体， 更优选人 IL-13 单克隆抗体。
特别优选的 IL-13 抗体是选自 WO 2003/035847、 WO 2003/086451、 WO2005/007699 或 WO 2005/081873 中所述的 IL-13 抗体。
例 如， 在 一 个 特 别 优 选 的 实 施 方 案 中， IL-13 抗 体 包 含 BAK278D6HCDR1-3 和 LCDR1-3( 分别是 WO 2005/007699 中的 SEQ ID NOS ： 1-6)。将具有 BAK278D6 的 CDR 组的 CDR， BAK278D6HCDR 或 BAK278D6LCDR， 或其一处或多处经过替代的 CDR 都称为 BAK278D6 谱 系的。 在 另 一 个 特 别 优 选 的 实 施 方 案 中， IL-13 抗 体 包 含 BAK502G9HCDR1-3 和 LCDR1-3( 分别是 WO 2005/007699 中的 SEQ ID NOS ： 7-12)。
在 另 一 个 特 别 优 选 的 实 施 方 案 中， IL-13 抗 体 包 含 BAK1111D10HCDR1-3 和 LCDR1-3( 分别是 WO 2005/007699 中的 SEQ ID NOS ： 91-96)。
在 另 一 个 特 别 优 选 的 实 施 方 案 中， IL-13 抗 体 包 含 BAK1167F2HCDR1-3 和 LCDR1-3( 分别是 WO 2005/007699 中的 SEQ ID NOS ： 61-66)。
在 另 一 个 特 别 优 选 的 实 施 方 案 中， IL-13 抗 体 包 含 BAK1183H4HCDR1-3 和 LCDR1-3( 分别是 WO 2005/007699 中的 SEQ ID NOS ： 97-102)。
可以在抗体框架区或其它蛋白支架例如纤连蛋白或细胞色素 B 中提供相关 CDR 组 [Koide et al.， J.Mol.Biol.1998.284， 1141-1151 ； Nygren et al.， Current Opinion in Structural Biology， 1997.7， 463-469]。优选采用抗体框架区， 而且在采用它们时， 它们优选是种系的， 更优选的是， 重链的抗体框架区可以是来自 VH1 家族的 DP14。轻链 的优选框架区可以是 λ3-3H。对于 BAK502G9CDR 组， 优选的是， VH FR1-3 的抗体框架 区 分 别 是 WO2005/007699 中 的 SEQ ID NOS ： 27-29， 而 VL FR1-3 的 抗 体 框 架 区 分 别 是 WO2005/007699 中的 SEQ ID NOS ： 30-32。在一个优选的实施方案中， 所提供的 VH 结构域 具有 WO 2005/007699 中 SEQ ID NO ： 15 的氨基酸序列， 这称为 “BAK502G9VH 结构域” 。在另 一个高度优选的实施方案中， 所提供的 VL 结构域具有 WO 2005/007699 中 SEQ ID NO ： 16 的 氨基酸序列， 这称为 “BAK502G9VL 结构域” 。
在一个优选的实施方案中， IL-13 抗体与猕猴 (cynomologous)IL-13 和 / 或 IL-13 变体 Q130R 发生交叉反应。
优选的是， IL-13 抗体以 1-200mg/ml、 更优选 50-100mg/ml、 尤其是 50mg/ml 的量 存在于药物组合物中。
优选的是， 将药物组合物缓冲至 pH 5.2-5.7， 最优选 5.5±0.1。选择这样一种 pH 赋予药物组合物以显著稳定性。在此范围内控制 pH 的备选缓冲剂的例子包括琥珀酸盐、 葡
萄糖酸盐、 组氨酸、 柠檬酸盐、 磷酸盐、 戊二酸盐、 卡可基酸盐、 马来酸氢钠、 三 ( 羟甲基 ) 氨 基甲烷 (Tris)、 2-(N- 吗啉代 ) 乙磺酸 (MES)、 咪唑和其它有机酸缓冲剂。
优选的是， 缓冲剂是乙酸盐缓冲剂， 更优选乙酸钠。
优选的是， 乙酸盐缓冲剂以 1-100mM、 更优选 30-70mM、 尤其是 50mM 的量存在于药 物组合物中。
应当领会， 提及的 “制药学可接受赋形剂” 包括药物组合物中常规使用的任何赋形 剂。 这样的赋形剂通常可以包括一种或多种表面活性剂、 无机或有机盐、 稳定剂、 稀释剂、 增 溶剂、 还原剂、 抗氧化剂、 螯合剂、 防腐剂、 诸如此类。
典型的表面活性剂的例子包括 ： 非离子表面活性剂 (HLB 6-18)， 诸如山梨聚糖脂 肪酸酯 (sorbitan fatty acid ester)( 例如山梨聚糖单辛酸酯、 山梨聚糖单月桂酸酯、 山 梨聚糖单棕榈酸酯 )、 甘油脂肪酸酯 ( 例如甘油单辛酸酯、 甘油单肉豆蔻酸酯、 甘油单硬脂 酸酯 )、 聚甘油脂肪酸酯 ( 例如聚甘油 ( 十 ) 单硬脂酸酯、 聚甘油 ( 十 ) 双硬脂酸酯、 聚甘 油 ( 十 ) 单亚油酸酯 )、 聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯 ( 例如聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯、 聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯、 聚氧乙烯山梨聚糖单硬脂酸酯、 聚氧乙烯山梨聚糖单棕榈酸 酯、 聚氧乙烯山梨聚糖三油酸酯、 聚氧乙烯山梨聚糖三硬脂酸酯 )、 聚氧乙烯山梨醇脂肪酸 酯 ( 例如聚氧乙烯山梨醇四硬脂酸酯、 聚氧乙烯山梨醇四油酸酯 )、 聚氧乙烯甘油脂肪酸酯 ( 例如聚氧乙烯甘油基单硬脂酸酯 )、 聚乙二醇脂肪酸酯 ( 例如聚乙二醇双硬脂酸酯 )、 聚氧 乙烯烷基醚 ( 例如聚氧乙烯月桂醚 )、 聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚 ( 例如聚氧乙烯聚氧丙二 醇醚、 聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚、 聚氧乙烯聚氧丙烯鲸蜡基醚 )、 聚氧乙烯烷基苯基醚 ( 例 如聚氧乙烯壬基苯基醚 )、 聚氧乙烯氢化蓖麻油 ( 例如聚氧乙烯蓖麻油、 聚氧乙烯氢化蓖麻 油 )、 聚氧乙烯蜂蜡 (bees wax) 衍生物 ( 例如聚氧乙烯山梨醇蜂蜡 )、 聚氧乙烯羊毛脂衍 生物 ( 例如聚氧乙烯羊毛脂 )、 和聚氧乙烯脂肪酸酰胺 ( 例如聚氧乙烯硬脂酸酰胺 ) ； 阴离 子表面活性剂， 诸如 C10-C18 烷基硫酸酯盐 ( 例如十六烷基硫酸钠、 十二烷基硫酸钠、 油酰 硫酸钠 (oleyl sulfate))、 具有平均 2-4 摩尔环氧乙烷的聚氧乙烯 C10-C18 烷基醚硫酸酯 盐 ( 例如聚氧乙烯十二烷基硫酸钠 )、 和 C8-C18 烷基磺基琥珀酸酯盐 ( 例如十二烷基磺基 琥珀酸酯钠 ) ； 和天然表面活性剂， 诸如卵磷脂、 甘油磷脂、 鞘磷脂 (sphingophospholipid) ( 例如鞘磷脂 (sphingomyelin))、 和 C12-C18 脂肪酸的蔗糖酯。
优选的是， 表面活性剂选自聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯。 特别优选的是， 表面活性 剂是聚山梨醇酯 20、 21、 40、 60、 65、 80、 81 和 85， 最优选聚山梨醇酯 20 和 80， 尤其聚山梨醇 酯 80。
优选的是， 表面活性剂以 0.001-0.1％ (w/w)、 更优选 0.005-0.05％ (w/w)、 尤其是 0.01％ (w/w) 的量存在于药物组合物中。
典型的无机盐的例子包括 ： 氯化钠、 氯化钾、 氯化钙、 磷酸钠、 硫酸钠、 硫酸铵、 磷酸 钾和碳酸氢钠， 或者任何其它钠盐、 钾盐或钙盐。优选的是， 无机盐是氯化钠。
优选的是， 无机盐以 10-200mM、 更优选 60-130mM、 尤其是 85mM 的量存在于药物组 合物中。
还原剂的例子包括 N- 乙酰基半胱氨酸、 N- 乙酰基高半胱氨酸、 硫辛酸、 硫代二 甘醇、 硫代乙醇胺、 硫代甘油、 硫代山梨醇、 硫代乙醇酸及其盐、 硫代硫酸钠、 谷胱甘肽、 和 C1-C7 硫代链烷酸。抗氧化剂的例子包括异抗坏血酸 (erythorbic acid)、 二丁基羟基甲苯、 丁基羟基 苯甲醚、 α- 生育酚、 乙酸生育酚、 L- 抗坏血酸及其盐、 L- 抗坏血酸棕榈酸酯、 L- 抗坏血酸 硬脂酸酯、 亚硫酸氢钠、 亚硫酸钠、 没食子酸三戊酯、 和没食子酸丙酯。
螯合剂的例子包括乙二胺四乙酸 (EDTA) 二钠、 焦磷酸钠、 和偏磷酸钠。
稳定剂的例子包括肌酸酐、 选自组氨酸、 丙氨酸、 谷氨酸、 甘氨酸、 亮氨酸、 苯丙 氨酸、 甲硫氨酸、 异亮氨酸、 脯氨酸、 天冬氨酸、 精氨酸、 赖氨酸和苏氨酸的氨基酸、 选自蔗 糖、 海藻糖、 山梨醇、 木糖醇和甘露糖的碳水化合物、 选自聚乙二醇 (PEG ； 例如 PEG3350 或 PEG4000) 或聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯 ( 例如聚山梨醇酯 20 或聚山梨醇酯 80) 的表面活 性剂、 或其任意组合。
在一个优选实施方案中， 稳定剂包含上文定义的单一的碳水化合物 ( 例如海藻 糖 )。
在另一个优选实施方案中， 稳定剂包含氨基酸及碳水化合物 ( 例如海藻糖及丙氨 酸， 或者海藻糖、 丙氨酸及甘氨酸 )。
在又一个优选实施方案中， 稳定剂包含氨基酸及碳水化合物和表面活性剂 ( 例如 海藻糖、 丙氨酸及 PEG3350， 或者海藻糖、 脯氨酸及 PEG3350， 或者海藻糖、 丙氨酸及聚山梨 醇酯 80， 或者海藻糖、 脯氨酸及聚山梨醇酯 80， 或者海藻糖、 丙氨酸、 甘氨酸及 PEG3350， 或 者海藻糖、 丙氨酸、 甘氨酸及聚山梨醇酯 80)。 在又一个优选实施方案中， 稳定剂包含氨基酸及表面活性剂 ( 例如丙氨酸及 PEG3350， 或者丙氨酸、 甘氨酸及 PEG3350)。
在又一个优选实施方案中， 稳定剂包含碳水化合物及表面活性剂 ( 例如海藻糖及 PEG3350， 或者海藻糖及聚山梨醇酯 80)。
防 腐 剂 的 例 子 包 括 氯 化 十 八 烷 基 二 甲 基 苄 基 铵 (octadecyldimethylbenzyla mmonium chloride)、 氯 己 双 胺 (hexamethonium chloride)、 苯 扎 氯 铵 (benzalkonium chloride)( 氯 化 烷 基 苄 基 二 甲 基 铵 混 合 物， 其 中 烷 基 是 长 链 化 合 物 )、 苄索氯铵 (benzethonium chloride)， 芳香醇诸如酚、 丁醇和苯甲醇， 烷基对羟基苯甲酸酯 (alkyl paraben) 诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯， 邻苯二酚、 间苯二酚、 环己醇、 3- 戊醇、 和间甲酚。
在本发明的一个优选实施方案中， 药物组合物包含 IL-13 抗体、 表面活性剂和无 机盐， 并用乙酸盐缓冲剂缓冲至 pH 5.5±0.1。
在本发明的另一个优选实施方案中， 药物组合物包含 IL-13 抗体、 氯化钠和聚山 梨醇酯 80， 并用乙酸钠缓冲剂缓冲至 pH 5.5±0.1。
在本发明的又一个优选实施方案中， 药物组合物包含 50mg/ml IL-13 抗体、 85mM 氯化钠和 0.01％ (w/w) 聚山梨醇酯 80， 并用 50mM 乙酸钠缓冲剂缓冲至 pH 5.5±0.1。
依照本发明的第二个方面， 提供了用于纯化 IL-13 抗体的方法， 其包括一个或多 个层析分离步骤， 其中每个分离步骤包括用包含一种或多种制药学可接受赋形剂并用乙酸 盐缓冲剂缓冲至 pH 3.5-7.0 的洗脱缓冲液进行洗脱。
优选的是， 一个或多个层析分离步骤选自亲和层析 ( 例如蛋白 A 或蛋白 G 亲和层 析 )、 离子交换层析 ( 例如阳离子和阴离子交换层析 )、 疏水相互作用层析 ( 例如苯基层 析 )、 羟磷灰石层析、 大小排阻层析、 固定化金属亲和层析、 亲水相互作用层析、 亲硫吸附层 析、 优球蛋白吸附层析、 染料配体层析、 或固定化硼酸盐层析。 最优选的是， 层析分离通过蛋
白 A 亲和层析， 之后是阳离子交换层析 ( 例如使用 SP-sepharose 基质 )， 再之后是阴离子交 换层析 ( 例如使用 Q-sepharose 基质 ) 来进行。
优选的是， 所述一种或多种制药学可接受赋形剂包含无机盐， 诸如氯化钠。
优选的是， 无机盐以 10-200mM、 更优选 60-130mM、 尤其是 85mM 的量存在于洗脱缓 冲液中。
控制 pH 在 3.5-7.0 范围内的备选缓冲剂的例子包括琥珀酸盐、 葡萄糖酸盐、 组氨 酸、 柠檬酸盐、 磷酸盐和其它有机酸缓冲剂。
优选的是， 缓冲剂是乙酸盐缓冲剂， 更优选乙酸钠缓冲剂。
优选的是， 乙酸盐缓冲液以 1-100mM、 更优选 30-70mM、 尤其是 50mM 的量存在于洗 脱缓冲液中。
最优选的是， 洗脱缓冲液包含 50mM 乙酸钠和 85mM 氯化钠， 并缓冲至 pH 5.5±0.1。
可以通过在适宜条件下培养包含下述核酸的重组宿主细胞来表达编码任何本发 明 IL-13 抗体 ( 例如 CDR 或 CDR 组或 VH 结构域或 VL 结构域或抗原结合位点或抗体分子， 例如 scFv 或 IgG4， 像所提供的那样 ) 的核酸。在通过表达而生成后， 可以使用任何合适技 术来分离和 / 或纯化 VH 或 VL 结构域或者特定结合成员， 然后根据需要使用。
所提供的特定结合成员、 VH 和 / 或 VL 结构域、 及编码核酸分子和载体可以分离和 / 或纯化自例如它们的天然环境， 它们处于基本纯的或同质的形式， 或者在核酸的情况中不 含或基本上不含具有所需功能的多肽的编码序列以外的核酸或基因源。核酸可以包含 DNA 或 RNA， 而且可以整个或部分是合成的。
本文中在提及核苷酸序列时涵盖具有具体序列的 DNA 分子， 且涵盖具有具体序 列、 其中用 U 替代 T 的 RNA 分子， 除非另有说明。
用于在多种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是众所周知的。 合适的宿主细 胞包括细菌、 哺乳动物细胞、 植物细胞、 酵母、 杆状病毒系统、 及转基因植物和动物。
本领域可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞、 HeLa 细胞、 幼仓鼠肾细胞、 NS0 小鼠黑素瘤细胞、 YB2/0 大鼠骨髓瘤细胞、 人胚肾细胞、 人胚 视网膜细胞等。
优选的是， 所述哺乳动物细胞系是骨髓瘤细胞培养物， 诸如例如 NS0 细胞 |Galfre and Milstein， Methods Enzymology， 1981.73 ： 3]。骨髓瘤细胞有浆细胞瘤细胞， 即淋巴 样细胞谱系的细胞。一种例示性的 NS0 细胞系有例如细胞系 ECACC No.85110503， 可以从 供应用微生物学和研究之用的欧洲细胞培养物收藏中心 (European Collection of Cell Cultures(ECACC)， Centre for AppliedMicrobiology &Research， Salisbury， Wiltshire， SP40JG， United Kingdom) 免费获得。已发现 NS0 能够产生极高产量的产物， 特别是在用于 生成重组抗体时。
另一种优选的哺乳动物细胞系是中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞。它可以是二氢叶酸还 原酶 (dhfr) 缺陷的， 因而其生长依赖于胸苷和次黄嘌呤 [PNAS， 1990， 77 ： 4216-4220]。用 抗体基因和 dhfr 基因转染亲本 dhfr-CHO 细胞系， 从而能够选择具有 dhfr 阳性表型的 CHO 细胞转化体。通过在缺少胸苷和次黄嘌呤的培养基上培养集落来进行选择， 胸苷和次黄嘌 呤的缺乏阻止了未转化细胞的生长， 而转化细胞恢复了叶酸途径， 从而规避了选择系统。 由 于两种转染基因的共整合， 这些转化体通常表达低水平的基因产物。可以通过使用甲氨蝶呤 (MTX) 的扩增来提高抗体基因的表达水平。这种药物是 dhfr 酶的直接抑制剂， 从而能够 分离扩增其 dhfr 基因拷贝数并足以在这些条件下存活的抗性集落。由于 dhff 与抗体基因 在最初的转化体中最密切相连， 所以通常存在相伴扩增， 从而提高所需抗体基因的表达。
与 CHO 或骨髓瘤细胞一起使用的另一种选择系统是 WO 87/04462 中记载的谷氨酸 合成酶 (GS) 扩增系统。该系统牵涉用编码 GS 酶的基因和所需抗体基因转染细胞。然后选 择在不含谷氨酰胺的培养基中生长的细胞。然后对所选择的这些克隆用甲硫氨酸砜亚胺 (methionine sulphoximine， MSX) 抑制 GS 酶。细胞为了存活将扩增 GS 基因， 相伴扩增编 码抗体的基因。
本领域已完全建立了抗体和抗体片段在原核细胞诸如大肠杆菌中的表达。 综述参 见例如 Pluckthun A.， Bio/Technology 1991.9 ： 545-551。本领域技术人员还可利用真核 细胞培养物中的表达作为生成例如特定结合成员的选项 |Chadd， H.E.and Chamow， S.M.， Current Opinion in Biotechnology 2001.12 ： 188-194 ； Andersen， D.C.and Krummen， L， Current Opinion in Biotechnology2002.13 ： 117 ； Larrick， J.W.and Thomas， D.W.， Current opinion inBiotechnology 2001.12 ： 411-418]。
可以选择或构建合适的载体， 其包含适宜的调控序列， 包括启动子序列、 终止 子序列、 聚腺苷酸化序列、 增强子序列、 标志基因、 和需要的其它序列。根据需要， 载体 可 以 是 质 粒、 病 毒 例 如 噬 菌 体、 或 噬 菌 粒。 更 多 细 节 参 见 例 如 Molecular Cloning ： a Laboratory Manual ： 3rd edition， Sambrook and Russell， 2001.Cold Spring Harbor Laboratory Press。用于操作核酸的许多已知技术和方案， 例如制备核酸构建物、 诱变、 测 序、 将 DNA 导 入 细 胞、 表 达 基 因、 和 分 析 蛋 白 质， 详 细 描 述 于 Current Protocols in Molecular Biology， 2nd Edition， Ausubel et al.eds.， John Wiley&Sons， 1988 ； Short Protocols in MolecularBiology ： A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology， Ausubel et al.eds.， John Wiley&Sons， 4th edition 1999。将 Sambrook 等人和 Ausubel 等人的公开内容收入本文作为参考。
将核酸导入宿主细胞可采用任何可利用的技术。对于真核细胞， 合适的技术可包 括磷酸钙转染、 DEAE- 右旋糖苷、 电穿孔、 脂质体介导的转染、 及使用逆转录病毒或其它病毒 例如痘苗病毒的转导， 对于昆虫细胞， 使用杆状病毒。将核酸导入宿主细胞， 特别是真核细 胞可使用基于病毒或质粒的系统。质粒系统可作为附加体 (episomally) 来操作， 或者可掺 入宿主细胞或掺入人工染色体 [Csonka， E.et al.， Journal of Cell Science， 200.113 ： 3207-3216 ； Vanderbyl， S.et al.， Molecular Therapy， 2002.5(5) ： 10]。掺入可以是单个 或多个基因座处一个或多个拷贝的随机或靶向整合。对于细菌细胞， 合适的技术可包括氯 化钙转化、 电穿孔、 及使用噬菌体的感染。
导入之后可通过例如在适于表达基因的条件下培养宿主细胞来引起或容许核酸 表达。
在一个实施方案中， 本发明的核酸整合入宿主细胞的基因组 ( 例如染色体 )。
依照标准技术， 可通过包含促进与基因组重组的序列来促进整合。
依照本发明的第三方面， 提供了本文定义的药物抗体组合物在制备用于治疗 IL-13 相关病症的药物中的用途。
优 选 的 是， 所 述 IL-13 相 关 病 症 选 自 哮 喘、 特 应 性 皮 炎、 变 应 性 鼻 炎、 纤维化(fibrosis)、 慢性阻塞性肺病、 硬皮病、 炎性肠病 (inflammatory bowel disease) 和何杰金 氏淋巴瘤。本发明的组合物还可用于治疗肿瘤和病毒感染， 因为 IL-13 抗体能抑制 IL-13 介导的免疫抑制。最优选的是， IL-13 相关病症是哮喘。
本发明进一步提供了治疗或预防 IL-13 相关病症的方法， 其包括对患者施用治疗 有效量的本文定义的药物抗体组合物。
本发明进一步提供了本文定义的药物抗体组合物， 其用于治疗 IL-13 相关病症。
本发明的药物组合物可以是液体剂型或在使用前重建的冻干剂型。 可以使用冻干 剂型的赋形剂， 例如糖醇或糖 ( 例如甘露醇或葡萄糖 )。在液体剂型的情况中， 本发明的药 物组合物通常以具有确定体积的容器的形式提供， 包括密封和已灭菌的塑料或玻璃管、 安 瓿和注射器， 以及大体积容器的形式， 像瓶子。优选的是， 本发明的组合物是液体剂型。
本发明的药物组合物可以通过口服、 通过注射 ( 例如皮下、 静脉内、 腹膜内或肌肉 内 )、 通过吸入、 或局部的 ( 例如眼内、 鼻内、 直肠、 伤口、 皮肤 ) 来施用。施用路径可以根据 治疗的物理化学特征、 关于疾病的特殊考虑、 或者优化功效或降低副作用的要求来决定。
优选的是， 本发明的组合物通过皮下注射来施用。 设想了治疗不限于临床使用。 因 此， 使用无针头装置的皮下注射也可以是优选的。 依照本发明， 可将所提供的组合物施用于个人。施用优选是 “治疗有效量” 的， 这足以显示出对患者的益处。所述益处可以至少是至少一种症状的缓解。所施用的实际 量、 及施用的速率和时程取决于所治疗病症的本质和严重程度。治疗的处方， 例如关于剂 量的决定等， 在普通开业医师和其它医生的职责之内。抗体的适宜剂量在本领域是众所周 知的 [Ledermann， J.A.et al.， Int.J.Cancer， 1999.47 ： 659-664 ； Bagshawe， K.D.et al.， Antibody， Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals， 1991.4 ： 915-922]。
精确剂量取决于许多因素， 包括待治疗区域的大小和位置、 抗体的确切本质 ( 例 如完整抗体、 片段或双抗体 )、 及附着于抗体的任何可检测标记物或其它分子的本质。典型 的抗体剂量对于系统应用为 100pg-10g 和用于局部应用为 1μg-100mg 的范围内。
通常， 抗体是完整抗体， 优选 IgG4 同种型。成人患者的单次治疗剂量在按比例调 整后可用于儿童和婴幼儿， 并且对其它抗体形式根据分子量按比例进行调整。可以以每日 一次、 每周两次、 每周一次、 或每月一次的间隔重复进行治疗， 这由医师决定。 在本发明的优 选实施方案中， 治疗是定期的， 而且两次施用之间的间隔为大约 2 周或更长， 优选大约 3 周 或更长， 更优选大约 4 周或更长， 或者大约每月一次施用。
本发明还涉及 ：
1. 一种药物组合物， 其包含 IL-13 抗体及一种或多种制药学可接受赋形剂， 并用 乙酸盐缓冲剂缓冲至 pH 4.5-6.0。
2. 依照项 1 的药物组合物， 其中所述 IL-13 抗体是人 IL-13 单克隆抗体。
3. 依照项 1 或 2 的药物组合物， 其中所述 IL-13 抗体以 1-200mg/ml 的量存在于所 述药物组合物中。
4. 依照前述项任一项的药物组合物， 其缓冲至 pH 5.2-5.7。
5. 依照前述项任一项的药物组合物， 其包含乙酸钠， 所述乙酸钠以 1-100mM 的量 存在于所述药物组合物中。
6. 依照前述项任一项的药物组合物， 其中所述制药学可接受赋形剂包括一种或多
种表面活性剂、 无机或有机盐、 稳定剂、 稀释剂、 增溶剂、 还原剂、 抗氧化剂、 螯合剂和 / 或防 腐剂。
7. 依照项 6 的药物组合物， 其中所述表面活性剂选自聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸 酯。
8. 依照项 7 的药物组合物， 其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯 80， 所述聚山梨醇 酯 80 以 0.001-0.1％ (w/w) 的量存在于所述药物组合物中。
9. 依照项 6-8 任一项的药物组合物， 其中所述无机盐包括氯化钠、 氯化钾、 氯化 钙、 磷酸钠、 磷酸钾和碳酸氢钠。
10. 依照项 9 的药物组合物， 其中所述无机盐是氯化钠， 所述氯化钠以 10-200mM 的 量存在于所述药物组合物中。
11. 依照项 1 的药物组合物， 其包含 IL-13 抗体、 表面活性剂和无机盐， 并用乙酸盐 缓冲剂缓冲至 pH 5.5±0.1。
12. 依照项 1 的药物组合物， 其包含 IL-13 抗体、 氯化钠和聚山梨醇酯 80， 并用乙 酸盐缓冲剂缓冲至 pH 5.5±0.1。
13. 依照项 1 的药物组合物， 其包含 50mg/ml IL-13 抗体、 85mM 氯化钠和 0.01％ (w/w) 聚山梨醇酯 80， 并用 50mM 乙酸钠缓冲剂缓冲至 pH 5.5±0.1。 14. 用于纯化 IL-13 抗体的方法， 其包括一个或多个层析分离步骤， 其中每一个 所述分离步骤包括用含有一种或多种制药学可接受赋形剂并用乙酸盐缓冲剂缓冲至 pH 3.5-7.0 的洗脱缓冲液进行洗脱。
15. 依照项 14 的方法， 其中所述层析分离步骤选自亲和层析和离子交换层析。
16. 依照项 15 的方法， 其中所述层析分离是通过蛋白 A 亲和层析接着阳离子交换 层析再接着阴离子交换层析而进行的。
17. 依照项 14-16 任一项的方法， 其中所述一种或多种制药学可接受赋形剂包括 无机盐。
18. 依照项 17 的方法， 其中所述无机盐是氯化钠， 所述氯化钠以 10-200mM 的量存 在于所述洗脱缓冲液中。
19. 依照项 14-18 任一项的方法， 其中所述乙酸盐缓冲剂是乙酸钠， 所述乙酸钠以 1-100mM 的量存在于所述洗脱缓冲液中。
20. 依照项 14-19 任一项的方法， 其中所述洗脱缓冲液含有 50mM 乙酸钠和 85mM 氯 化钠， 并缓冲至 pH 5.5±0.1。
21. 依照项 1-13 任一项的药物组合物在制备用于治疗 IL-13 相关病症的药物中的 用途。
22. 依照项 21 的用途， 其中所述 IL-13 相关病症选自哮喘、 特应性皮炎、 变应性鼻 炎、 纤维化、 慢性阻塞性肺病、 硬皮病、 炎性肠病和何杰金氏淋巴瘤。
23. 依照项 22 的用途， 其中所述 IL-13 相关病症是哮喘。
24. 治疗或预防 IL-13 相关病症的方法， 其包括对患者施用治疗有效量的依照项 1-13 任一项的药用抗体组合物。
25. 依照项 1-13 任一项的药用抗体组合物， 其是用于治疗 IL-13 相关病症的药用 抗体组合物。
附图简述 图 1 显示了各样品在本发明组合物 28 天稳定性评估的第 1 天的 SDS-PAGE 分析结 图 2 显示了各样品在本发明组合物 28 天稳定性评估的第 21 天的 SDS-PAGE 分析 图 3 显示了各样品在本发明组合物 28 天稳定性评估的第 1 天的 GP-HPLC 分析结果。
结果。
果。 图 4 显示了各样品在本发明组合物 2-8℃ 28 天稳定性评估期间的 GP-HPLC 分析结 果的层析图。
图 5 显示了各样品在本发明组合物 25℃ 28 天稳定性评估期间的 GP-HPLC 分析结 果的层析图。
图 6 显示了各样品在本发明组合物用不同缓冲液中和的 28 天稳定性评估期间的 GP-HPLC 分析结果的层析图。
图 7 显示了各样品在本发明组合物 28 天稳定性评估的第 28 天的 IEF 分析结果。
图 8 显示了不同制剂于 -70℃存储的 12 个月稳定性评估的凝胶过滤 HPLC 分析结 果。
图 9 显示了不同制剂于 +5℃存储的 12 个月稳定性评估的凝胶过滤 HPLC 分析结 果。
图 10 显示了不同制剂于 +25℃存储的 12 个月稳定性评估的凝胶过滤 HPLC 分析结 果。
图 11 显示了不同制剂于 +37℃存储的 8 周稳定性评估的凝胶过滤 HPLC 分析结果。
图 12 显示了不同制剂于 +45℃存储的 5 天稳定性评估的凝胶过滤 HPLC 分析结果。
图 13 显示了不同制剂于 -70℃存储的 12 个月稳定性评估期间第 0、 6 和 12 个月的 还原性 SDS-PAGE 分析结果。
图 14 显示了于 -70℃存储的图 13 中还原性 SDS-PAGE 分析之后 BAK502G9 重链和 轻链的百分比丰度。
图 15 显示了不同制剂于 +5℃存储的 12 个月稳定性评估期间第 0、 6 和 12 个月的 还原性 SDS-PAGE 分析结果。
图 16 显示了于 +5℃存储的图 15 中还原性 SDS-PAGE 分析之后 BAK502G9 重链和轻 链的百分比丰度。
图 17 显示了不同制剂于 +25℃存储的 12 个月稳定性评估期间第 0、 6 和 12 个月的 还原性 SDS-PAGE 分析结果。
图 18 显示了于 +25℃存储的图 17 中还原性 SDS-PAGE 分析之后 BAK502G9 重链和 轻链的百分比丰度。
图 19 显示了不同制剂于 +37℃存储的 8 周稳定性评估期间第 0 和 8 周的还原性 SDS-PAGE 分析结果。
图 20 显示了于 +37℃存储的图 19 中还原性 SDS-PAGE 分析之后 BAK502G9 重链和 轻链的百分比丰度。
图 21 显示了不同制剂于 +45℃存储的 5 天稳定性评估期间第 0 和 5 天的还原性
SDS-PAGE 分析结果。
图 22 显示了于 +45℃存储的图 21 中还原性 SDS-PAGE 分析之后 BAK502G9 重链和 轻链的百分比丰度。
图 23 显示了不同制剂于 -70℃存储的 12 个月稳定性评估期间第 0、 6 和 12 个月的 非还原性 SDS-PAGE 分析结果。
图 24 显示了于 -70℃存储的图 23 中非还原性 SDS-PAGE 分析之后完整 BAK502G9 单体的百分比丰度。
图 25 显示了不同制剂于 +5℃存储的 12 个月稳定性评估期间第 0、 6 和 12 个月的 非还原性 SDS-PAGE 分析结果。
图 26 显示了于 +5℃存储的图 25 中非还原性 SDS-PAGE 分析之后完整 BAK502G9 单 体的百分比丰度。
图 27 显示了不同制剂于 +25℃存储的 12 个月稳定性评估期间第 0、 6 和 12 个月的 非还原性 SDS-PAGE 分析结果。
图 28 显示了于 +25℃存储的图 27 中非还原性 SDS-PAGE 分析之后完整 BAK502G9 单体的百分比丰度。
图 29 显示了不同制剂于 +37℃存储的 8 周稳定性评估期间第 0 和 8 周的非还原性 SDS-PAGE 分析结果。
图 30 显示了于 +37℃存储的图 29 中非还原性 SDS-PAGE 分析之后完整 BAK502G9 单体的百分比丰度。
图 31 显示了不同制剂于 +45℃存储的 5 天稳定性评估期间第 0 和 5 天的非还原性 SDS-PAGE 分析结果。
图 32 显示了于 +45℃存储的图 31 中非还原性 SDS-PAGE 分析之后完整 BAK502G9 单体的百分比丰度。 实施例 下面参照以下方法和实施例来阐述本发明， 仅作为例示。
实施例 1 ： BAK502G9 的表达
以与 WO 87/04462 和 WO 2004/076485 中所述规程类似的方式在 GS NS0 细胞系中 表达 BAK502G9， 所得培养物上清液含 598mg/l BAK502G9 抗体。
实施例 2 ： BAK502G9 的纯化
(a)rmp 蛋白 A Sepharose 纯化
rmp 蛋白 A Sepharose fast flow 层析步骤所使用的柱为 2.6cm 直径， 在 0.9％ w/v 氯化钠中装柱， 床高 14.5cm， 柱体积 77ml。 树脂来自 GE Healthcare/Amersham Biosciences 17-5138。层析使用 Amersham Biosciences P-50 泵、 UV1 检测仪和流动室 (flow cell) 进 行。将柱在使用前用 6M 盐酸胍清洁。
用水清洗和清洁后， 随后将 rmp 蛋白 A Sepharose fast flow 柱用 350ml 磷酸盐 缓冲盐水 pH7.2 平衡。将 2.6 升培养物上清液直接于室温以 200cm/ 小时加载到柱上。
然后用 567ml 磷酸盐缓冲盐水 pH7.2， 接着用 568ml 50mM 乙酸钠 pH5.55 清洗柱。 通过用 380ml 50mM 乙酸钠 pH3.75 进行清洗， 从柱上洗脱 BAK502G9 抗体。洗脱后， 用 50mM
乙酸 pH3.0 清洗柱。
在峰的上下坡最大 UV 偏差 2％之间收集洗脱峰。 在 217ml 中回收了 1.5gBAK502G9 抗体。
(b) 低 pH 病毒灭活
将 rmp 蛋白 A Sepharose fast flow 洗出液用 173ml100mM 乙酸调整至 pH 3.70。 然后将调整后的洗出液静置 60 分钟以灭活病毒。然后将调整后的洗出液用 437ml 50mM 氢 氧化钠中和至 pH5.50， 并使用 Millipore stericup( 产品号 SCGPU11RE) 进行 0.22μm 过 滤。在 823ml 中回收了 1.4g BAK502G9 抗体。
(c)SP Sepharose 纯化
SP Sepharose fast flow 层析步骤所使用的柱为 1.6cm 直径， 在磷酸盐缓冲盐水 pH7.2 中装柱， 床高 15.5cm， 柱体积 31ml。 树脂来自 GE Healthcare/Amersham Biosciences 17-0729。层析使用 Amersham Biosciences P-50 泵、 UV1 检测仪和流动室 (flow cell) 进 行。将柱在使用前用 0.5M 氢氧化钠清洁。
用水清洗和清洁后， 随后将 SP Sepharose fast flow 柱用 145ml 50mM 乙酸钠 pH5.50 平衡。 将 400ml BAK502G9 抗体 ( 作为中和后的 rmp 蛋白 A 洗出液 ) 直接于室温以 200cm/ 小时加载到柱上。
然后用 302ml 50mM 乙酸钠 +30mM 氯化钠 pH5.50 清洗柱。
通过用 150ml 50mM 乙酸钠 +85mM 氯化钠 pH5.50 进行清洗， 从柱上洗脱 BAK502G9 抗体。洗脱后， 用 50mM 乙酸钠 +2M 氯化钠 pH5.50 清洗柱。
在峰的上坡最大 UV 偏差 2％与下坡最大 UV 偏差 30％之间收集洗脱峰。将洗出液 用 Millipore steriflip( 产品号 SCGPOO525) 进行 0.22μm 过滤。在 54ml 中回收了 0.67g BAK502G9 抗体。
对剩余的 392ml BAK502G9 抗体 ( 作为中和后的 rmp 蛋白 A 洗出液 ) 重复此加工步 骤。 又在 54ml 中回收了 0.67g BAK502G9 抗体。 在下一步前合并两份过滤后的 SP Sepharose 洗出液。
(d)Q Sepharose Fast Flow 层析
Q Sepharose fast flow 层析步骤所使用的柱为 1.6cm 直径， 在磷酸盐缓冲盐水 pH7.2 中装柱， 床高 13.3cm， 柱体积 27ml。 树脂来自 GE Healthcare/Amersham Biosciences 17-0510。层析使用 Amersham Biosciences P-50 泵、 UV1 检测仪和流动室 (flow cell) 进 行。将柱在使用前用 0.5M 氢氧化钠清洁。
用水清洗和清洁后， 随后将 Q Sepharose fast flow 柱用 138ml 50mM 乙酸钠 +85mM 氯化钠 pH5.50 平衡。
将 44ml BAK502G9 抗体 ( 作为 SP Sepharose 洗出液 ) 直接于室温以 200cm/ 小时 加载到柱上。
通过用 124ml 50mM 乙酸钠 +85mM 氯化钠 pH5.50 清洗柱， 进行 BAK502G9 抗体的等 度洗脱 (isocratic elution)。洗脱后， 用 50mM 乙酸钠 +2M 氯化钠 pH5.50 清洗柱。
在 峰 的 上 下 坡 最 大 UV 偏 差 2 ％ 之 间 收 集 洗 脱 峰。 将 洗 出 液 用 Milliporesteriflip( 产 品 号 SCGPU01RE) 进 行 0.22μm 过 滤。 在 88ml 中 回 收 了
0.52gBAK502G9 抗体。对剩余的 44ml BAK502G9 抗体 ( 作为 SP Sepharose 洗出液 ) 重复此 加工步骤。 又在 51ml 中回收了 0.54g BAK502G9 抗体。 然后合并两份过滤后的 Q Sepharose 洗出液。
(e) 浓缩
产品是在 50mM 乙酸钠 +85mM 氯化钠 pH5.50 中获得的， 不需要渗滤。
将 17.5 升中的 95.31g BAK502G9 抗体 ( 作为 Q Sepharose 滤出液 ) 浓缩至 1.5 升。使用 Millipore Pellicon 2TFF 系统和 0.1M230KDa 膜 (MilliporeP2B030A01) 来进行 浓缩。然后从该器材中回收 BAK502G9 抗体， 然后用 50mM 乙酸钠 +85mM 氯化钠 pH5.50 缓冲 冲洗该器材。然后将浓缩后的抗体与缓冲冲洗液 (buffer flush) 合并。将 1.67ml 10％ w/v 聚山梨醇酯 80 添加至合并液， 聚山梨醇酯 80 的终浓度为 0.01％ w/v。然后将合并液进 行 0.22μm 过滤。在 1.67 升中回收了 91.6 克 BAK502G9 抗体。
(f) 所用材料
用于配制上述缓冲液的化学制品如下 ：
盐酸胍 .Sigma Aldrich.G4505
正磷酸氢二钠 .VWR.1038349
正磷酸二氢钠 .VWR.102454R 乙酸钠三水合物 .VWR.102354X. 氯化钠 .VWR.10241AP. 乙酸 .VWR.10001CU. 聚山梨醇酯 80.J.T.Baker.7394. 实施例 3 ： 28 天稳定性分析 方法 rmp 蛋白 A 层析如下文表 1 所列进行。 表1： 蛋白 A 层析参数基质 ： 床高 ： 柱直径 ： 柱体积 ： 线性流速 ： 平衡缓冲液及 CV ： 加载物质 ： 加载容量 (mg IgG/ml 基质 ) ： rmp 蛋白 A Sepharose 14.2cm 5.0cm 278ml 150cm/hr 磷酸盐缓冲盐水 pH7.2， 5 个 CV 澄清后的培养物收获物 16.6mg/ml 基质清洗缓冲液 1 及 CV ： 清洗缓冲液 2 及 CV ： 洗脱缓冲液 ： 剥离 (strip)/ 清洁缓冲液及 CV ：
磷酸盐缓冲盐水 pH7.2， 7.5 个 CV 50mM 乙酸钠 pH 5.50±0.10， 7.5 个 CV 50mM 乙酸钠 pH 3.75±0.10， 1.6 个 CV 50mM 乙酸钠 pH 3.0±0.10， 2 个 CV洗脱峰并将吸光度恢复至＜全额偏差 (full scale deflection)(AuFS) 的 2％需 要 1.6 个 CV 的洗脱缓冲液。此后， 将缓冲液换成剥离缓冲液 (strip buffer)。
然后如下文表 2 所列对蛋白 A 洗出液进行低 pH 病毒灭活。
表2： 低 pH 病毒灭活
起始材料 ： pH 降低 ： 用于降低 pH 的缓冲液 ： 添加速率 ： 低 pH 保持时间 ： 病毒灭活后的中和 ： 添加速率 ： 中和后的过滤 ：
蛋白 A 洗出液 至 pH3.70 100mM 乙酸 8.6ml/min(19.0ml/min/l 洗出液 ) 调整 pH 后 60 分钟 通过逐渐添加 100mM 氢氧化钠至 pH5.48 17.8ml/min(39.3ml/min/l 洗出液 - 为加样而调整 ) Millipak 20将 所 有 样 品 保 存 在 200ml Hyclone 生 物 加 工 容 器 (Hyclone BioProcesscontainer) 中， 该容器由聚乙烯制成， 附有 C-flex 输入和输出管道。
另外， 50ml 病毒灭活后的蛋白 A 洗出液的样品用初始缓冲液 (50mM 氢氧化钠 ) 中 和， 并在生物加工容器中于 2-8℃保存 28 天后用于分析。
所有样品根据需要或是存储在 100,000 级冷室 (2-8℃， 以图表记录器和报警器监 测 ) 中或是在设为 25℃的恒温调节箱中。
设置了 5 个时间点和 2 个存储温度 (2-8℃和 25℃ )， 即 10 个不同采样点。
将经中和且经过滤的蛋白 A 洗出液分成 10 批 ； 每个温度存储 5 批。另一个装有经 中和但未过滤的蛋白 A 洗出液存储在 2-8℃。
为了装入每个生物加工容器， 将中和后的蛋白 A 洗出液经 0.2μm Millipak 滤器 泵入 200ml 生物加工容器。每个生物加工容器装有大约 100ml 以模拟对最终 2,000 升规模 生产所设想的产品与表面接触之比例。
用一个生物加工容器采集每个温度和时间点的样品， 小心在存储期间不要让材料留在管道中。
在第 1、 3、 15、 21 和 28 天取出每个温度的一个生物加工容器。在采样前让每个生 物加工容器中的内容物达到室温。
将样品采集到 Bijoux 容器或 50ml Falcon 管中。丢弃前几毫升样品， 因为它们可 能在存储期间与管道有一些接触。
采样后， 将装有剩余材料的容器于 -70℃冷冻。
在每个时间点和每个存储温度的当天进行下述分析以测定这些样品彼此之间及 与参照标准品的可比性。在每个时间点将一管新鲜的 BAK502G9 标准品用于比较研究材料 的稳定性。 将参照物自 -70℃存储状态于室温融化。 已知在此抗体融化后不久， 多聚体水平 会升高， 因此最后进行 GP-HPLC 分析。
(A) 浊度分析
评估浊度， 作为蛋白质随时间而降解的度量， 因而充当本发明组合物稳定性的有 用评估方法。
通 过 收 集 样 品 在 A340 和 360nm 之 间 的 平 均 吸 光 度 来 测 量 浊 度 (Eckhardtct al.1993)。实施此测定法时不进行进一步的过滤。
自 rmp 蛋白 A 层析得到的数据总结于表 3， 层析图示于图 1。
表3： rmp 蛋白 A 层析数据
步骤详情 柱体积 总加载体积 总加载产物 洗出液体积 洗出液浓度 洗脱 pH 100mM 乙酸所加体积 100mM 氢氧化钠所加体积 加工过滤前的体积 加工过滤后的浓度 加工过滤后的总产物结果 278ml 3204ml 4620mg 453ml(1.6 个 CV) 8.42mg/ml 4.40 665ml(2.4 个 CV) 838ml(3.0 个 CV ； 调节后为 3.2 个 CV*) 1900ml*(6.8 个 CV) 2.28mg/ml 4327mg18102060925 A CN 102060930说明93.7％书17/29 页加工过滤后的回收百分比
* 从病毒灭活后的洗出液中取出 50ml， 用 50mM 氢氧化钠调节。最终体积是采样后的。 正如所预期的， 所进行的 rmp 蛋白 A 层析产生了与大规模中所看到的相当的缓冲 液体积。 中和后的洗出液显然比用 50mM 氢氧化钠中和的洗出液通常所看到的更加混浊。 在 过滤到生物加工容器中的过程中， 开始观察到沉淀， 这在中和的 1 小时内发生。此时才测定 浊度。回收率在预期的过滤后范围之内。
在第 1 天对所有洗出液样品测定浊度。在第 1、 3、 15、 21 和 28 天对存储在两个温 度的过滤后洗出液测定浊度。 另外， 在第 28 天在过滤前后对未过滤存储的洗出液 ( 用 50mM 氢氧化钠或 100mM 氢氧化钠调整 ) 测定浊度。浊度分析的结果示于表 4， 从中可以看出， 尽 管存储于 25℃的样品的第 28 天浊度有明显升高， 样品一般于 25℃稳定了至少 21 天。
表4： 加工和稳定性研究样品的浊度测量结果
(B) 蛋白质浓度分析 利用 280nm 吸光度和消光系数 来测量和计算 IgG 浓度。在中和时进行过滤的洗出液在为了计算蛋白质浓度而测量 280nm 吸光度前不进 行再次过滤。因为浊度都低， 所以认为这不会影响结果。280nm 吸光度在表 5 所示存储温度 和时间点之间是一致的。
表5： 洗出液样品的蛋白质浓度
(C)SDS-PAGE 分析
使用 4-12％ Bis-Tris NuPAGE 凝胶进行还原性和非还原性 SDS PAGE。使用 MES 运行缓冲液进行电泳， 并使用 Pierce 凝胶 code 蓝 (code blue) 进行染色。
SDS PAGE 分析证明了半个抗体 (half antibody) 的水平有变化， 但没有明显趋势， 而且这很有可能在测定法的变化范围之内 ( 见图 1 和图 2、 表 6 和表 7)。在第 21 天在 25℃ 样品中看到一些别的次要条带。在第 28 天没有看到这些条带。因此， 它们可能处于该测定 法的检测极限。这些条带可能对应于在 GP-HPLC 上看到的别的小峰 ( 见实施例 3D)。
在研究结束时没有运行样品， 因为不太可能区分原始样品之间存在的差异或是因 为较长存储的结果。在每块凝胶上运行一管新鲜融化的参照标准品。它在不同时间点之间 是相当的， 表明分析是如预期进行的。还要注意， 在第 21 天 25℃样品中看到的额外条带在 同一块凝胶上运行的参照标准品或 2-8℃样品中没有看到。 为了清楚起见， 图 2 中的所有条 带标有一圆圈。
表6： SDS PAGE 密度测定结果， 还原样品
表7： SDS PAGE 密度测定结果， 非还原样品
(D)GP-HPLC 分析
使用 TSK GS3000SW 大小排阻柱分析样品， 以 200mM 磷酸钠和 0.05％叠氮化钠 pH 7.0 作为流动相， 于 280nm 检测。
在第 1 天测定来自蛋白 A 层析的所有级分。然后在第 1、 3、 15、 21 和 28 天测定存 储于两个温度的洗出液。在所有时间点也运行参照物样品。在第 1 天分别用 100mM 氢氧化 钠或 50mM 氢氧化钠中和但直到第 28 天才过滤的洗出液在第 28 天通过 GP-HPLC 进行测定。
第 1 天的 GP-HPLC 分析的层析图示于图 3。正如预期的， 最终洗出液中大于 95％ 为单体， 这达到了 BAK502G9 的最终规格 (final specification)。
样品在整个研究过程中的 GP-HPLC 分析揭示了截短型 ( 具体是在 9.9 与 10.3 分 钟之间洗脱的小峰 )BAK502G9 在 25℃有略微增加 ( 表 8 及图 4 和图 5)。单体水平在整个 研究中一贯在 97.0 与 98.2％之间。
用 50mM 氢氧化钠中和的洗出液 (99.2％单体 ) 具有比用 100mM 氢氧化钠中和的 洗出液 (97.4％单体 ) 更高的单体水平， 二者都高于最终产品所要求的单体水平 95％ ( 表 9 和图 6)。
发现从自动积分得到的结果不准确， 因此人工再次积分 GP-HPLC 层析图。
表8： 于不同温度存储的洗出液的 GP-HPLC
表9： 用 100mM 或 50mM 氢氧化钠中和的洗出液的 GP-HPLC(E) ： IEF 分析
使用 Invitrogen pH 3-10IEF 凝胶测定样品， 使用 Invitrogen 缓冲液。
BAK502G9 的 IEF 分析在此研究的整个过程中显示出一致的表现 ( 图 7)。在大约 pI 7.1-6.4 之间看到 3 条主要的条带和 2 条次要的条带。
(F) ： 内毒素分析
对在第 28 天从两个存储温度采集的样品使用 LAL 测定法测定内毒素水平。
于两个温度存储的样品中的内毒素水平都低。 这证明了在研究过程中没有受到革 兰氏阴性细菌的污染。
于 2-8℃存储的洗出液＝ 0.87EU/mg
于 25℃存储的洗出液＜ 0.44EU/mg
28 天稳定性分析结果的总结
于 2-8℃或 25℃存储长达 15 天的 BAK502G9 在实施例 3 所进行的所有测定法中是 相当的。在第 21 天后， 通过 SDS PAGE( 实施例 3C) 和 GP HPLC( 实施例 3D) 分析观察到一 些轻微差异， 但产物直到第 28 天仍然是相当的。
实施例 4 ： 12 个月稳定性分析
以与实施例 3 关于 28 天稳定性分析所述类似的方式进行 12 个月稳定性分析。
该研究设计用于调查不同浓度 BAK502G9 于不同温度 ( 例如 -70℃、 +5℃、 +25℃、 +37℃和 +45℃ ) 存储后的稳定性。此分析中所使用的不同制剂列于下文表 10。
表 10 ： 12 个月稳定性分析中所使用的制剂的组成
在不同时间点对样品进行分析， 例如于 -70℃、 +5℃、 +25℃存储的制剂在第 0、 3、 6、 9 和 12 个月进行测量， 于 +37℃存储的制剂在第 0、 1、 2、 4 和 8 周进行测量， 而于 +45℃存 储的制剂在第 0、 1、 2 和 5 天进行测量。
(A)pH 分析
使用配有小体积 pH 电极 (BDH) 的 PHM220pH 计 (Radiometer Analytical) 测量 pH， CF、 TF1A、 TF1B 和 TF1C 制剂在每个温度的 pH 测量结果示于下文表 11-15。
表 11 ： 于 -70℃存储后的 pH
表 12 ： 于 +5℃存储后的 pH
表 13 ： 于 +25℃存储后的 pH
表 14 ： 于 +37℃存储后的 pH
表 15 ： 于 +45℃存储后的 pH
NT ＝未测试
(B) 浓度分析
将样品用有关缓冲液稀释至适宜水平， 并使用 HP8453UV/ 可见光分光光度计 (Agilent Technologies) 测定其在 280nm 的吸光度。 使用已知的消光系数 1.723 将吸光度 数值转换成 BAK502G9 浓度。CF、 TF1A、 TF1B 和 TF1C 制剂在每个温度的吸光度测量结果示 于下文表 16-20。
表 16 ： 于 -70℃存储后的 BAK502G9 浓度
表 17 ： 于 +5℃存储后的 BAK502G9 浓度
表 18 ： 于 +25℃存储后的 BAK502G9 浓度
表 19 ： 于 +37℃存储后的 BAK502G9 浓度
表 20 ： 于 +45℃存储后的 BAK502G9 浓度
n＝3
NT ＝未测试
(C) 凝胶过滤 HPLC 分析
在 HP1100 系统 (Agilent Technologies) 上进行凝胶过滤 HPLC。 将 TSK-Gel3000S 柱用 0.2M 磷酸钠 pH7.5 平衡。将样品用有关缓冲液稀释至 1mg/ml， 并以 13,000rpm 离心 10 分钟以除去任何颗粒物。将 3x 20μl 每种样品注射到柱上， 以 1ml/min 流速运行。使用 可见波长检测器监测 220 和 280nm 吸光度。
CF、 TF1A、 TF1B 和 TF1C 制剂在每个温度的凝胶过滤分析结果示于图 8-12。
(D) 还原性 SDS-PAGE 分析
将样品用有关缓冲液稀释至 1mg/ml， 并将 16.7μl 添加至 12.5μl 4X LDS 样品缓 冲液 (Invitrogen)、 15.8μl Milli-Q 水和 5μl 还原剂 (Invitrogen)。将样品于 95℃加 热 1 分钟， 然后置于冰上。将 15μl 每种样品加载到装有 1X MES SDS 运行缓冲液的槽中的 4-12％ BisTris 凝胶 (Invitrogen) 上， 并将凝胶以 500mA 恒流运行 35 分钟。电泳后， 将凝 胶除去保护套， 用 Milli-Q 水漂洗 3 次， 每次 10 分钟， 用 蓝染色试剂 (Pierce) 染
27a102060925 A CN 102060930说明书26/29 页色最少 1 小时， 然后用 Milli-Q 水脱色。将凝胶用 UVP GDS8000 凝胶记录系统照相和分析。 测定每份样品中 BAK502G9 重链和轻链的相对丰度。
CF、 TF1A、 TF1B 和 TF1C 制剂在每个温度的还原性 SDS-PAGE 分析结果示于图 13、 15、 17、 19 和 21。BAK502G9 重链和轻链在每个温度的丰度测量结果也示于图 14、 16、 18、 20 和 22。
(E) 非还原性 SDS-PAGE 分析
将样品用有关缓冲液稀释至 1mg/ml， 并将 16.7μl 添加至 25μl 2X 非还原性样 品缓冲液 (0.125M Tris pH6.8， 4％ (w/v)SDS， 30％ (v/v) 甘油， 0.004％ (w/v) 溴酚蓝 )、 3.3μl Milli-Q 水和 5μl1M 碘乙酰胺。 将样品于 95℃加热 1 分钟， 然后置于冰上。 将 15μl 每种样品加载到装有 1X MES SDS 运行缓冲液的槽中的 4-12％ BisTris 凝胶 (Invitrogen) 上， 并将凝胶以 500mA 恒流运行 35 分钟。电泳后， 将凝胶除去保护套， 用 Milli-Q 水漂洗 3 次， 每次 10 分钟， 用 蓝染色试剂 (Pierce) 染色最少 1 小时， 然后用 Milli-Q 水脱 色。将凝胶用 UVPGDS8000 凝胶记录系统照相和分析。测定每份样品中 BAK502G9 单体的相 对丰度。
CF、 TF1A、 TF1B 和 TF1C 制剂在每个温度的非还原性 SDS-PAGE 分析结果示于图 23、 25、 27、 29 和 31。完整 BAK502G9 单体在每个温度的分度测量结果也示于图 24、 26、 28、 30 和 32。
(F) 等电聚焦分析
在 加 载 样 品 前， 将 电 泳 床 冷 却， 并 将 pH3-10IEF 凝 胶 (Cambrex) 使 用 Apelex PS9009TX 电源组以 1W、 2000V、 150mA 预聚焦 10 分钟。将样品用有关缓冲液稀释至 1mg/ml。 将样品盖片 (sample mask) 置于凝胶表面上， 并加载 5μl 每种样品。将凝胶再次预聚焦， 并除去样品盖片。然后将凝胶以 25W、 1500V、 50mA 聚焦 60 分钟。电泳后， 将凝胶用 50 ％ (v/v) 甲醇、 6％ (w/v) 三氯乙酸、 3.6％ (w/v)5- 磺基水杨酸 (sulphosalicyclic acid) 固 定 30 分钟， 然后用水清洗， 并在烤箱中于 40-50℃干燥 1 小时。将凝胶用 PhastGel Blue R(Pharmacia ； 溶于 60％ (v/v) 甲醇的片剂 ) 染色 30 分钟， 用 Milli-Q 水清洗以除去过量 的染料， 然后用 9％ (v/v) 冰醋酸、 25％ (v/v) 乙醇溶液脱色大约 3 分钟。将凝胶在烤箱中 于 40-50℃干燥 1 小时。将干燥后的凝胶用 UVP GDS8000 凝胶记录系统照相并分析。测定 了每份样品中同种型 (isoform) 的数目和 pI 范围， 对 CF、 TF1A、 TF1B 和 TF1C 制剂在每个温 度观察到的结果示于下文表 21-25。
表 21 ： 通过 IEF 揭示的于 -70℃存储后的同种型的 pI 范围和数目
表 22 ： 通过 IEF 揭示的于 +5℃存储后的同种型的 pI 范围和数目
表 23 ： 通过 IEF 揭示的于 +25℃存储后的同种型的 pI 范围和数目
表 24 ： 通过 IEF 揭示的于 +37℃存储后的同种型的 pI 范围和数目
表 25 ： 通过 IEF 揭示的于 +45℃存储后的同种型的 pI 范围和数目NT ＝未测试
稳定性分析结果的总结
于 -70℃的稳定性
CF 和 TF1A 二者都于 -70℃稳定了 12 个月。 零点与第 12 个月的分析序型是相似的， 除了非还原性 SDS-PAGE 揭示的％完整 IgG， CF 从零点的 95.9％降至第 12 个月的 89.9％， 而 TF1A 从零点的 96.2％降至第 12 个月的 89.2％。根据 12 个月后的 HPLC， CF 和 TF1A 二 者样品的单体百分比都是 100％。 CF 和 TF1A 二者样品在 12 个月后的 IEF 上展现出 4 条带。 上述结果表明 CF 与 TF1A 在此温度是相当的。
于 5℃的稳定性
CF 和 TF1A 二者都于 5 ℃稳定了 12 个月。零点与第 12 个月的分析序型是相似 的， 除了通过非还原性 SDS-PAGE 揭示的％完整 IgG， CF 从零点的 95.9％降至第 12 个月的 89.5％， 而 TF1A 从零点的 96.2％降至第 12 个月的 88.9％。根据 12 个月后的 HPLC， CF 和 TF1A 二者样品的单体百分比都是 100％。CF 和 TF1A 二者样品在 12 个月后的 IEF 上展现出 4 条带。上述结果表明 CF 与 TF1A 在此温度是相当的。
于 25℃的稳定性
CF 和 TF1A 二者都于 25℃稳定了 12 个月。根据非还原性 SDS-PAGE 揭示的％完整 IgG， CF 从零点的 95.9％降至第 12 个月的 89.1％， 而 TF1A 从零点的 96.2％降至第 12 个月 的 87.5％。 根据非还原性 SDS-PAGE 凝胶， 两种制剂都还有在零点时没有检测到的高分子量 ( ＞ 220kDa) 次要条带。根据 12 个月后的 HPLC， CF 和 TF1A 二者样品的单体百分比分别是 98.9 和 96.42％。CF 和 TF1A 二者样品在 12 个月后的 IEF 上展现出 4 条带。上述结果表明
CF 与 TF1A 在此温度是相当的。
于 37℃的稳定性
CF 和 TF1A 二者都于 37℃稳定了 4 周， 但在 8 周后未能达到有些参数的草案规格 (draft specification)， 即通过还原性 SDS-PAGE 揭示的纯度 ( 两种制剂 ) 和通过 GF-HPLC 揭示的％单体 ( 仅 TF1A ； 边界结果 )。上述结果表明在此温度在 8 周期间 CF 比 TF1A 更稳 定。
于 45℃的稳定性
CF 和 TF1A 二者都于 45℃稳定了 5 天， 尽管此后的分析序型 (profile) 略有变化 (SDS-PAGE 和 IEF 凝胶上有一些别的次要条带 )。上述结果表明 CF 和 TF1A 在此温度在 5 天期间是相当的。