一种防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取物及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及中药领域， 具体涉及一种用于防治糖脂代谢紊乱相关疾病 （高脂血症、 糖尿病、 代谢综合症、 动物粥样硬化等相关疾病） 的中药石油醚提取物及其制备方法。背景技术
中国专利 200410051250.4 公开了一种治疗高脂血症的药物， 命名为 “复方贞术调 脂方” （FTZ） ， 含有女贞子、 大蓟、 白术、 丹参、 杜仲、 佛手， 还可以加入三七和黄连。各组分的 优选重量百分比为女贞子 20 ～ 25%、 大蓟 12 ～ 15%、 白术 10 ～ 15%、 丹参 10 ～ 15%、 杜仲 10 ～ 15%、 佛手 10 ～ 12%、 三七 10 ～ 12%、 黄连 6 ～ 10%。该方用于治疗高脂血症， 取得理想 疗效， 临床总有效率达 91%。
虽然复方贞术调脂方有良好的血脂调节和抗动脉硬化功能和临床疗效， 但是由于 是中药复方制剂， 还有许多不足之处 ： （1） 其成分较复杂， 其有效成分还不够清楚， 不易量 化， 实际应用中其产品质量不易获得有效控制， 最终将影响产品临床疗效的稳定性 ； （2） 制 备工艺相对简单， 方中有效成分得不到应有的纯化， 杂质成分多， 服用剂量大 ( 每天需要近 5 克以上 )， 病人服用顺应性不理想 ； （3） 由于方剂提取物量大， 不便制成各种控释剂型， 制 备药物制剂不能多样化， 应用范围受到各种限制。 发明内容 本发明的目的在于克服现有技术的上述不足， 提供一种疗效确切， 有效成分易于 量化， 质量易于控制， 服用量小的防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取物。
本发明的另一目的是提供上述石油醚提取物的制备方法。
本发明通过以下技术方案实现上述目的 ： 一种防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取物， 其有效成分为腊醇、 β- 谷甾醇、 正 二十六烷酸、 白术内酯Ⅲ、 齐墩果酸、 小檗碱、 药根碱、 丹酚酸 B、 环二十四烷、 9,12- 十八碳 二烯酸、 5,7- 二甲氧基香豆素、 人参皂苷 Rb1。
上述有效成分腊醇、 β- 谷甾醇、 正二十六烷酸、 白术内酯Ⅲ、 齐墩果酸、 小檗碱、 药 根碱、 丹酚酸 B、环二十四烷、 9,12- 十八碳二烯酸、 5,7- 二甲氧基香豆素、 人参皂苷 Rb1 的 重量比例为 1 ～ 5:1 ～ 8:1 ～ 8:1 ～ 5: 1 ～ 8: 1 ～ 8:1 ～ 5:1 ～ 5:1 ～ 5:1 ～ 5:1 ～ 5:1 ～ 6。
上述中药石油醚提取物的制备方法， 采用专利 200410051250.4 公开的治疗高脂 血症的药物 “复方贞术调脂方” （简称 FTZ） 的配方， 各组分按重量百分比表示 ： 女贞子 15 ～ 35%、 大蓟 10 ～ 25%、 白术 5 ～ 20%、 丹参 5 ～ 20%、 杜仲 5 ～ 15%、 佛手 5 ～ 15%， 优选组分为 ： 女贞子 15 ～ 35%、 大蓟 10 ～ 25%、 白术 5 ～ 15%、 丹参 5 ～ 15%、 杜仲 5 ～ 15%、 佛手 5 ～ 15%、 三七 5 ～ 15%、 黄连 3 ～ 10%。 将原料药丹参、 女贞子、 黄连、 大蓟、 杜仲、 白术、 三七和佛 手经过 C1-3 醇提和 / 或水提后， 合并总提取物， 再以石油醚萃取总提取物得到防治糖脂代谢 紊乱的中药石油醚提取物。其中 C1-3 醇为甲醇、 乙醇或丙醇。
上述方法包括以下步骤 ： （1） 将三七和女贞子进行 C1-3 醇提， 得到 C1-3 醇提物， 将大蓟、 白术、 丹参、 杜仲、 佛手和 黄连进行水提、 浓缩， 得到水提物， 合并 C1-3 醇提物和水提物得到总提取物 ； （2） 将步骤 （1） 得到的总提取物加入 0.5 ～ 15 倍， 优选 6 ～ 10 倍体积的石油醚， 萃取 1 ～ 5 次， 优选 3 ～ 4 次， 合并萃取液， 低温干燥， 得到防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取 物。
其中步骤 （1） 中所述 C1-3 醇提优选用 30 ～ 95 体积 % 的乙醇提取 1 ～ 5 次， 优选 2 ～ 4 次， 每次提取的 C1-3 的醇体积为药材质量的 1 ～ 15 倍， 优选 6 ～ 10 倍， 每次提取时间 为 5 min ～ 5 h， 优选 2 ～ 3 h。
步骤 （1） 中所述水提是以水煎煮 1 ～ 5 次， 优选 2 ～ 4 次， 每次用水的体积为药材 质量的 1 ～ 15 倍， 优选 6 ～ 12 倍， 每次煎煮时间为 5 min ～ 5 h， 优选 2 ～ 3 h。
步骤 （1） 中所述浓缩是指浓缩后的浓缩液体积为药材质量的 0.2 ～ 5 倍， 优选 1 ～ 2 倍。
得到的石油醚提取物按照药剂学上可以接受的载体， 使用一般制剂方法， 加工成 为口服制剂或注射制剂， 如片剂、 胶囊、 散剂、 丸剂、 粉末、 颗粒、 晶体、 溶液、 浸出物、 悬剂、 汤、 糖浆、 酏剂、 茶、 油等的形式。 用于制备预防或治疗糖脂代谢紊乱相关疾病 （高脂血症、 糖 尿病、 代谢综合症、 动物粥样硬化等相关疾病） 的药物制剂或保健食品。 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果 ： 通过本发明制备方法， 可以去除专利 200410051250.4 的中药复方中大量无效的化学 成分， 得到有效提取部位， 既保留了中药特色， 又使传统中药中的有效成分含量大大提高， 减少了无效成分对产品加工和制剂质量的影响， 使该复方中药有效成分明确， 制备工艺稳 定， 产品质量可控， 有利于工业化生产。动物体内试验表明， 该复方石油醚提取物对实验性 高脂血症、 高血糖症有明显降脂、 降糖作用， 并能降低胆固醇的作用， 改善脂质代谢， 防治动 脉硬化功效， 并且没有观察到明显副作用， 增加了用药的安全性。
本发明提供的复方中药石油醚提取物进一步拓展了复方贞术调脂方有效成分群 的应用范围， 为预防或治疗糖脂代谢相关疾病提供了一种新途径。本发明与同类防治糖脂 代谢脂紊乱相关疾病的药品比较， 疗效确切， 安全无明显毒副作用， 单独使用或与其它药物 复配都有良好的应用前景。
我们制备的中药石油醚提取物与原方相比较具有以下优点 ： （1）服用量由原来的 6g 提取物缩减为 100mg， 缩减为原来的 1/60 ； （2） 药物有效成分的含量提高约 60 倍 ； （3） 本发明提供的石油醚提取物稳定性好， 可制备多种口服控释制剂， 大大拓宽了复 方贞术调脂方在药物制剂领域中的应用， 显著提高了复方贞术调脂方有效成分的生物利用 度， 方便使用 ； （4） 动物体内试验表明， 本发明提取物对实验性高脂血症有明显降脂作用， 同时能降低 胆固醇， 改善脂质代谢， 同时对实验性高血糖症有明显降糖作用， 改善血糖代谢， 并且没有 观察到明显副作用， 增加了用药的安全性。 对于高脂饮食性高脂血症的降血胆固醇的药效， 该石油醚提取物部分指标优于原方， 达到了减少服用量而不降低药效的目的。
附图说明
图1： 实施例 3 复方中药石油醚提取物 HPLC 色谱图。具体实施方式
下面结合实施例来进一步解释本发明， 但实施例并不对本发明做任何形式的限 定。
实施例 1 中药复方总提取物的制备 将女贞子、 白术、 杜仲、 三七、 大蓟、 丹参、 黄连、 佛手 （重量比为 2:1:1:1: 1:2:1:1） 中的 三七、 女贞子两药粉碎成粗粉， 以药材量的 10 倍、 8 倍和 6 倍的 60 体积 % 乙醇分别回流提取 3 次， 每次 2 h， 合并提取液， 回收乙醇并使醇提部分浓度为 1 ml 相当于 1 g 生药 ； 方中其余 药材都以 12 倍、 10 倍和 8 倍量的水， 分别煎煮提取 3 次， 每次 2 h， 合并 3 次水提液， 真空减 压浓缩至 1 g 药材 /ml 提取液， 水体部分和前面醇提部分合并得到中药复方总提取物。
实施例 2 复方总提取物的石油醚提取部位的制备 以复方总提取物 10 倍体积的石油醚萃取 1 次， 分离石油醚层 ； 再以 8、 6 倍体积石油醚 萃取各 1 次， 分离得到石油醚层， 合并 3 次的石油醚萃取液， 回收石油醚， 再于 0.08MPa， 65℃ 真空干燥， 得到石油醚提取物 (FTZEE) ； 根据中药复方总投料量和得到提取部位的量， 计算提取物的得率。石油醚提取物的得 率在 0.3% ～ 0.5%（1kg 生药得石油醚提取物 3.0 ～ 5.0g） 。
实施例 3 复方总提取物的石油醚提取部位的化学成分分析 实施例 2 复方石油醚提取物 (FTZEE)，经 HPLC 分析， 得图 1 样指纹图谱。
FTZ 石油醚部位 UPLC 色谱条件 ： Agilent HC-C18 色谱柱 （4.6mm×250mm， 1µm） ， 保 护柱 phenomenex KJO-4282-C18 柱 ； 流动相采用乙腈 (A)- 水 ( 含 0.25% 冰乙酸 +0.13% 三乙 胺 )(B) 二元梯度系统。 梯度洗脱 ： 2~5% A (0~5 min)， 5%~20% A (5~35 min)， 20% A (35~45 min)， 20%~35% A (45~70 min)， 35%~80% A (70~85 min)， 80%~100%A (85~87 min)， 100%A (87~89 min)。检测波长为 254 nm、 300 nm 和 330 nm， 柱温为 30℃， 流速为 0.2 mL/min， 进 样量 10 µL。
定性分析结果 ： FTZ 石油醚部位主要含有腊醇、 β- 谷甾醇、 正二十六烷酸、 白术内 酯Ⅲ、 齐墩果酸、 小檗碱、 药根碱、 丹酚酸 B、环二十四烷、 9,12- 十八碳二烯酸、 5,7- 二甲氧 基香豆素、 人参皂苷 Rb1 等成分， 其 UPLC-MS 指纹图谱见附图 1， 其中各成分的重量比例为 1 ～ 5:1 ～ 8:1 ～ 8:1 ～ 5: 1 ～ 8: 1 ～ 8:1 ～ 5:1 ～ 5:1 ～ 5:1 ～ 5:1 ～ 5:1 ～ 6。
实施例 4 提取物胶囊的制备方法 提取物按照以下重量份组合 ： 实施例 2 石油醚提取物 5 份， 淀粉 5 份， 羧甲基纤维素 5 份。将上述比例的各提取物， 石油醚提取物与等量的淀粉混合均匀， 再与余下淀粉混合， 最后与羧甲基纤维素混合， 三者混合均匀后干法制粒， 减压干燥后， 整粒， 填充 3 号胶囊， 抛 光， 质检包装。每粒含 FTZEE 30 mg。服用剂量为一日 3 次， 每次 1 粒。用 HPLC 方法测定制 得的胶囊， 其含各有效成分含量结果见表 1 ： 表 1 FTZEE 胶囊 HPLC 含量测定结果制得的胶囊用于进行临床治疗高脂血症， 每天 3 次， 每次 1 粒， 连服 60 天， 结果病人血 脂总胆固醇、 甘油三酯在治疗组治疗后有明显下降， 降血脂总有效率为 90.5%， 与对照组比 较有显著差异 (P<0.01)。
实施例 5 提取物片的制备方法 用实施例 2 中制备得到的石油醚提取物 5 kg 加淀粉 5 kg， 羧甲基纤维素 5kg， 混匀， 加 75% 酒精制粒， 80℃干燥， 加硬脂酸镁适量， 压片， 包薄膜衣， 制得 FTZEE 片剂约 100 万片， 每 片含 FTZEE 50 mg。服用剂量为一日 2 次， 每次 1 片。HPLC 法测定上述片剂， 每片中各有效 成分含量测定结果见表 2 ： 表 2 FTZEE 片 HPLC 含量测定结果采用片剂进行临床治疗高脂血症， 每天 2 次， 每次 1 片， 连服 60 天， 结果病人血脂总胆 固醇、 甘油三酯在治疗组治疗后有明显下降， 降血脂总有效率为 93.3%， 与对照组比较有显 著差异 (P<0.01)。
实施例 6 提取物蜜丸的制备方法 制备 FTZEE 5.0 kg， 混匀制得 FTZEE 蜜丸。
以上 FTZEE 加淀粉 3 kg， 糊精 3.0 kg， 蜂蜜 8. 0 kg 泛丸成水蜜丸， 干燥得 15 kg 干燥丸， 包装成 10 万小粒的丸剂， 即得 0.15g/ 粒 （每粒含 FTZEE50 mg） 。口服剂量 ： 一次 1 小粒， 一日 2 次。
制得的蜜丸用于进行临床治疗高脂血症， 每天 2 次， 每次 1 粒， 连服 60 天， 结 果病人血脂总胆固醇、 甘油三酯在治疗组治疗后有明显下降， 与对照组比较有显著差异 (P<0.01)。降血脂总有效率为 91.5%。
实施例 7 急性毒性和长期毒性试验（1） 小鼠急性毒性试验 ： 将 120 只 19 ～ 21g NIH 小鼠 （雌雄各半） 分成 6 组， 每组 20 只， 分别以五种不同剂量的 FTZEE（实施例 2 方法制备） 口服灌胃 （p.o. ） 给药， 生理盐水 （NS） 阴性对照。观察小鼠的反应并记录每组小鼠的死亡数目， 采用 Microsoft Excel 的线性回 归软件， 根据对数剂量与经验概率单位绘制直线， 计算 LD50。 FTZEE 对小白鼠口服灌胃的 LD50 分别为 450 ～ 751 mg/kg（相当于人临床用量的 300 ～ 500 倍） 。
（2） 大鼠长期毒性实验 ： 取 Wistar 大鼠 120 只雌雄各半分成 4 组， 每组 30 只， 分 别 p.o. 给予 45 mg/kg、 90 mg/kg、 180 mg/kg 复方中药石油醚提取物， NS 阴性对照 p.o. 生 理盐水。连续给药 180 天， 三个剂量组 （相当于人临床用量的 30 ～ 120 倍） 大鼠均未见明显 血象、 心肺肝肾功能及神经系统无异常， 也未见心、 肺、 脾、 胃、 大脑、 肠等重要器官有明显病 理变化。
结论 ： 本发明的复方中药石油醚提取物毒性很低、 安全性高。
实施例 8 FTZEE 对饮食性高血脂模型动物血脂代谢的影响 1. 实验材料 药品与试剂 ： FTZEE， 制备方法同实施例 2 ； 复方贞术调脂方提取物 FTZ ； 总胆固醇、 甘 油三酯、 高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒。 动物 ： 清洁级 SD 大鼠、 体质量 (180 ～ 225 g)， 由南方医科大学省实验动物中心提 供； 纯种新西兰雌兔、 体质量 (1.80 ～ 2.20 kg)， 由广东省实验动物中心提供。
2. 实验方法 2.1 对饮食性高血脂模型大鼠的血脂的影响 观察不同剂量的 FTZEE 对高脂血症整体动物大鼠血清 TC、 TG、 LDL-C， HDL-C 的影响。
按文献报道方法 （郭姣 , 贝伟剑等， 复方贞术调脂方对饮食性高脂血症大鼠 肝脂酶的作用， 中药材， 2009， 31(4) ： 582 ～ 585） 复制并确认高血脂大鼠动物模型成功。
将动物随机分组 ： 将 96 只大鼠编号称重后随机分为 8 组， 每组 12 只， 设定①空白 正常对照组 ； ②高脂模型组 ； ③ FTZ 组 ； ④洛伐他丁组 ； ⑤非诺贝特组 ； ⑥⑦⑧依次为 FTZEE 高、 中、 低剂量 （15， 30， 60 mg/kg） 各实验组。除正常对照组自由摄取普通饲料外， 其余组分 别在此基础上每天上午按 10 ml ／ kg 量灌胃给予高脂乳剂， 4 h 后给予相应的药物， 其中正 常组、 模型组给予等量生理盐水， 连续给药 4 周， 禁食 1 d( 不禁水 )， 第 2 天清晨末次给药 1 h 后先从眼眶静脉丛取血， 离心、 分离血清， 分别测定 TC、 TG、 HDL-C、 LDL-C。
统计学方法 ： 数据用 x±s 表示， 用 SSP10.0 软件进行方差分析和均数间多重比较。
3 结果 3.1 对饮食高血脂模型大鼠的血脂的影响 研究结果表明， FTZEE 可明显降低饮食高血脂模型小鼠血清中总胆固醇 （TC） 、 甘油三 酯 （TG） 及低密度脂蛋白胆固醇 （LDL-C） ， 明显升高高密度脂蛋白 （HDL-C） ， 有调节血酯的作 用， 见表 3 ： 表 3 FTZEE 对饮食高血脂模型大鼠的血脂的影响
▲ ▲▲ 注： 与对照组比较 **P<0.01 ； 与高脂对照比较， F=3.82， P<0.05， p<0.01。
FTZ 和 FTZEE 对饮食高血脂模型大鼠有明显降血脂作用， 且呈现一定的量效关系。 防治实验性血脂代谢紊乱的作用， 其作用机理可能包括 ： （1） 本发明 FTZEE 经过系列动物实验研究表明， 该方降脂疗效显著， 同时兼具预防和治 疗高血脂双重作用， 除能影响脂代谢关键酶， 有效调节血脂外， 还具有改善血液流变学、 抗 氧化、 抗动脉粥样硬化等多重作用。
（2） 研究结果已证明， FTZEE 能大大增强高脂模型大鼠血清中 CYP7A1 和 HL 酶活性。 实施例 9 FTZEE 对肝细胞血脂代谢关键酶基因表达和活性的影响 考察本发明石油醚提取物对血脂代谢关键酶基因表达和活性的影响。
1. 方法 1.1 对 L-O2 肝细胞胆固醇 7-α- 羟化酶 （CYP7A1） 和肝脂酶 （HL） 活性的影响 按常规培养 L-O2 人正常肝细胞， 待细胞融合后分别加入各种不同浓度的 FTZEE（实施 例 2 方法制备） 和 FTZ， 继续培养 24 h 后， 收集细胞制成细胞匀浆， 用 HL 检测试剂盒， 采用 比色法检测 HL 活性， 研究上述不同浓度 FTZEE 对 HL1 酶活性的影响， 比较不同浓度 FTZEE 作用下的肝细胞中 HL 酶活性。
FTZEE 与肝 LO2 细胞共育培养 24 h 时间后， 收集肝细胞， 按 Hylemon 等报道的方 法 （详见 Hylemon, P. B.; Studer, E. J.; Pandak, W. M. et al 1989. Simultaneous measurement of cholesterol 7 alpha-hydroxylase activity by reverse-phase high-performance liquid chromatography using both endogenous and exogenous [4-14C] cholesterol as substrate. Analysic Biochemistry 182(2): 212-216） 制备 肝细胞微粒体， 用 CYP7A1 检测试剂盒， 采用 HPLC 法检测 CYP7A1 活性 ( Hylemon et al., 1989) ， 研究 FTZEE 对 CYP7A1 酶活性的影响， 比较不同浓度 FTZEE 作用下的肝细胞中 CYP7A1 活性变化。
1.2 对 HMGCoA 还原酶活性抑制实验 用上述 FTZEE 进行体外 HMGCoA 还原酶酶活性抑制实验， 测定并计算出它们对 HMGCoA 还原酶抑制的 IC50， 并与普伐他汀对比。
1.3 对 L-O2 肝细胞 CYP7A1 及 HL 基因表达的影响 按常规培养 L-O2 人正常肝细胞， 待细胞融合后分别加入 1.0 μg/ml 和 5.0 μg/ml 的 FTZEE 和 25.0 μg/ml 的 FTZ 为三组， 继续培养 24 h 后， 收集细胞， 用 Trigol 试剂提取肝细 胞中总 RNA， RT-PCR 法测定肝细胞中 CYP7A1 及 HL 酶基因表达情况， 观察 FTZEE 对肝细胞中 CYP7A1 及 HL 酶基因表达的影响 2 统计方法 数据以均值 ± 标准差表示， 用方差分析方法进行显著性检验。
3 实验结果 3.1 对肝细胞肝脂酶的影响 不同剂量 FTZEE 和 FTZ 处理后肝细胞肝脂酶活性显著增加 (P<0.01)， 并有明显剂量依 赖性， 结果见表 4。说明本发明中药石油醚提取物 （FTZEE） 对肝细胞肝脂酶活性具有显著提 高作用， 有利于加强脂蛋白的清降而降低血甘油三酯和胆固醇。
3.2 对肝细胞 CYP7A1 的影响 不同剂量 FTZEE 和 FTZ 处理后 CYP7A1 活性显著增加 (P<0.01)， 且有明显剂量依赖性的 增强， 结果见表 4。说明本发明中药石油醚提取物 （FTZEE） 对肝细胞 CYP7A1 活性具有显著 提高作用， 有利于促进胆固醇转化成胆汁酸， 而排泄， 从而降低血胆固醇。
表 4 不同药物对 L-O2 细胞 CYP7A1 及 HL 活性的影响注： 同正常对照组相比， *P<0.05 ； **P<0.01。 3.4 对 HMG-CoA 还原酶活性的抑制作用 用大白鼠肝细胞微粒体制成 HMG-CoA 还原酶溶液、 HMG-CoA 还原酶的活性测定则 采 用 文 献 方 法 进 行 (Kleinsek, D.A., Ranganathan, S. and Porter, J.W., 1977. Purification of 3-hydroxy-3 -methylglutaryl-coenzyme A reductase from rat liver. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 1431-1435) 分别 测定各药物指定浓度下酶活性， 求出 FTZEE 等各药物对 HMG-CoA 还原酶酶活性的 IC50 (μg/ ml)。
结果见表 5， 结果表明 FTZEE 能明显降低大鼠 HMG-CoA 还原酶酶活性， 且呈剂量依 赖性关系。 FTZEE 可抑制 HMG-CoA 还原酶的活性， 不仅阻碍胆固醇合成关键原料 HMG-CoA 的 合成， 而且抑制胆固醇的生物合成， 产生降胆固醇作用。
表 5 FTZEE 对 -HMG-CoA 还原酶活性的 IC50(μg/ml)FTZEE 抑制肝 HMG-COA R 降低酶活性， 抑制肝脏 TC 合成， 肝 TC 含量显著降低。
实施例 10 中药石油醚提取物对对胰岛 B 细胞的影响 1.1 方法 1.1.1 对胰岛 B 细胞的影响 按常规培养大鼠胰岛 B 细胞， 待细胞融合后分别加入 200 μM H2O2 共育 1 h， 然后加各 种不同浓度的 FTZEE（实施例 2 方法制备） 和 FTZ， 继续培养 24 h 时间后， 收集细胞制成细 胞匀浆， 用超氧化物歧化酶 （SOD） 、 过氧化氢酶 （CAT） 及谷胱甘肽过氧化物酶 （GSH-Px） 和谷 胱甘肽 （GSH） 检测试剂盒， 采用比色法检测 SOD、 CAT 及 GSH-Px 活性和 GSH 含量， 研究上述 不同浓度 FTZEE 对胰岛 B 细胞 SOD、 CAT 及 GSH-Px 活性和 GSH 含量活性的影响。 1.1.2 对胰岛 B 细胞中 Bcl-2、 PPAR-a 及 Bax 和 Fas 基因表达的影响 处理胰岛 B 细胞方法同 1.1.1， 用 Trizol 试剂提取胰岛 B 细胞中总 RNA， RT-PCR 法测 定胰岛 B 细胞中 Bcl-2 及 Bax 和 Fas 基因表达情况， 观察 FTZEE 对胰岛 B 细胞中 Bcl-2、 PPAR-a 及 Bax 和 Fas 基因表达的影响。
1.2 统计方法 ： 数据以均值 ± 标准差表示， 用方差分析方法进行显著性检验。
1.3 实验结果 1.3.1 对胰岛 B 细胞 SOD、 CAT 及 GSH-Px 活性和 GSH 含量的影响 不同剂量 FTZEE 和 FTZ 处理后胰岛 B 细胞 SOD、 CAT 及 GSH-Px 活性和 GSH 含量显著增 加 (P<0.01)， 且有明显剂量依赖性的增强， 结果见表 6。说明本发明 FTZEE 对胰岛 B 细胞 SOD、 CAT 及 GSH-Px 活性和 GSH 含量具有显著提高作用， 有利于抗氧化应激损伤。保护胰岛 B 细胞。
表 6 不同药物对氧化应激损伤胰岛 B 细胞 SOD、 CAT 及 GSH-Px 活性和 GSH 含量的 影响
注： （1） 同正常对照组相比☆☆ P<0.01 ； 同模型组相比， *P<0.05 ； **P<0.01。
（2） FTZ ： 复方贞术调脂方提取物， FTZEE ： 复方贞术调脂方石油醚提取物， BBR ： 盐 酸小檗碱。
1.3.2 对胰岛 B 细胞中 Bcl-2 及 Bax 和 Fas 基因表达的影响 正常组胰岛 B 细胞中 Bcl-2 及 Bax 和 Fas 基因表达表达正常， 不同剂量 FTZEE 处理后胰 岛 B 细胞中 Bcl-2 基因表达显著增加 (P<0.01)， 而 Bax 和 Fas 基因表达显著降低 (P<0.01)， 说明 FTZEE 对 Bcl-2 基因表达有明显促进作用 (P<0.01)， 而抑制细胞凋亡基因 Bax 和 Fas 的表达， 从而保护胰岛 B 细胞免受氧化应激损伤凋亡。结果见表 7。
表 7 不同药物对胰岛 B 细胞中 Bcl-2、 PPAR-a 及 Bax 和 Fas 基因表达的影响注： （1） 同正常对照组相比☆☆ P<0.01 ； 同模型组相比， *P<0.05 ； **P<0.01。
（2） FTZ ： 复方贞术调脂方提取物， FTZEE ： 复方贞术调脂方石油醚提取物， BBR ： 盐 酸小檗碱。
实施例 11 中药石油醚提取物对正常小鼠血糖的作用 动物 ： 健康 NIH 小鼠 60 只， 雌雄各半， 体重为 18 ～ 22 g。
分组 ： 按性别随机分为 5 组 ： 空白对照组， 格列本脲组， 复方总提取物组、 石油醚提 取物组 1、 2、 3组 （实施例 2 方法制备） ， 每组 10 只。
实验方法 ： 动物禁食 12 h 后， 自眼眶静脉丛取血， 血样 3000 rpm 离心 10 min， 分 离血清， 按葡萄糖试剂盒说明书操作， 测定血糖含量。 取血后立即灌胃给予给相应的供试药 物， 其中格列本脲 50 mg/kg， 空白对照组灌服同容积生理盐水， 各给药容积为 0.2 mL/10g 体 重。在给药后 3 h、 6 h 和 9 h 时， 分别按上述方法取血测定血糖含量， 实验结果见表 8。
结果经统计学分析选用 t 检验法， 比较各给药组与对照组之差异。
表 8 中药石油醚提取物对正常小鼠血糖的作用 （n=10 x ± s）与对照组比， * P ＜ 0.05。
实验结果表明， 与正常小鼠比， 在给药 3， 6， 9 小时后阳性对照药格列本脲组、 总提 取物组和石油醚提取各组对正常小鼠的血糖有显著的降低作用， 各组给药 6 小时后降糖效 果最显著。
实施例 12 中药石油醚提取物 （FTZEE） 对糖尿病模型小鼠的血糖的影响 药品与试剂 ： FTZEE（中药石油醚提取物， 实施例 2 方法制备） ； 血糖试剂盒 （北京北化 康泰试剂有限公司） ； 总胆固醇， 甘油三酯， 高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒 ； 链脲佐菌素 （STZ） ， 美国 Sigma 公司产品 ； 消渴安胶囊， 通化白山药业股份有限公司产品。
采用 Advantage 电子感应血糖仪及配套纸条 （瑞士 Roche 公司产品） 测定血糖。
实验对象是由南方医科大学省实验动物中心提供的清洁级 NIH 小鼠， 雌雄各半， 体重 18 ～ 22 g。
对链脲佐菌素 （STZ） 型糖尿病模型小鼠的血糖和血脂的影响 将 80 只健康 NIH 小鼠， 编号称重后随机分为 8 组， 每组 10 只， 取其中 1 组作为正常对 照组。其余各组小鼠禁食 16 小时后， 腹腔注射新鲜配制的 1% 链脲佐菌素溶液 150 mg/kg，72 小时后， 眼内眦取血， 采用 Advantage 电子感应血糖仪及配套纸条 （瑞士 Roche 公司产品） 测定血糖， 血糖值大于 16.7 mmol/L 者确定为糖尿病模型鼠。将糖尿病模型鼠按血糖值编 号后随机分为 7 组， FTZEE 3 个治疗组 （30、 60、 120 mg/kg） 、 FTZ2 组 （250， 500 mg/kg） 、 消渴 安胶囊治疗组 （500 mg/kg） 、 模型对照组。各组分别灌胃给药 1 次 / 天， 连续给药 30 天， 在 末次给药前 12 小时起动物禁食、 给药后 2 小时分别从小鼠眶静脉丛取血， 血样 3000 rpm 离 心 10 min， 分离血清， 按葡萄糖试剂盒说明书测定血糖含量。
对肾上腺素引起的高血糖小鼠的血糖的影响 将 60 只健康 NIH 小鼠， 编号称重后随机分为 6 组， 每组 10 只， 取其中 1 组作为正常对 照组、 肾上腺素组、 FTZEE 大小剂量 （120、 60mg/kg） 组、 FTZ 250 mg/kg 组、 消渴安胶囊治疗 组 （500 mg/kg） 。各组分别灌胃给药 1 次 / 天， 正常对照组和肾上腺素组给予等体积生理 盐水， 连续给药 7 天， 在末次给药 2 h 后， 对照组 ip 等体积生理盐水， 其余各组 ip 肾上腺素 （240 mg/kg） 溶液， 分别在 ip 肾上腺素后 0.5 h、 1 h 从小鼠眶静脉丛取血， 分离血清、 测定 血糖。
对葡萄糖引起的高血糖小鼠的血糖的影响 将 60 只健康 NIH 小鼠， 编号称重后随机分为 6 组， 每组 10 只， 正常对照组、 葡萄糖高糖 模型组、 FTZEE 大小剂量 （120、 60mg/kg） 组、 FTZ 250 mg/kg 组、 消渴安胶囊治疗组 （500 mg/ kg） 。各组分别灌胃给药 1 次 / 天， 正常对照组和葡萄糖组给予等体积生理盐水 （NS） ， 连续 给药 7 天， 在末次给药 2 h 后， 对照组腹腔注射 （ip） 等体积生理盐水， 其余各组 ip 葡萄糖 （2 g/kg） 溶液， 分别在 ip 葡萄糖后 0.5、 1、 2 h 从小鼠眶静脉丛取血， 分离血清、 测定血糖。
实验结果见表 9、 表 10、 表 11。
表 9. FTZEE 对链脲佐菌素 （STZ） 型糖尿病模型小鼠的血糖的影响 （n=10， x±s）* ** △ △△ 注 : 同正常组相比， P<0.05， P<0.01 ； 同模型组相比， P<0.05， P<0.01 ； 同治疗前 ▲ ▲▲ 相比 P<0.05， P<0.01。
表 10. FTZEE 对肾上腺素引起的高血糖小鼠的血糖的影响 （n=10， x±s）* ** ▲▲ 注 : 同正常组相比， P<0.05， P<0.01 ； 同治疗前相比， P<0.01。
表 11. FTZEE 对葡萄糖引起的高血糖小鼠的血糖的影响 （n=10， x±s）** ▲▲ 注 : 同正常组相比， P<0.01 ； 同治疗前相比▲ P<0.05， P<0.01。实施例 13 FTZEE 对氢化可的松诱发小鼠胰岛素抗性的影响 将 40 只小鼠编号称重后随机分为 4 组， 每组 10 只， 取其中一组皮下注射生理盐水 （NS） 作为正常对照组、 一组皮下注射氢化可的松 （36 mg/kg） 、 另两组皮下注射氢化可的松 （36 mg/kg） 再分别灌胃 FTZEE 大小剂量 （60、 120 mg/kg， 实施例 2 方法制备） 。各组分别灌胃给 药 1 次 / 天， 正常对照组和氢化可的松组给予等体积生理盐水， 连续给药 10 天， 在末次给 药 2 h 后， 对照组 ip 等体积生理盐水， 其余各组 ip 胰岛素 （0.5 g/kg） ， 分别在 ip 葡萄糖后 0.5、 2 h 摘眼取血， 分离血清、 全自动生化分析仪测定血糖。结果如表 12、 表 13 所示。
表 12 FTZEE 对氢化可的松诱发小鼠胰岛素抗性的影响 （n=10， x±s）
表 13FTZEE 对氢化可的松诱发小鼠胰岛素抗性的影响 （n=10， x±s）** ▲▲ 注 : 同正常组相比， P<0.01 ； 同氢化可的松 +NS 组相比▲ P<0.05， P<0.01。
实施例 14 FTZEE 对链脲佐菌素型糖尿病模型大鼠的作用 药品与试剂 ： 链脲佐菌素 （STZ） ， 美国 Sigma 公司产品 ； 枸橼酸钠， 汕头市光华化学厂产 品， 批号 20000116。
实验对象是雌性 Wistar 普通级大鼠 36 只， 体重 220~250 g。 （第一军医大学实验 动物中心提供， 合格证号 ： 粤检证字第 2004B023 号） 所有大鼠适应性喂养一周后， 禁食 12 h， 取 7 只大鼠为正常对照组 （简称对照组） ， 其他 大鼠一次性腹腔注射 50 mg/kg STZ（STZ 临用前用 0.1 mol/L、 pH 4.5 的枸橼酸钠缓冲液 配制， 10 min 内用完） ， 对照组则注射等量枸橼酸钠溶液。72 h 后血糖 FBG 大于 16.7 mmol/ L 者为高血糖糖尿病模型大鼠。糖尿病大鼠随机分为糖尿病模型组、 FTZEE 大小剂量组 （实 施例 2 方法制备） 。大剂组按人与大鼠等效剂量比每日 40 mg/5 ml/ kg 给药， 小剂组每日 20 mg/5 ml/kg， 模型组和正常组每日给 5 ml/kg 蒸馏水， 上午灌胃一次， 治疗 15 天。各组 造模前、 造模后、 治疗后断尾取血测血糖 （FBG） 、 血清胰岛素 （Ins） ， 最后取大鼠胰脏作标本 进行 HE 染色和免疫组化染色。
采用 Advantage 电子感应血糖仪及配套纸条 （瑞士 Roche 公司产品） 测定血糖。血 糖用葡萄糖氧化酶法， 血清胰岛素用放免法。
实验数据以均值 ± 标准差 （x±s） 表示， 用方差分析方法进行显著性检验。
对血糖的影响结果见表 14， 模型组和正常组比较， FBG 显著升高 （P<0.01） ， 大小剂量治疗后和模型组比较 FBG 显著下降 （P<0.01） ， 说明 FTZEE 有显著降血糖作用。
表 14 FTZEE 对 STZ 模型各组大鼠血糖变化表 （mmol/L）* ** △ △△ 注 : 同正常组相比， P<0.05， P<0.01 ； 同模型组相比， P<0.05， P<0.01 ； 同治疗前 ▲ ▲▲ 相比 P<0.05， P<0.01。对血清胰岛素的影响结果见表 15， 模型组和正常组比较， Ins 显著降低 （P<0.01） ， 大小剂量治疗后血清 Ins 水平比模型组显著升高 （P<0.05） ， 表明 FTZEE 对 Ins 分泌有一定 的促进作用。
表 15 FTZEE 对 STZ 模型各组大鼠血清胰岛素变化表 （mU/L）
* ** △ △△ 注 : 同正常组相比， P<0.05， P<0.01。同造模前相比， P<0.05， P<0.01 ； 同模型组 ▲ ▲▲ 相比 P<0.05， P<0.01。
HE 染色组织学观察发现 ： 正常组胰岛为圆形、 椭圆形细胞团， 境界清楚， 胰岛数及 岛内细胞数较多， 胞质丰富 ； STZ 模型组胰岛数及岛内细胞数减少， 细胞形态不规则， 核大 小不等、 形态不一， 部分核固缩， 少数细胞呈空泡状 ； 大剂量组胰岛数及岛内细胞数明显增 多， 细胞分布均匀， 核大小基本相等， 无核固缩 ； 小剂量组胰岛数及岛内细胞数增多， 形态较 为规则， 少部分核固缩。这说明 FTZEE 对 STZ 模型损伤的胰岛细胞组织有显著的保护作用， 并能促进胰岛素的分泌。
实施例 15 预防和 / 或治疗高血糖 / 糖尿病的临床验证 FTZEE 片 （中药石油醚提取物片， 实施例 5 方法制备） 治疗糖尿病 60 例分析 试验参照郑筱萸主编， 中药新药临床研究指导原则 （试行） ， 中国医药科技出版社， 2002年第 1 版， 233-237 ： 中药新药治疗糖尿病的临床研究指导原则进行。
1. 临床资料 60 例患者均系根据 1993 年诊断标准确诊的非胰岛素依赖型住院患者， 其中， 门诊 40 例， 住院 20 例 ； 随机分为两组， 治疗组 30 例中， 男 16 例， 女 14 例 ； 年龄 39~65 岁， 平均年龄 （51.3±8.6） 岁。糖尿病病程 3~15 年， 平均病程 （6.8±2.9） 年； 合并高血脂症者 19 例， 冠 心病者 10 例、 高血压者 18 例 ； 对照组 30 例中， 男 15 例， 女 15 例 ； 年龄 38~65 岁 ； 平均年龄 （51.5±6.8） 岁； 糖尿病病程 2.5~16 年， 平均病程 （6.9±3.1） 年； 合并高血脂症者 20 例， 冠心病者 9 例、 高血压者 17 例。两组在性别、 年龄、 病程、 并发症方面经统计学处理， 无显著 差异 （P>0.05） ， 具有可比性。
2. 诊断标准 西医诊断标准 （根据 1999 年 WHO 专家咨询报告） ： 空腹血糖 （FPG） ≥ 7.0 mmol/L 及餐 后 2 小时血糖 （2 HPG） ≥ 7.0 mmol/L， 随机血糖≥ 11.1 mmol/L。
高压血参照 1999 年世界卫生组织 / 国际高血压联盟关于高血压的分类分期方法 制定 （1999 年世界卫生组织 / 国际高血压联盟关于高血压治疗指南 , 高血压杂志 , 1999, 7(2): 9） 。
中医诊断标准参照中华人民共和国卫生部中医新药治疗消渴病 （糖尿病） 的临床 研究指导原则 (1993) ： 凡具有或咽干口燥、 倦怠乏力、 多食易饥、 口渴喜饮、 气短懒言、 五心 烦热、 心悸失眠、 胸胁疼痛、 尿赤便秘、 舌质红或黯红、 淡紫或有瘀点瘀斑， 脉沉细或弦涩， 中 医辨证为气阴两虚、 血瘀脉络证者。
3. 治疗方法 治疗组服用中药石油醚提取物片剂 ( 简称 FTZEE 片 )， 每次 1 片， 每天 2 次， 2 个月为 1 疗程， 其间停用其它降糖药物。
对照组采取消渴安胶囊 (0.4g/ 粒， 通化白山药业股份有限公司生产 ) 治疗， 每次 3 粒， 每天 3 次， 2 个月为 1 疗程， 治疗 2 型糖尿病。
两组患者均进行糖尿病教育、 饮食控制、 适量运动。全部病例观察 2 个月。
4. 观察指标 治疗前后测血压、 空腹血糖 (FBG) 及餐后 2 小时血糖 (2 HFBG)（葡萄糖氧化酶法） 、 糖 基化血红蛋白 （HbALc） 、 肝肾功能、 尿常规、 治疗期间 2、 4、 6 周同时检测血压。
5. 临床疗效 参照中华人民共和国卫生部中医新药治疗消渴病 （糖尿病）的临床研究指导原则 (1993) 疗效标准进行评定。显效 ： 症状消失， 实验室检查多次正常 ； 有效 ： 主要症状及有关 实验室检查有改善 ； 无效 ： 症状及有关实验室检查无变化。
病人治疗前后血糖、 血液流变学变化情况如表 16 和 17 所示。
表 16 两组治疗前后血糖、 HbALc 比较★ ★★ 注： 与本组治疗前比较， P<0.05， P<0.01。
由表 16 可见， 两组患者治疗后空腹及餐后 2 小时血糖、 糖基化血红蛋白均有 明显下降 ； 与对照组比较有显著差异 （P<0.01） ， 对照组治疗后也有相似效果， 说明 FTZEE 治 疗 2 型糖尿病在改善血糖、 尿蛋白方面有显著疗效。
表 17 示出 FTZEE 片对糖尿病、 代谢综合征的疗效统计， 表明 FTZEE 片对糖尿病病 人有降血糖的疗效。
表 17FTZEE 片对糖尿病、 代谢综合征的疗效统计* 注： 与消渴丸组比较， P<0.05。
因此， 本发明中药石油醚提取物 （FTZEE） 片对糖尿病的总有效率为 90.0%， 显效 60.0%， 比目前常用药的 87% 的总有效率略高， 并且没有观察到明显副作用。
结论 ： FTZEE 是经现代中药药理研究证实具促进胰岛素分泌， 增加血清胰岛素的 含量有降糖、 改善血糖代谢的作用。其作用机理可能包括 ： （1） FTZEE 能增强 B 细胞超氧化物歧化酶 （SOD） 、 过氧化氢酶 （CAT） 及谷胱甘肽过氧化 物酶 （GSH-Px） 活性和 GSH 含量， 能抑制脂质过氧化和清除羟基自由基， 抗氧化应激损伤， 促 进胰岛 B 细胞再生。
（2） FTZEE 能增加胰岛 B 细胞抗细胞凋亡因子 Bcl-2 基因表达并抑制胰岛 B 细 胞凋亡因子 Bax 和 Fas 基因表达， 从而减少凋亡的发生， 刺激正常胰岛 B 细胞分泌胰岛素。
（3） FTZEE 能增加胰岛 B 细胞抗炎症因子 PPAR-a 基因表达， 拮抗炎症因子的作用， 减少胰岛 B 细胞损伤。通过保护、 修复胰岛 B 细胞而增加血清胰岛素的含量。
临床研究结果表明， 本发明防治糖脂代谢紊乱的中药石油醚提取物 FTZEE 具有显 著的降糖、 改善血糖代谢作用， 治疗高血糖及糖尿病血糖代谢紊乱相关疾病临床疗效确切。