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1、10申请公布号CN102021130A43申请公布日20110420CN102021130ACN102021130A21申请号201010513344422申请日20101021CGMCCNO199520070416C12N1/20200601C12P17/06200601A23K1/16200601C12R1/14520060171申请人南京农业大学地址210095江苏省南京市玄武区卫岗1号72发明人姚文张逊郑卫江黄莎娜孙小燕74专利代理机构南京天华专利代理有限责任公司32218代理人徐冬涛54发明名称一株降解大豆苷原产生雌马酚的双酶梭菌及其菌剂和应用57摘要本发明属于微生物技术领域，公开了。
2、一株降解大豆苷原产生雌马酚的双酶梭菌及其菌剂和应用。降解大豆苷原产生雌马酚的双酶梭菌CLOSTRIDIUMBIFERMENTANSZX7，2007年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO1995。该双酶梭菌CGMCCNO1995可降解大豆苷原产雌马酚，较大程度的降低大鼠血清低密度脂蛋白含量，显著提高高密度脂蛋白与低密度脂蛋白的比值，有利于大鼠体内胆固醇的清除，有利于宿主健康，可在制备动物的饲料中应用，也可在制备清除胆固醇的制剂中应用，还可在制备大豆或豆粕的发酵产品中应用。83生物保藏信息51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利。
3、要求书1页说明书6页附图7页CN102021144A1/1页21一株降解大豆苷原产生雌马酚的双酶梭菌CLOSTRIDIUMBIFERMENTANSZX7,2007年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO1995。2一种双酶梭菌益生菌剂，其特征在于通过如下方法制备（1）将双酶梭菌CGMCCNO1995斜面菌种接种于液体发酵培养基中，振荡试管培养至对数期；（2）将上述培养好的菌种按10的接种量接种入100ML液体发酵培养基，37培养至对数生长期，全流程培养时间为2448小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ML以上；（3）发酵瓶中的菌液离心，所得菌泥即为本。
4、发明双酶梭菌益生菌剂。3根据权利要求2所述的双酶梭菌益生菌剂，其特征在于所述的液体发酵培养基配方为胰蛋白胨20G/L；牛肉浸膏10G/L；酵母膏6G/L；葡萄糖4G/L；K2HPO42G/L；KH2PO41G/L；MGSO404G/L；CACL202G/L；FESO401G/L；盐酸半胱氨酸05G/L；通入CO220MIN除氧后调PH值至7274，分装后高压灭菌。4根据权利要求2所述的双酶梭菌益生菌剂，其特征在于所述的离心条件是3000G，4下离心10分钟。5权利要求1所述的双酶梭菌CGMCCNO1995在制备动物饲料中的应用。6权利要求1所述的双酶梭菌CGMCCNO1995在制备清除胆固醇的。
5、制剂中的应用。7权利要求1所述的双酶梭菌CGMCCNO1995在制备大豆或豆粕发酵剂中的应用。权利要求书CN102021130ACN102021144A1/6页3一株降解大豆苷原产生雌马酚的双酶梭菌及其菌剂和应用技术领域0001本发明属于微生物技术领域，涉及一株降解大豆苷原产生雌马酚的双酶梭菌及其菌剂和应用。背景技术0002大豆苷原DAIDZEIN属于大豆异黄酮（ISOFLAVONES）的一种。大豆异黄酮包括大豆苷原DAIDZEIN、染料木素GENISTEIN、黄豆黄素GLYCITEIN等十二种成分。大豆籽粒中约5060的大豆异黄酮为染料木素，3035为大豆苷原,515为黄豆黄素。从20世纪8。
6、0年代起，很多研究报道以及动物实验表明，大豆异黄酮具有弱雌激素活性、抗氧化活性、抗溶血活性和抗真菌活性，能有效地预防和控制白血病、骨质疏松、胃癌、乳腺癌、前列腺癌等多种疾病的发生，尤其是对乳腺癌、前列腺癌有积极的预防和治疗作用。在动物生产上，可以促进动物生长，提高繁殖能力，增强机体免疫，改善动物产品品质，提高生产性能。0003家畜、家禽最常用的日粮类型是玉米豆粕型日粮，以日采食量600G左右的生长猪为例，一天摄入大豆异黄酮的量约1G左右，但是摄入动物体内的大豆异黄酮，不能被动物自身分泌的消化酶直接降解，尤其是生物活性更高的大豆苷原的代谢终产物雌马酚只能由肠道细菌特异性产生。对雌马酚的生物特性研。
7、究表明，大豆苷原的生物活性效用取决于个体的雌马酚产生能力。而不同人体内大豆异黄酮降解菌的组成有很大差异，仅有1/3至1/2的被调查个体具有将大豆异黄酮降解为雌马酚的细菌存在。猪肠道雌马酚产生菌的分布同样存在个体差异，我们的一项研究中检测了12头猪肠道细菌的产雌马酚能力，结果表明2/3猪的肠道细菌能降解大豆苷原产雌马酚。0004目前人用的大豆苷原制品都为豆科植物来源的纯提取物，不仅得率低、价格昂贵，而且正是由于不同人群体内大豆苷原降解菌组成的差异导致了临床应用效果的个体差异，限制了大豆苷原制品的应用。0005因此，分离并开发应用大豆苷原降解菌，既可直接用于改善肠道微生物区系结构，使不具雌马酚产生。
8、能力的人或动物，通过口服菌剂获得雌马酚产生能力，从而提高从日粮中摄入的大豆苷原的功效；也可通过微生物发酵工程方法，提高大豆及其发酵产品的生物活性。总之，无论以何种方式应用，动物肠道大豆苷原降解菌的筛选和开发应用对提高饲料大豆利用效率及其经济附加值，改善宿主动物健康、提高其生产性能等均有着显著的意义。发明内容0006本发明的目的在于针对上述生产实践中的实际问题和需求，提供一株降解大豆苷原产生雌马酚的菌株。0007本发明的另一目的是提供一种双酶梭菌益生菌剂。0008本发明的又一目的是提供该双酶梭菌的应用。说明书CN102021130ACN102021144A2/6页40009本发明的目的可通过如下。
9、技术方案实现一株降解大豆苷原（DAIDZEIN）产生雌马酚（EQUOL）的双酶梭菌CLOSTRIDIUMBIFERMENTANS，2007年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO1995。0010本发明提供的降解大豆苷原（DAIDZEIN）产生雌马酚（EQUOL）的双酶梭菌CLOSTRIDIUMBIFERMENTANSCGMCCNO1995主要生物学特性为革兰氏阳性（G），严格厌氧生长，菌体直或微弯，产芽孢，芽孢卵圆，偏心到次端生，无芽孢外壁和附属丝，端圆，单个或成对，能形成短链，偶见长链；能利用葡萄糖、麦芽糖和半乳糖氧化产酸；能耐低PH值（PH25）。
10、及高胆盐浓度（13MG/L）；能以大豆苷原为唯一碳源进行生长，将其转化为雌马酚。0011一种双酶梭菌益生菌剂，通过如下方法制备1将双酶梭菌CGMCCNO1995斜面菌种接种于液体发酵培养基中，振荡试管培养至对数期；2将上述培养好的菌种按10的接种量接种入100ML液体发酵培养基（发酵瓶容量约140ML），37培养至对数生长期，全流程培养时间为2448小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ML以上；3发酵瓶中的菌液离心，所得菌泥即为本发明双酶梭菌益生菌剂。0012其中，所述的液体发酵培养基配方为胰蛋白胨20G/L；牛肉浸膏10G/L；酵母膏6G/L；葡萄糖4G/L；K2HPO42G/L；KH2P。
11、O41G/L；MGSO404G/L；CACL202G/L；FESO401G/L；盐酸半胱氨酸05G/L；通入CO220MIN除氧后调PH值至7274，分装后高压灭菌（121，15MIN）。0013所述的双酶梭菌斜面培养基为BHI琼脂固体培养基配方为营养成分（脑/心浸出物或蛋白胨）275G/L，D葡萄糖20G/L，NACL50G/L，NA2HPO425G/L，琼脂150G/L。0014所述的离心条件是3000G，4下离心10分钟。0015所述的双酶梭菌CGMCCNO1995在制备动物饲料中的应用。0016所述的双酶梭菌CGMCCNO1995在制备清除胆固醇的制剂中的应用。0017所述的双酶梭菌C。
12、GMCCNO1995在制备大豆或豆粕发酵剂中的应用。0018本发明的有益效果本发明双酶梭菌CGMCCNO1995，可降解大豆苷原产雌马酚，较大程度的降低大鼠血清低密度脂蛋白含量，显著提高高密度脂蛋白与低密度脂蛋白的比值，有利于大鼠体内胆固醇的清除，有利于宿主健康。0019本发明双酶梭菌CGMCCNO1995益生菌剂即可直接被动物口服，通过调整动物肠道微生态的方法来加强动物对大豆中活性物质大豆苷原的利用，保障动物健康，改善胴体脂肪品质，适用于现代农业生产中绿色无公害畜产品的生产。0020该菌剂生产和使用成本较低，菌剂的使用可克服雌马酚价格昂贵且不稳定、不宜长久保存的缺点。该菌剂既可用于直接口服、。
13、绿色安全，也可用于大豆或豆粕发酵。0021本发明双酶梭菌CGMCCNO1995也可用于豆粕发酵，利用微生物的方法降解豆粕中的大豆苷原（DAIDZEIN）生成生物活性更高的代谢产物雌马酚（EQUOL），充分说明书CN102021130ACN102021144A3/6页5发挥豆粕中天然大豆异黄酮的保健和促生长功能，从而提升大豆及大豆制品的经济附加值。0022菌种保藏信息双酶梭菌（CLOSTRIDIUMBIFERMENTANS）ZX7，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNO1995，保藏日期为2007年4。
14、月16日。附图说明0023图1双酶梭菌CGMCCNO1995菌落照片。0024图2双酶梭菌CGMCCNO1995革兰氏染色1000倍放大光镜照片。0025图3分子指纹技术显示大豆苷原对猪肠道细菌的选择性。0026图4无菌组肠道细菌对大豆苷原代谢的HPLC图谱。0027图5加菌组肠道细菌对大豆苷原代谢的HPLC图谱。0028图6双酶梭菌CGMCCNO1995生长曲线。0029图7双酶梭菌CGMCCNO1995PH变化曲线。0030图8双酶梭菌CGMCCNO1995大豆苷原生物转化曲线。0031图9双酶梭菌CGMCCNO1995酸耐受结果。0032图10双酶梭菌CGMCCNO1995胆盐耐受结果。。
15、0033图11双酶梭菌CGMCCNO1995发酵豆粕中葡萄糖苷酶酶活变化及大豆苷原浓度、雌马酚浓度。图12SD大鼠体重结果。0034图13SD大鼠血液中总胆固醇的浓度。0035图14SD大鼠血液中高密度脂蛋白胆固醇的浓度。0036图15SD大鼠血液中低密度脂蛋白胆固醇的浓度。0037图16SD大鼠血液中（高密度脂蛋白胆固醇/低密度脂蛋白胆固醇）比值。具体实施方式0038实施例1菌株的分离和鉴定取健康成年猪新鲜粪样置于无菌、厌氧的BHI大豆苷原肉汤，旋涡混合仪将其混匀，于厌氧工作站中进行梯度稀释后，涂布于BHI大豆苷原琼脂平板上，于厌氧工作站中37培养至菌落形成。挑取形态差异明显的单菌落纯化后分。
16、别接种于BHI大豆苷原肉汤中，37培养后使用HPLC对培养液中大豆苷原和雌马酚含量进行检测（图4和图5）。筛选出能够降解大豆苷原产生雌马酚的菌株双酶梭菌ZX7（CGMCCNO1995），其菌落照片和革兰氏染色照片见图1、图2，鉴定为CLOSTRIDIUMBIFERMENTANS，主要生物学特性为G，严格厌氧生长，菌体直或微弯，产芽孢，芽孢卵圆，偏心到次端生，无芽孢外壁和附属丝，端圆，单个或成对，能形成短链，偶见长链；从葡萄糖、麦芽糖和半乳糖能氧化产酸。该菌能以大豆苷原为唯一碳源进行生长，将其转化为雌马酚。在实验室条件下，大豆苷原经该菌剂转化后生成的雌马酚浓度可达到20G/ML以上（图8）。转化。
17、实验方法如下将大豆苷原添加入BHI肉汤培养基，使培养基中大豆苷原浓度为200MOL/L，1接种ZX7，37厌氧培养，分别于0H、6H、12H、24H、36H、48H、说明书CN102021130ACN102021144A4/6页660H、72H取样用于HPLC测定大豆苷原和雌马酚浓度。0039实施例2菌株生长特性实验21生长特征测定将双酶梭菌ZX7（CGMCCNO1995）接种入液体发酵培养基，于37厌氧培养，通过722分光光度计测定细菌培养液在660NM处吸光值绘制出生长曲线（图6），使用PH计测定培养液中PH值绘制出PH值变化曲线（图7）。0040液体发酵培养基配方为胰蛋白胨20G/L；牛。
18、肉浸膏10G/L；酵母膏6G/L；葡萄糖4G/L；K2HPO42G/L；KH2PO41G/L；MGSO404G/L；CACL202G/L；FESO401G/L；盐酸半胱氨酸05G/L。004122碳源利用实验使用碳源利用培养基（培养基配方（G/L）（NH4）SO420；MGSO47H2O02；NAH2PO4；CACL2H2O01；K2HPO405；蒸馏水1000ML；碳源10。向培养基中通入CO220MIN除氧后调PH值至7274，115，15MIN高压灭菌）检测细菌对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、纤维二糖、阿拉伯糖、核糖、松三糖、果寡糖、异麦芽低聚糖、半乳低聚糖、菊糖、木。
19、糖、淀粉、果胶、大豆苷原的利用情况。以接种后24小时的PH值和OD660变化为判别依据，发现双酶梭菌ZX7（CGMCCNO1995）能够在葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、半乳糖、异麦芽低聚糖、半乳低聚糖及大豆苷原作为唯一碳源的培养基中充分生长。0042实施例3菌株的耐酸和耐胆盐特性实验31PH值对双酶梭菌ZX7存活的影响将进入对数生长后期的ZX7（CGMCCNO1995）菌接种入已经用1MOL/LHCL调PH值分别为15、25、35和72的三组培养液（对照组即液体发酵培养基、10MG/L大豆黄酮组即液体发酵培养基中加入10MG/L大豆黄酮、50MG/L大豆黄酮组即液体发酵培养基加入50MG/L大豆。
20、黄酮）中，于37厌氧培养，在0和3H时间点取细菌培养液涂板（BHI琼脂固体培养基）计数（图9）。结果表明，在PH72时，处理3小时后，其活菌数显著上升，菌株呈正常生长态势；在PH35时，处理3小时后，活菌数基本无变化；在PH值为25和15时，处理3小时后，双酶梭菌ZX7（CGMCCNO1995）的存活率分别为531和398，说明对双酶梭菌ZX7（CGMCCNO1995）的存活有不同程度的抑制，因此双酶梭菌ZX7（CGMCCNO1995）可耐受PH25以上的条件。而不同浓度的大豆黄酮对双酶梭菌ZX7（CGMCCNO1995）的耐酸特性没有影响。004332胆盐对双酶梭菌ZX7存活的影响将进入对数。
21、生长后期的双酶梭菌ZX7（CGMCCNO1995）菌接种入不同底物浓度（0、10MG/L大豆黄酮组、50MG/L大豆黄酮组）和不同胆盐浓度（0、1MG/L和3MG/L）的液体发酵培养基中，分别在0和30MIN时涂板（BHI琼脂固体培养基）计数（图10）。结果表明，该菌在1MG/L和3MG/L的胆盐浓度下存活率分别为60和40，具有一定的耐受性；10MG/L大豆黄酮在3MG/L胆盐浓度下一定程度上提高了细菌的存活率（但差异不显著）。0044实施例4应用双酶梭菌ZX7（CGMCCNO1995）发酵豆粕试验将双酶梭菌ZX7（CGMCCNO1995）以5接种于市场购得的普通豆粕，37恒温说明书CN10。
22、2021130ACN102021144A5/6页7厌氧发酵，分别于0H，6H，12H，24H，36H，48H，60H，72H取样测定发酵豆粕中葡萄糖苷酶酶活变化及HPLC测定大豆苷原浓度、雌马酚浓度（图11）。同时HPLC测定市售品牌（普罗宝）发酵豆粕发酵前后豆粕中大豆异黄酮和雌马酚的含量（表1）。结果表明，双酶梭菌ZX7（CGMCCNO1995）相对于商品发酵豆粕所用菌株，其产雌马酚能力显著高于后者，双酶梭菌ZX7（CGMCCNO1995）发酵豆粕发酵前后雌马酚含量分别是1676UG/G和3389UG/G，提高了102，而普罗宝发酵豆粕发酵前后雌马酚含量分别是1376和1631UG/G，提高。
23、了仅1853。说明双酶梭菌ZX7（CGMCCNO1995）有很好的应用于豆粕发酵工业的前景。0045表1市售普罗宝发酵大豆粕发酵前后12种大豆异黄酮和雌马酚含量实施例5动物口服试验51急性毒性试验（双酶梭菌CGMCCNO1995的安全性）按照中华人民共和国国家标准急性毒性试验ACUTETOXICITYTESTGB15193394设计动物实验。0046511菌剂的制备100ML发酵瓶中培养至对数生长期的菌液，4000R/MIN离心，生理盐水洗3次，对离心得到的湿菌体称重后进行小鼠口服试验，或冻干后长期保存。0047512实验方法实验小鼠ICR小鼠（封闭群）购自南京军区总医院比较医学科生产许可证号。
24、SCXK（军）2002012灌喂方式霍恩氏（HORN）法经口灌喂，鼠隔夜空腹（禁食16H左右），不限制饮水，各剂量组的灌喂容量相同（ML/KGBW）。0048实验流程将动物在动物实验室饲养观察35天，使其适应环境，证明其确系健康动物后，进行随机分组。给予受试样品后观察14天。记录死亡数，查表求得LD50，说明书CN102021130ACN102021144A6/6页8并记录死亡时间及中毒表现等。0049实验结果表明215，464，100，215MG/KGBW的剂量经口灌喂后，小鼠摄食、饮水等生理活动一切正常；仅215MG/KGBW灌喂组有1只小鼠死亡，解剖未发现器官异常；根据实验数据查霍恩氏法。
25、量表可知双酶梭菌ZX7（CGMCCNO1995）在小鼠中的半数致死量LD50215MG/KGBW，表明低于该剂量的菌制剂可以用于后续研究。005052口服ZX7对SD大鼠体重以及血脂组成的影响521实验方法18只60日龄，体重2119G的SD大鼠随机分为3组，分别为对照组、大豆黄酮组和大豆黄酮ZX7菌组；对照组饲喂无豆日粮（质量分数玉米500，小麦粉233，菜籽110，鱼粉130，复合维生素10，石粉03，NACL03，CAHPO411），大豆黄酮组饲喂无豆日粮并每天灌喂10MG/ML的大豆黄酮，大豆黄酮组加菌组饲喂无豆日粮并每天灌喂10MG/ML的大豆黄酮和100MG/KGBW的双酶梭菌ZX。
26、7（CGMCCNO1995）菌液。实验期为6周，实验最后一天称量体重，取血浆测量胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇。005152实验结果如图12所示，大豆黄酮组和大豆黄酮组加菌组虽然没有显著地降低动物的体重，但与对照组相比大豆黄酮组大鼠的体重降低了282；而大豆黄酮加菌组大鼠的体重则降低了269。如图1316所示，大豆黄酮加菌组极显著地降低了血液中总胆固醇的含量，而大豆黄酮组虽然也降低了胆固醇含量但效果不显著，可见大豆黄酮组加菌组的降胆固醇效果比单独添加大豆黄酮组好；进一步的研究发现，大豆黄酮组和大豆黄酮加菌组都显著性地降低了血液中低密度脂蛋白胆固醇的水平，而且大豆黄酮加菌组的效果。
27、更明显。同时，大豆黄酮组和大豆黄酮加菌组都显著性地提高了血液中高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白的比值，同样大豆黄酮加菌组的效果更明显，极显著的提高了该比值。说明口服双酶梭菌ZX7（CGMCCNO1995）菌株，有助于宿主外周血液中胆固醇的清除，从而有利于宿主的健康。0052上述实施例中所述的HPLC检测大豆苷原浓度、雌马酚浓度的方法如下色谱柱C18柱（15046MM，4M，WATERS）；流动相乙腈甲醇水203050（VV），流动相均经真空泵和超声清洗机抽滤脱气；流速08ML/MIN；检测器UV；检测波长205NM检测雌马酚，260NM检测大豆苷原；柱温30；进样量10L。说明书CN102021130ACN102021144A1/7页9图1图2说明书附图CN102021130ACN102021144A2/7页10图3图4说明书附图CN102021130ACN102021144A3/7页11图5图6说明书附图CN102021130ACN102021144A4/7页12图7图8说明书附图CN102021130ACN102021144A5/7页13图9图10说明书附图CN102021130ACN102021144A6/7页14图11图12图13说明书附图CN102021130ACN102021144A7/7页15图14图15图16说明书附图CN102021130A。