一种用于降低血清胆固醇的益生菌制剂及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种益生菌制剂， 具体地说， 涉及一种用于改善肠道微生态平衡， 降低 人或动物血清胆固醇的益生菌制剂及其制备方法。背景技术
已有的益生菌的研究也只限于对单个菌种的研究， 没有针对益生菌群相互促进、 共生， 协调促进改善降低人或动物血清胆固醇的研究， 也没有协调促进降低人或动物血清 胆固醇的益生菌群制剂、 饲料添加剂及工艺。
胆固醇是人体内重要的固醇类物质。但是， 围绕着胆固醇与人体健康的关系， 在 世界范围内食品学界和食品工业界一直存在很大的争议自上世纪 30 年代国外研究者得出 “血管壁增厚即动脉粥样硬化症是不正常胆固醇代谢的结果” 这一结论以来， 已有越来越 多的试验和研究表明胆固醇与高脂血症、 冠心病等心血管疾病间的关系， 对此， 有人描述为 “one to two” 规律， 即降低 1％的血清胆固醇可随之减少 2％患冠心病的危险性。尽管存在 着降血脂化学药物， 但其可使转氨酶增高等不良反应使人们致力于探索和研究新的安全有 效的调脂药物， 以嗜酸乳杆菌和双歧杆菌为代表的微生态制剂得到了广泛青睐。益生菌作 为 “有生命的绿色药品” ， 已被越来越多的研究证明具有优效、 安全、 符合生态的诸多优点， 被越来越多的应用于人类疾病的各个领域。
目前我国有近 1/3 的成年人的血脂偏高， 高脂血症现在已成为人类健康的第一隐 形杀手， 因此治疗高血脂是摆在医学界的首要课题。为了更好的了解益生菌是否具有体内 降解胆固醇的功能高脂动物模型在益生乳酸菌降胆固醇功能性实验研究中得到越来越广 泛的应用。高脂高胆固醇饲料可以诱发动物脂代谢紊乱， 血脂水平发生变化 ： 血清胆固醇 (TC) 和肝脏胆固醇含量升高， 降血清功能性实验通常做法是饲喂高脂高胆固醇饲料建造高 脂实验动物模型后饲喂实验动物实验样品， 通过测定动物血清脂类含量的变化来确定实验 样品对动物血脂的影响效果。
益生菌降胆固醇的研究现状， 近年来国内外的学者在益生菌降胆固醇方面做了大 量的研究。Akalin 等应用小鼠作为模型， 给小鼠饲喂含有嗜酸乳杆菌的酸奶和鲜奶， 并研 究了嗜酸乳杆菌对小鼠血清中 TC、 TG 和 LDL 的影响， 发现嗜酸乳杆菌可以降低小鼠血清中 这些脂蛋白的含量。肖琳琳从西藏传统发酵乳中分离筛选得到一株在液体培养基中降胆 固醇达到 51.8％的干酪乳杆菌 (Lactobacil lus casei)， 用这株干酪乳杆菌制备的菌悬 液灌胃高脂模型小鼠 14d 后， 发现实验组小鼠血清中胆固醇和甘油三指浓度较对照组显著 降低 (P ＜ 0.01)， 同时 HDL- 胆固醇浓度有所增加， 动脉硬化指数低于对照组的水平。据报 道， 某些微生物能在以胆固醇为唯一碳源的培养基上生长， 通过降解胆固醇来获得碳源和 能量， 并且有些微生物可以将胆固醇吸附在自身的细胞膜上， 进而同化胆固醇为细胞膜的 目前报道的主要有 ： 诺卡氏菌属 (Noccardia 组成成分。 能够降解胆固醇的微生物种类很多， eythropoli s ； N.rhodochrous)、 链霉菌属 (Streptomyces lividans ； S.hygroscopicus)、 红 球 菌 属 (Rhodococcuse、 equi ； R.erythropoli s) 短 杆 菌 属 (Brevibacterium)、棒状 杆 菌 属 (Corynebacrerium spp)、 节 杆 菌 属 (Arthrobacter s implex)、 假单胞菌属 尹 (Pseudomonas fluorescens) 等。 这 些 菌 株 都 可 产 生 较 高 活 性 的 胆 固 醇 氧 化 酶 或 胆盐水解酶。有的可产生较高活性的胞内酶， 如诺卡氏菌属 (Noccardiaeythropolis ； N.rhodochrous) ； 还有的可产生较高活性的胞外酶， 如链霉菌属 (s.lividans) 和短杆菌属 (B.sterolicum) 等。
益生菌的研究与应用， 在日本、 法国、 俄罗斯、 德国等国家较受到重视， 而且具有专 业化和系统性的研究。就目前的研究与应用水平而言， 日本处于较领先的地位。早在上一 世纪 30 年代初时， 日本的京都帝国大学微生物教研室的代田稔博士就已成功地分离出来 自于肠道的乳酸杆菌， 这种有益菌在经过强化培养后， 使之能活着到达肠内生存。 而这种后 来被人们称之为益力多菌的乳酸杆菌， 目前已被广泛地运用在日本的食品、 饮品、 医学等领 域。其中在乳制品上的运用成绩十分惊人， 据国外有关公司调查， 日本在 2000/2001 年由益 生菌所生产的乳制品， 其总产值就已达 22 亿美元。而今的益力多， 在日本已无人不晓， 利用 这种益生菌制作的乳制品成功地打入了国际奶品饮料市场， 目前已攻下了 25 个国家的城 池， 甚至在这些国家建造了 18 家加工厂， 使目前全球每天至少 2500 万人在饮用这种产品。 2005 年整个欧洲市场益生菌原料的市场规模估计约为 0.35 亿欧元， 到 2010 年能够达到 1.2 亿欧元。益生菌市场的产值估计为 25 亿欧元。目前市场上大约有 1000 多种不同的益 生菌产品。欧洲最主要的 4 类益生菌产品为 ： 1) 传统的发酵乳制品， 例如酸奶。2) 益生菌 饮料产品。3) 浓缩的冻干的以胶囊、 片剂或粉剂销售的益生菌产品。4) 新型的益生菌产品 形式， 是益生菌在培养基或肠道内代谢的产物。 其中， 法国含有双歧杆菌和嗜酸乳杆菌产品 已经增长了 300％， 占总乳销售量的 4％。
国外益生菌开发日益深入， 在发酵乳中添加益生菌， 可以大大提高发酵乳的营养 功效。除了改善对乳成分的消化吸收外， 还能促进肠道对矿物质的吸收和利用。这一研究 成果激发了益生菌食品热。
益生菌在我国的研究与利用， 起步较迟。基础研究和开发利用， 与发达国相比， 尚 差一定的距离。随着人们生活水平的提高以及对自身保健功能的需求， 益生菌的应用逐渐 受到了重视， 它已被人们科学地运用到食品工业生产中， 特别是在乳制品和一些功能性的 食品中已广为运用。目前我国已大量使用双歧杆菌和乳杆菌这些有益菌生产营养、 可口兼 有保健功能的酸牛奶。
据卫生部网站消息， 卫生部办公厅 2010 年 4 月近日印发 《可用于食品的菌种名单》 的通知， 根据 《食品安全法》 及其实施条例的有关规定， 卫生部组织制定了 《可用于食品的菌 种名单》 。 发明内容 ：
本发明要解决的问题是针对以上不足， 提供一种能够降低人体或动物血清胆固醇 的益生菌制剂及其制备方法。
为解决以上问题， 本发明的技术方案如下 ： 一种用于降低血清胆固醇的益生菌制 剂， 其特征在于 ： 所述益生菌制剂包括以下体积配比的成分 ：
屎肠球菌 10-30 份、 鼠李糖乳杆菌 10-30 份和嗜酸乳杆菌 10-30 份。
作为上述技术方案的进一步改进 ：所述益生菌制剂包括以下体积配比的成分 ：
屎肠球菌 20 份、 鼠李糖乳杆菌 20 份和嗜酸乳杆菌 20 份。
所述制备方法包括以下步骤 ：
(1) 屎肠球菌发酵液的制备 ： 将屎肠球菌菌株种子液接入已经灭菌后的培养 基中， 培养基含有重量比为 1 ％ -3 ％的葡萄糖、 0.5-1.5 ％的蛋白胨、 0.5-1 ％的酵母浸 膏、 0.1-0.5 ％的 Na2HPO4 和 0.1-0.5 ％ KH2PO4， 余量为作为溶剂的水， 接种量为 0.3 ％， 在 32℃ -38℃下厌氧发酵后， 得到屎肠球菌发酵液 ；
(2) 鼠李糖乳杆菌发酵液的制备 ： 鼠李糖乳杆菌菌株种子液接入已经灭菌后的培 养基中， 培养基含有重量比为 1 ％ -3 ％的葡萄糖、 0.5-1.5 ％的蛋白胨、 0.5-1 ％的酵母浸 膏， 余量为作为溶剂的水， 接种量为 0.3％， 在 32℃ -36℃下厌氧发酵后， 得到鼠李糖乳杆菌 发酵液 ；
(3) 嗜酸乳杆菌发酵液的制备 ： 嗜酸乳杆菌菌株种子液接入已经灭菌后的养基 中， 培养基含有重量比为 1％ -3％的葡萄糖、 0.5-1.5％的蛋白胨、 0.5-1％的酵母浸膏， 余 量为作为溶剂的水， 接种量为 0.3％， 在 32℃ -36℃下厌氧发酵后， 得到嗜酸乳杆菌发酵液 ；
(4) 将屎肠球菌发酵液、 鼠李糖乳杆菌发酵液和嗜酸乳杆菌发酵液按照以上比例 混合， 得到降低血清胆固醇的益生菌制剂。
本发明采用以上技术方案， 具有以下优点 ： 乳酸菌降胆固醇机制有多种方式， 对 3- 羟基 -3- 甲基戊二酰 COA 还酶的抑制作用， 该酶是胆固醇体内生物合成的限速酶 ； 通过 胆盐水解酶的作用， 将部小肠内的胆盐水解， 水解后的胆盐能与食物中的胆固醇发生共沉 淀作用， 从而促进食源中的胆固醇向粪便中转移 ； 3. 菌体对胆固醇的同化作用， 直接分解 胆固醇。屎肠球菌、 双歧杆菌、 嗜酸乳杆菌三种菌分别在人或动物的不同肠段上定植， 其降 胆固醇的作用机制也不同， 将三种菌组合起来可以发挥他们在各自肠段以不同机制共同发 挥作用， 优势互补。
下面结合实施例对本发明进行详细说明。 具体实施方式
实施例， 一种用于降低血清胆固醇的益生菌制剂， 包括以下体积配比的成分 ： 屎肠 球菌 20 份、 鼠李糖乳杆菌 20 份和嗜酸乳杆菌 20 份。
益生菌制剂的制备方法， 其特征在于 ： 所述制备方法包括以下步骤 ：
(1) 屎肠球菌发酵液的制备 ： 将屎肠球菌菌株种子液接入已经灭菌后的培养 基中， 培养基含有重量比为 1 ％ -3 ％的葡萄糖、 0.5-1.5 ％的蛋白胨、 0.5-1 ％的酵母浸 膏、 0.1-0.5 ％的 Na2HPO4 和 0.1-0.5 ％ KH2PO4， 余量为作为溶剂的水， 接种量为 0.3 ％， 在 32℃ -38℃下厌氧发酵后， 得到屎肠球菌发酵液 ；
(2) 鼠李糖乳杆菌发酵液的制备 ： 鼠李糖乳杆菌菌株种子液接入已经灭菌后的培 养基中， 培养基含有重量比为 1 ％ -3 ％的葡萄糖、 0.5-1.5 ％的蛋白胨、 0.5-1 ％的酵母浸 膏， 余量为作为溶剂的水， 接种量为 0.3％， 在 32℃ -36℃下厌氧发酵后， 得到鼠李糖乳杆菌 发酵液 ；
(3) 嗜酸乳杆菌发酵液的制备 ： 嗜酸乳杆菌菌株种子液接入已经灭菌后的养基 中， 培养基含有重量比为 1％ -3％的葡萄糖、 0.5-1.5％的蛋白胨、 0.5-1％的酵母浸膏， 余量为作为溶剂的水， 接种量为 0.3％， 在 32℃ -36℃下厌氧发酵后， 得到嗜酸乳杆菌发酵液 ；
(4) 将屎肠球菌发酵液、 鼠李糖乳杆菌发酵液和嗜酸乳杆菌发酵液按照以上比例 混合， 得到降低血清胆固醇的益生菌制剂。
在对屎肠球菌降胆固醇作用研究中， 从 142 份健康儿童粪便中分离出一株具有在 体外降解胆固醇作用的菌株， 经中科院微生物研究所鉴定为屎肠球菌。通过药效学研究证 明与饲以高脂饲料的对照组大鼠相比， 在实验的第 14、 28 天分别测定大鼠血清 TC 浓度低与 对照组， 并有显著性差异 (p ＜ 0.05)。通过计算显示高中剂量组 HDL/TC 比值高与对照组、 动脉硬化指数低与对照组并有显著性差异 (p ＜ 0.05)。( 见表 1、 表 2、 表 3、 表 4)。根据 《保健食品功能学评价程序和检验方法》 的判定标准， 可以认为屎肠球菌具有调节大鼠血脂 的作用。通过人体实验证明本菌具有同样的作用 ( 见表 5)。药理学研究证明本菌无毒、 无 害、 安全。是人体内一种具有调节胆固醇代谢作用的正常生理性细菌。生产工艺研究表明， 屎肠球菌 DM891129 菌株经筛选、 驯化后， 采用发酵、 浓缩、 冷冻干燥等工艺可制成稳定的微 生态调节剂。
表1： 实验前后各组大鼠体重变化 (g， M±SD， n ＝ 10)
组别 对照组 低剂量组 中剂量组初始体重 (g) 160.6±7.4 163.4±7.1 158.2±6.414 天 (g) 304.1±23.6 300.9±19.9 297.4±13.628 天 (g) 366.0±37.3 354.9±24.8 359.7±16.9高剂量组
162.4±9.8304.8±28.1357.0±33.3三个实验组给于受试物屎肠球菌菌粉， 剂量分别为 ： 低剂量组 225mg/kg.BW， 中剂 量组 450mg/kg.BW， 高剂量组 900mg/kg.BW， 分别相当于人体推荐量摄入量的 5、 10、 20 倍。
表2： 实验前后各组大鼠血清 TC 浓度 (mg/dl、 M±SD， n ＝ 10)
组别 对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组
初始 TC(mg/kg) 80.8±4.5 80.4±5.4 81.6±3.9 83.8±5.314 天 95.2±17.8 65.1±3.6* 67.9±5.8* 66.0±6.4*28 天 108.0±47.2 69.0±5.8* 70.0±6.3* 65.1±5.7*表3： 各组大鼠血清 HDL-C/TC 比值 (％， M±SD)6102028713 A CN 102028715说组别 对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 动物数 10 10 10 10明书14 天 0.43±0.06 0.64±0.05* 0.67±0.12* 0.68±0.09* 28 天 0.34±0.11 0.48±0.09* 0.43±0.05* 0.49±0.11*5/8 页
* 与对照组相比 P ＜ 0.05 表4： 各组大鼠动脉硬化指数 (AI(M±SD) 组别 动物数 14 天 28 天对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组
10 10 10 101.37±0.41 0.55±0.14* 0.52±0.23* 0.52±0.22*2.39±1.54 1.19±0.43* 1.32±0.27* 1.15±0.47* 计算而动脉硬化指数 (AI) 是反应心血管疾病易患程度的一个指标， 由来， 该指数越高， 心血管疾病的易患程度越高， 从表 6 可以看出高、 中、 低剂量组， 在第 14 天 及 28 天时均低于对照组 (P ＜ 0.05)。
表5： 人体试验血清胆固醇、 甘油三酯水平 (mmol/L)
时间 对照组 TC 试验组 TC 对照组 TG 试验组 TG
开始 4.2±0.91(5) 6.65±0.54(11) 2.17±1.85(5) 1.61±0.19(11)第4周 4.12±0.81(5) 5.56±0.72(10) 1.41±0.49(5) 1.50±0.33(10)第8周 5.4±0.82(5) 5.61±0.84(11) 2.09±1.52(5) 1.52±0.21(11)第 12 周 4.5±1.32(5) 5.0±0.62(11) 2.02±2.11(5) 1.44±0.21(11)1、 正常对照组及第 1 组服药 4 周， 停药 4 周， 再继续服药 4 周， 共观察 12 周， 每阶 段服药前后各查一次各项指标 ；2、 TC 第 8w 时血 TC 水平略有上升， 此为第一阶段结束， 第二阶段服药前的结果， 但 其数值仍在正常范围之内， 第二阶段服药后又略下降， 与服药前水平相近。 可见此制剂对正 常血 TC 水平及 T G 水平无明显影响， 各阶段相应指标比较无显著意义 (P ＞ 0.05)。
嗜酸乳杆菌是具有同化胆固醇能力的乳酸菌， 体外试验试验表明 ： 嗜酸乳杆菌对 低胆固醇或正常水平胆固醇的同化降解能力不显著， 而对高水平胆固醇的同化降解作用比 较明显。结果见表 6。
表6： 嗜酸乳杆菌对不同浓度胆固醇的同化能力
培养基中胆固醇水平 高浓度 (mmol/L) 中浓度 (mmol/L) 低浓度 (mmol/L)
0 小时 8.2±0.3 5.2±0.4 2.1±0.512 小时 4.3±0.4 4.1±0.7 2.0±0.418 小时 3.7±0.3 3.6±0.4 1.9±0.424 小时 3.4±0.5. 3.4±0.5 2.0±0.4将三浓度胆固醇加入 MRS 培养基中， 接入 10％嗜酸乳杆菌种子液， 在不同时间测 定培养基中胆固醇含量， 以确定胆固醇被同化的数量。
鼠李糖乳杆菌是一株具有降胆固醇功能乳酸菌， 通过给高脂模型小鼠灌胃高低剂 量本乳杆菌活菌制剂在降低血清胆固醇方面， 灌胃组小鼠具有明显的降低血清胆固醇的作 用， 在经过 28 天的灌胃后， 小鼠血清胆固醇基本恢复到与正常小鼠相似的水平。在肝脏胆 固醇方面， 经灌胃 28 天后小鼠肝脏胆固醇有了明显的下降， 虽略高于对照组小鼠， 但明显 低于高脂组 (P ＜ 0.05)。这表明该乳杆菌可以减少胆固醇在肝脏中的积存。对于上诉各实 验指标用高剂量菌体灌胃要比低剂量菌体灌胃作用明显， 说明在一定范围内， 体内该菌的 活菌数越多起到的降胆固醇作用越明显。 综合上诉实验说明该菌株可能具有降低血清胆固 醇， 抑制肝脏胆固醇堆积的功能， 为将来利用该菌株制作出降胆固醇功能的食品或药品提 供了实验基础， 实验结果见表 7、 表8
表7： 灌胃菌体对小鼠血清胆固醇的影响
★★★ 代表 P ≤ 0.05 ； 代表 P ≤ 0.01 表8： 灌胃菌体对小鼠肝脏胆固醇的影响8102028713 A CN 102028715
说明书肝脏中胆固醇的降解率％ 68.82 61.367/8 页组别 对照 高脂对照 高剂量 低剂量
★每克肝脏胆固醇含量 (mg) 11.9020±2.0489 45.4884±17.9233 14.1851±2.6616 ★★ 17.5785±3.6438 ★★★ 代表 P ≤ 0.05 ； 代表 P ≤ 0.01
鼠李糖乳杆菌、 屎场球菌和嗜酸乳杆菌都是人体正常菌群， 在维护人体生态平衡、 抑制腐败型细菌及各种肠内有毒物质发挥重要作用。 将三种菌联合应用于降血清胆固醇可 发挥其三菌不同降胆固醇机制， 全方位调节人体血清胆固醇水平。
试验 1， 将实施例制备的益生菌发酵液用于肉鸡进行试验， 将 40 只试验用肉鸡随 机分为两组， 每组 20 只， 对照组肉鸡喂食普通饲料， 试验组肉鸡喂食含有实施例 1 制备的益 腿肌重 生菌发酵液 1％的饲料， 喂食 50 天后， 进行血样的采集及测定肉鸡血清、 胸肌组织、 的降胆固醇含量， 益生菌对肉鸡血清和其他组织胆固醇含量的影响及其降低率 (％ ) 如下 表：
组别 对照组 试验组 降低率 (％ ) 血清总胆固醇 0.179±0.042 0.085±0.027 ＊ 52.5 胸肌组织 0.624±0.085 0.310±0.102 ＊ 50.3 腿肌组织 0.891±0.204 0.532±0.121 ＊ 41.3 肝脏组织 1.52±0.102 1.4200±0.055 6
经 t 检验， 对照组与试验组 OD560 差异显著， ＊表示 p ＜ 0.05。
通过体外试验表明， 本益生菌其对肉鸡血清、 胸肌组织、 腿肌组织胆固醇含量也具 有明显的降低作用。
试验 2， 将实施例制备的益生菌发酵液用于杜洛克仔猪进行试验， 将 12 只试验用 杜洛克仔猪随机分为两组， 每组 6 只， 对照组仔猪喂食普通饲料， 试验组仔猪喂食含有实施 例 1 制备的益生菌发酵液 1％的饲料， 喂食 90 天后， 进行血样的采集并屠宰测定腰大肌中和 血清中胆固醇含量， 益生菌对仔猪血清和腰肌组织胆固醇含量 (mg/100g) 的影响如下表 ：
组别 对照组血清总胆固醇 158.5±6.25腰肌组织 98.5±5.829102028713 A CN 102028715说试验组 降低率 (％ )明书72.3±6.32 ＊ 26.68/8 页125.2±8.52 ＊ 21.1通过体外试验表明， 本益生菌其对仔猪血清、 腰肌组织胆固醇含量也具有明显的 降低作用。
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