一类含二茂铁吡唑基的有机锡氧簇合物及其用途 一、 技术领域
本发明涉及一类具有抗肿瘤活性金属有机配合物， 确切地说是一类含二茂铁吡唑 基的有机锡氧簇合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。 二、 背景技术
自从 1965 年美国 Rosenbe 偶然发现顺铂具有抗癌活性以来， 金属配合物的药用性 引起了人们的广泛关注， 开辟了金属配合物抗癌药物研究的新领域。铂类化合物在治疗某 些癌症方面的确取得了一些效果， 但是严重的副作用也显示出来， 这就促使我们寻找一些 新的药物来代替。随着人们对金属配合物的药理作用认识的进一步深入， 新的高效、 低毒、 具有抗癌活性的金属化合物不断被合成出来。1972 年 Brown 首次发现 Ph3SnO2CCH3 具有抑 制小鼠肿瘤的生长作用以来， 人们对有机锡的合成、 分子结构及生物活性研究越来越多， 并 取得了很多有意义的结果。到 1989 年为止美国抗癌测试中心 (NCI) 已筛选了 2000 多种有 机锡化合物， 其中很多为有机锡氧簇合物。现在研究较多的主要是三烃基锡和二烃基锡的 化合物。由于低分子量有机锡化合物能严重损害动物体的免疫系统， 因此小分子量有机锡 化合物不宜于作抗癌剂。Sherman 建议用低毒或无毒具有抗癌活性的长链烷基、 环烷基、 芳 基有机锡化合物代替小分子量烃基锡， 其抗癌效果可能更好。 许多的二丁基锡、 三丁基锡和 三苯基锡的羧酸类化合物显示了高效的抗癌活。 许多抗癌活性测定表明， 有机锡中的基团 R 是决定整个配合物的抗癌活性的主要因素， 环己基、 正丁基和苯基的配合物抗癌活性最强， 乙基次之， 甲基最弱几乎无效， 但是配体的结构对配合物的抗癌活性和抗癌谱同样起着重 要的作用。配合物在生理条件下通过缓慢水解过程， 最终形成活性中间体与癌细胞 DNA 分 子作用， 进而妨碍 DNA 的复制而发挥抗癌活性， 有机配体 R 促进配合物进入癌细胞的跨膜运 动， 并由此而影响配合物的最终活性。
申请人对本申请的主题进行了如下的文献检索 ：
1、 http://www.google.com 网检索结果 ： (2010/12/28)
2、 中国期刊网检索结果 ： 全文 - 二茂铁吡唑有机锡氧簇合物无相关文献。 全文 - 抗肿瘤活性二茂铁吡唑有机锡氧簇合物无相关文献。三、 发明内容
本发明的目的在于提供一类具有抗肿瘤活性的有机锡氧簇合物， 所要解决的技术 问题是遴选配体并确认该有机锡簇合物的抗肿瘤活性。
本发明选择具有生物活性的 3- 三氟甲基 -5- 二茂铁吡唑乙酸作为配体， 分别与 单丁基氧化锡、 二丁基氧化锡和三苯基氢氧化锡组装合成含二茂铁吡唑基的有机锡氧簇合 物。并对其进行抗肿瘤活性筛选。
3- 三氟甲基 -5- 二茂铁吡唑乙酸有以下化学式 ：
在以下的叙述中为方便表述， 记作 ： LCOOH。
本发明所称的二茂铁吡唑基有机锡氧簇合物之一是由配体 LCOOH 与单丁基氧化 锡制备的有以下化学式的配合物 ：
式中 L ： R′ ： n-Bu，在以下的叙述中为方便表述， 记为 ： [BuSnO(OOCL)]6。
本发明所称的二茂铁吡唑基有机锡氧簇合物之二是由配体 LCOOH 与二丁基氧化 锡制备的有以下化学式的配合物 ：
式中 L ： R′ ： n-Bu在以下的叙述中为方便表述， 记为 ： [Bu4Sn2O(OOCL)2]2。
本发明所称的二茂铁吡唑基有机锡氧簇合物之三是由配体 LCOOH 与三苯基氢氧 化锡制备的有以下化学式的配合物 ：
式中 L ： R：在以下的叙述中为方便表述， 记为 ： [Ph4Sn2O(OCH3)(OOCL)]2。
申请人对上述三种配合物进行了体外抗肿瘤活性研究， 确认三者均具有抗肿瘤的 生物活性， 也就是说上述三种配合物的用途就是在制备抗肿瘤药物中的应用， 具体地说就 是在制备抗肺癌或抗肝癌或抗黑色素瘤药物中的应用。
本发明具有以下的特点 ：
1、 本发明选取了 3- 三氟甲基 -5- 二茂铁吡唑乙酸作为配体， 不仅为组装金属配合 物提供了有利的条件， 而且引入了毒性低， 生物活性好的有机基团， 从而达到提高配合物的 生物活性 ( 见表 1)。
2、 本发明采用的原料便宜易得， 成本低。而且， 毒性低， 环境友好。
四、 附图说明
图 1 是配合物 [BuSnO(OOCL)]6 的晶体结构图。 图 2 是配合物 [Bu4Sn2O(OOCL)2]2 的晶体结构图。 图 3 是配合物 [Ph4Sn2O(OCH3)(OOCL)]2 的晶体结构图。五、 具体实施方式
通过以下实施例进一步详细说明本发明， 但应注意本发明的范围并不受这些实施 例的任何限制。
一、 配体 [3- 三氟甲基 -5- 二茂铁吡唑乙酸 (LCOOH)] 的合成 ：
称 取 5- 二 茂 铁 基 -3- 三 氟 甲 基 吡 唑 S(6.40g， 0.02mol) 溶 解 在 乙 腈 中， 再称 取 t-BuOK(3.36g， 0.03mol) 加入到上述溶液中， 60 ℃加热 2h 后， 将 BrCH2COOC2H5(6.68g， 0.04mol) 逐滴滴入烧瓶中， 滴完后反应进行 4 ～ 5h， TLC 检测知反应基本结束。减压蒸 出乙腈， 加水升温回流使产物水解， 1.5h 后结束反应， 取出混合物， 冰浴下向上述混合物 中滴加稀 HCl(1M) 调节溶液的 pH 至弱酸性 (pH ＝ 5 ～ 6)。用乙酸乙酯反复萃取， 保留 过滤。蒸出乙酸乙酯， 得黄色油状物， 通过柱层析分 乙酸乙酯层， 用无水 MgSO4 干燥过夜， 离。得到纯品 3.40g， 产率 45 ％， MS ： (EI， 70eV) ： MS ： (EI) ： M/z ＝ 378.02[M+].Anal.Calc for C15H13O2N2F3Fe ： C 47.70， H3.39， N 7.38 ％ ； Found ： C 47.62， H 3.44， N 7.41 ％ .1H NMR(400MHz， CDCl3) ： δ ＝ 4.293(s， 5H)， 4.490(s， 4H)， 5.086(s， 2H)， 6.512(s， 1H)
二、 有机锡氧簇合物的合成
1、 [Ph4Sn2O(OCH3)(OOCL)]2 的合成
称取 Ph3SnOH(0.1472， 0.4mmol) 和 LCOOH(0.1512g， 0.4mmol) 于 50mL 圆底烧瓶中， 加入 25mL 苯， 用油水分离器除去反应中生成的少量水， 回流 12h 后减压蒸馏除去苯得黄色 固体， 以二氯甲烷∶甲醇＝ 2 ∶ 1(v/v) 溶解， 过滤， 转入 50mL 小锥形瓶中静置， 一星期后 有黄色晶体析出。Anal.Calcd.for C82H70N4O8F6Fe2Sn4 ： C 50.77， H 3.64， N 2.89 ； Found ： C 119 50.57， H 3.655， N 2.902(％ ). Sn NMR(CDCl3) ： δ ＝ -88.243ppm.
2、 [BuSnO(OOCL)]6 的合成
称 取 n-BuSnO(OH)(0.0836g， 0.4mmol) 和 LCOOH(0.1512， 0.4mmol) 于 50mL 圆 底 烧瓶中， 加入 25mL 苯， 用油水分离器除去反应中生成的少量水， 回流 12h 后减压蒸馏除去 苯得黄色油状物， 用乙腈溶解过滤， 转入 50mL 小锥形瓶中静置， 三天后析出黄色块状晶体。 Anal.Calcd forC120H124N12O18F18Fe6Sn6 ： C 42.25， H 3.66， N 4.93 ； Found ： C 42.18， H 3.723， 119 N 4.648(％ ). Sn NMR(CDCl3) ： δ ＝ -478.1ppm.
3、 [Bu4Sn2O(OOCL)2]2 的合成
称取 n-Bu2SnO(0.0996g， 0.4mmol) 和 LCOOH(0.1512， 0.4mmol) 于 50mL 圆底烧瓶 中， 加入 25mL 苯， 用油水分离器除去反应中生成的少量水， 回流 12h 后减压蒸馏除去苯得 黄色油状物， 用甲醇溶解过滤， 转入 50mL 小锥形瓶中静置， 一星期后析出黄色块状晶体。 Anal.Calcd.forC96H120N8O10F12Fe4Sn4 ： C 46.64 ； H 4.89 ； N 4.53 ； Found ： C 46.48， H 4.810 ； 119 N 4.312(％ ). Sn NMR(CDCl3) ： δ ＝ -200.568， -204.243ppm.
三、 二茂铁吡唑基有机锡氧簇合物的体外抗肿瘤活性研究
采用 MTT[3-(4， 5)- 双甲基 -2- 噻唑 -(2， 5)- 苯基溴化四氮唑蓝 ] 法来测定类衍 生物对人肺癌细胞 (A549)， 人肝癌细胞 (HepG2) 和小鼠黑色素瘤 (B16-F10) 的最低抑菌浓 度 (minimalinhibitory concentration， MIC)。
(1) 培养液 ( 每升 ) 的配制 ： ①悬浮细胞 ： RPMI-1640 培养粉一袋 (10.4g)， 新生牛 血清 100mL， 青霉素溶液 (20 万 U/mL)0.5ml， 链霉素溶液 (20 万 U/mL)0.5mL， 加三蒸水溶解 后， 用 5.6％的 NaHCO3 溶液调 pH 值至 7.2-7.4， 最后定容至 1000mL。过滤灭菌。②贴壁细 胞： 同上， 再加入 NaHCO32.00g， HEPES 2.38g。
(2)D-Hanks 缓 冲 液 ( 每 升 ) 的 配 制 ： NaCl 8.00g， KCl 0.40g， Na2HPO4·12H2O 0.06g， KH2PO4 0.06g， NaHCO3 0.35g。高压灭菌。
(3) 胰蛋白酶液的配制 ： 利用 D-Hanks 缓冲液配成浓度为 0.5％胰蛋白酶液。过滤 除菌。
(4) 实验药液的配制 ： 将测试样品用少量的三蒸水溶解配成储备液， 一般按实验 最高浓度的 10 倍配制储备液。根据化合物溶解性不同， 可用三蒸水直接溶解， 或用少量 DMSO 助溶， 再加三蒸水溶解。DMSO 在培养液中的浓度不宜过大， 加药后的每孔细胞悬液中 DMSO 的终浓度一般不超过 0.05％ -0.1％。储备液保存于 -20℃冰箱中备用。
(5) 人肺癌细胞 (A549) 的培养 ： 为贴壁生长细胞， 常规培养于 RPMI-1640 培养液 内 ( 含 10％小牛血清、 100U/mL 链霉素 )， 置 37℃、 5％ CO2 培养箱中培养， 每隔 3-4 天传代一 次。传代时先弃去原培养液， 再用 D-Hanks 缓冲液洗涤 ； 然后用 0.5％胰蛋白酶消化 30 秒 左右， 加入少量新鲜培养液终止消化 ； 吹打， 使贴壁细胞从培养瓶壁上脱落下来 ； 移取适量至新鲜培养瓶中， 再补充新鲜培养液至原体积 ( 培养液体积约为培养瓶容量的 1/10)。
(6) 人肝癌细胞 (HepG2) 的培养 ： 为悬浮生长细胞， 常规培养于 RPMI-1640 培养液 内 ( 含 10％小牛血清、 100U/mL 链霉素 )， 置于 37℃、 5％ CO2 培养箱中培养， 每隔 3-4 天传 代一次。传代时将原瓶中培养液转移至离心管中， 1000rpm 离心 5min， 弃去原培养液， 加入 等量新鲜培养液， 吹打均匀， 移取适量至新鲜培养瓶中， 再补充新鲜培养液至原体积 ( 培养 液体积约为培养瓶容量的 1/10)。
(7) 小鼠黑色素瘤 (B16-F10) 的培养 ： 与人肝癌细胞 (HepG2) 的培养方法相同。
(8) 细胞孵育 ： 取对数生长期的 3 种肿瘤细胞， 调细胞悬液浓度为 1-1.5×105 个 mL-1。在 96 孔培养板中每孔加细胞悬液 100μL， 置 37℃， 5％ CO2 培养箱中培养 24h。培养 24h 后， 分别按设计加入药液。
(9) 加药 ： 将测试药液按照最终浓度的浓度梯度分别加入到各个孔中， 每个浓度 设 6 个平行孔。实验分为药物试验组 ( 分别加入不同浓度的测试药 )、 对照组 ( 只加培养液 和细胞， 不加测试药 ) 和空白组 ( 只加培养液， 不加细胞和测试药 )。将加药后的 96 孔板置 于 37℃， 5％ CO2 培养箱中培养 48h。阳性对照药物 ( 五氟脲嘧啶、 顺铂 ) 的活性按照测试 样品的方法测定。
(10) 存 活 细 胞 的 测 定 ： 在 培 养 了 48h 后 的 96 孔 板 中， 每 孔 加 MTT 40μL( 用 D-Hanks 缓冲液配成 4mg/mL)。在 37℃放置 4h 后， 移去上清液。每孔加 150μLDMSO， 振荡 5min， 使 formazan 结晶溶解。 最后， 利用自动酶标仪在 570nm 波长处检测各孔的光密度 (OD 值 )。
抑制率的计算 ： 细胞生长的抑制率按照下列公式计算 ：
生长抑制率＝ (1- 存活率 )×100％＝ [1-(OD 实验 -O 空白 )/(OD 对照 -OD 空白 )]×100％ (OD 实验表示测试药物组的平均光密度， OD 对照表示对照组的平均光密度， OD 空白表示对照组的 平均光密度 )。
半数抑制浓度 (IC50) 定义为当 50％的肿瘤细胞存活时的药物浓度。 根据测定的光 密度 (OD 值 )， 制作细胞生长抑制率的标准曲线， 在标准曲线上求得其对应的药物浓度。测 得的 IC50 见表 1 所示
表 1 本发明所列部分含二茂铁吡唑基有机锡羧酸酯对肿瘤细胞的抑制 IC50 值 (μg/mL)
由此可见本三种配合物对 A549、 HepG2 和 B16-F10 的抑制作用明显优于对照药五 氟脲嘧啶和顺铂， 有望在制备抗肿瘤药物中应用。