抗人血管内皮生长因子受体 2 的重组嵌合抗体 技术领域 本发明涉及免疫学技术领域， 特别是嵌合抗体及其用途， 具体的说是一种抗人血 管内皮生长因子受体 2 的重组嵌合抗体及其制备方法和用途。
背景技术 近几年免疫靶向疗法在临床诊疗中显示出较好的前景， 血管生成和血管相关疾病 ( 包括肿瘤 ) 主要依靠血管生长因子 (VEGF) 和血管生长抑制因子的调控， 其中最密切的是 血管内皮生长因子及其受体 (VEGFR)， 特别是血管内皮生长因子及其受体 2(VEGFR-2)。若 有理想的靶向药物识别 VEGR/VEGFR 通道， 则可起到诊疗疾病的作用。
由于抗体的高度特异性， 利用抗体将药物导向靶点细胞是一种理想的途径， 当前 单克隆抗体药物或抗体偶联药物已成为制药行业中增长最快、 获利最大的市场之一。
以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术在制备治疗性抗体药物 是今年来的研究热点， 其在感染、 心血管疾病、 自身免疫性疾病、 肿瘤治疗中有巨大的潜力 与应用前景。 抗体药物作用靶点的选择性、 抗体药物的人源化、 小型化和高效化也是今后的 研究重点。
由于鼠源单克隆抗体的临床应用的产生人抗鼠抗体反应 (HAMA) 和过敏反应， 减 低了药物的疗效， 因而运用基因工程技术将鼠源抗体进行改造， 降低 HAMA 反应， 同时仍然 保留了抗体的特异性和亲和力， 利用真核表达系统进行表达 IgG 全抗体， 使目标抗体结构 更接近天然， 更具有使用价值。发明内容
本发明的目的之一在于提供一种抗人血管内皮生长因子受体 2 的重组嵌合抗体 及其编码基因。
本发明所述的一种抗人血管内皮生长因子受体 2 的重组嵌合抗体， 包含 ：
(1) 抗人血管内皮生长因子受体 2 鼠源抗体的轻链可变区和人免疫球蛋白 IgG 的 κ 轻链恒定区组成的嵌合轻链， 所述的嵌合轻链含有 SEQ NO1 所示的氨基酸序列， SEQ NO1 氨基酸序列如下 ： SEQ NO1
PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
以及
(2) 抗人血管内皮生长因子受体 2 鼠源抗体的重链可变区和人免疫球蛋白 IgG1 的 重链恒定区组成的嵌合重链， 所述的嵌合重链含有 SEQ NO2 列出的氨基酸序列， SEQ NO2 氨 基酸序列如下 ： SEQ NO2ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ NO1 和 SEQ NO2 序列中， 下划双横线部分为前导肽序列， 下划波浪线部分为可 变区序列， 未划线部分为恒定区序列。
所述的嵌合轻链含有 SEQ NO1 列出的氨基酸序列。编码 SEQ NO1 氨基酸序列的 DNA 如下 ： SEQ NO1 DNA
C CATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGT GTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGA GAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGG GAGAGTGT
所述的嵌合重链含有 SEQ NO2 列出的氨基酸序列。编码 SEQ NO2 氨基酸序列的 DNA 如下 ： SEQ NO2DNAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCC CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCG TGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGC TTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCC CCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAA GACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCA GTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGT GCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCA CAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCT TCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTG CTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCT TCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA上述所列的 SEQ NO1DNA 和 SEQ NO2DNA 序列中， 其中下划双横线部分为前导肽序 列， 下划波浪线部分为可变区序列， 方框内为终止序列， 未划线部分为恒定区序列。
本发明应用一套设计的引物从自主构建并培养的抗人 VEGFR-2 鼠单克隆抗体 mAb 杂交瘤细胞株克隆出了抗人 VEGFR-2 抗体的轻链、 重链可变区基因 VL 和 VH， 用生物软件 BLAST 分析表明 VL 和 VH 的保守区与数据库中相应的基因高度一致， 证实本发明人通过 PCR 技术从能分泌 mAb 的杂交瘤细胞株中正确克隆出了抗人 VEGFR-2 抗体的轻链、 重链可变区 基因。本发明又应用一套设计的引物从志愿者外周淋巴细胞中提取人 IgG1 的轻链 CL 和重 链 CH 基因， 用生物软件 BLAST 分析表明 CL 和 CH 保守区与数据库中相应的基因高度一致， 证实本发明人通过 PCR 技术从志愿者外周淋巴细胞中正确克隆出了人 IgG1 的轻链 CL 和重 链 CH 基因。本发明再应用一套设计的引物将鼠 VL 和 VH 分别与人 IgG1 的 CL 和 CH 嵌合重 组， 将嵌合后的抗体轻链和重链连接到真核细胞内部核糖体插入位点 (IRES) 的前后， 再连 接到 CMV 启动子和 SV40Poly A 之间， 最终构建成逆转录病毒重组载体， 转染 CHO 细胞， 筛选 并制备抗 VEGFR-2 嵌合 IgG 抗体。实验所用的抗 VEGFR-2 抗体杂交瘤细胞株 D3-D3 已于 2010 年 8 月 5 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC C201076。
包含 SEQ NO1 和 SEQ NO2 序列的 DNA 表达载体， 如 pIRES、 pMSCV 或基因工程常用 的其他表达载体。
所述的 DNA 载体转化的宿主细胞， 如 CHO 细胞或基因工程常用的其他表达细胞。
本发明的目的之二在于提供一种构建和表达嵌合抗体的方法。
将嵌合后的抗体轻链和重链连接到真核细胞内部核糖体插入位点 IRES 的前后， 再连接到 CMV 启动子和 SV40Poly A 之间， 构建形式是 CMV 启动子 - 嵌合轻链 -IRES- 嵌 合重链 -SV40PolyA， 最终构建成表达载体 pIRES-antiVEGFR2-IgG 和逆转录病毒表达载体 pMSCV-antiVEGFR2-IgG， 所述的 pIRES-antiVEGFR2-IgG 上有固定的 IgG1 恒定区基因和相 应酶切位点， 可以通过置换不同的抗体可变区基因， 构建针对不同抗原的的动物 - 人嵌合 抗体。
为了实现嵌合抗体在真核细胞中的稳定地高表达， 本发明采用了 CHO 细胞和携带 新霉素 neo 基因的逆转录病毒载体表达系统， 该系统的优点是 ： 嵌合抗体连同新霉素 neo 基 因一起经逆转录病毒载体转染整合到 CHO 细胞染色体上， 只有转染并整合上了 neo 基因才 能存活， 可方便的用新霉素筛选出稳定高表达外源基因的阳性细胞克隆。
本发明目的之三在于提供一种抗人血管内皮生长因子受体 2 的重组嵌合抗体的 制备方法， 包括以下步骤 ： 培养如前所述的宿主细胞， 回收所表达的抗体。
利用 5’ RACE 反转录技术和聚合酶链反应， 从分泌抗人血管内皮生长因子受体 2 抗体的鼠杂交瘤细胞中分别扩增抗体的轻链和重链可变区基因， 再提取人免疫球蛋白 IgG1 的轻链和重链恒定区的基因， 利用重叠聚合酶链反应 Overlap 技术将鼠轻链和重链可变区 基因分别与人 IgG1 的轻链和重链恒定区的基因嵌合重组， 将嵌合后抗体的轻链和重链连 接到真核细胞内部核糖体插入位点 IRES 的前后， 再连接到巨细胞病毒启动子 PCMV 和腺病 毒聚合腺苷酸 SV40Poly A 之间， 最终构建成逆转录病毒重组载体 pMSCV-antiVEGFR2-IgG， 转染中国仓鼠卵巢癌细胞 CHO， 筛选并制备抗人血管内皮生长因子受体 2 的重组嵌合 IgG 抗 体， 所述分泌抗人血管内皮生长因子受体 2 抗体的鼠杂交瘤细胞株 D3-D3 已被已于 2010 年 8 月 5 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC C201076。
将含有正确重组逆转录病毒 pMSCV-antiVEGFR2-IgG 质粒脂质体转染 GP2-293 细 胞， 37℃吸附 6h， 加入 α-MEM 培养基， 培养 24h 时取上清， 用终浓度为 0.45M 的 NaCl 和 8％ 的 PEG60004℃过夜沉淀， 获得具有感染力的重组逆转录病毒 pMSCV-antiVEGFR2-IgG。
将重组逆转录病毒 pMSCV-antiVEGFR2-IgG 感染经过表达压力筛选的 CHO 细胞， 无 血清培养， 37℃培养上清中含分泌的抗人 VEGFR2 人鼠嵌合 IgG 抗体， 收集培养上清， 以2～ 10ml/min 的速度过 SPA 亲和层析柱， 然后用 5mol/L 盐酸胍洗脱， 再用 0.001mol/mL 的 PBS 透析后备用。 本发明目的之四在于提供含如前所述的重组嵌合抗体为活性成分的药物组合药 物， 该组合物含有所述的重组嵌合抗体和药物学上可接受的载体。
所述嵌合抗体用于制备抑制或中和人血管内皮生长因子受体 2 活性的药物 ； 所述 嵌合抗体用于制备诊断性试剂和肿瘤血管抑制治疗的抗体靶向药物治疗中的应用。
本发明构建了嵌合 IgG 抗体的真核表达质粒并进行可溶性表达， 建立了表达蛋白 的纯化方法， 获得了高纯度的可溶性蛋白， 该蛋白保持了鼠源性抗 VEGFR-2 抗体具备的抗 体性质和特异性， 在用于血管相关疾病 ( 包括一些高表达 VEGFR-2 的肿瘤 ) 的靶向诊疗药 物中具有潜在的应用前景。
本发明与现有技术相比具有的优点 ：
随着现代生物技术的迅猛发展， 运用功能基因组学、 蛋白质组学、 生物信息学等现 代生化与分子生物学技术， 结合基因工程、 蛋白质工程、 细胞工程等技术， 使得生物技术药 物研发进入飞跃发展的时代。 治疗性抗体是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体 工程技术制备的药物， 以其特异性强、 安全有效而成为当前生物技术药物研发的热点。 制备 的抗 VEGFR-2 人鼠嵌合 IgG 抗体， 抗体骨架使用人 IgG， 抗原结合位点使用小鼠抗 VEGFR-2 的 VL 和 VH， 构建成的嵌合全抗体结构， 并应用真核系统表达， 使抗体构象接近于天然 ； 通过 试验表明保留了鼠源性抗 VEGFR-2 抗体的抗原性质和特异性， 但较天然抗体具有更强的特 异性和较长的半衰期， 用于血管相关疾病， 特别是高表达 VEGFR-2 的肿瘤研究， 可用于制备 抗 VEGFR-2 的诊断性试剂、 治疗性药物。
使用基因重组技术对该鼠源单克隆抗体进行改造制备嵌合 IgG 抗体， 制备的抗体 片段有以下优点 ：
(1) 大大降低了抗 VEGFR-2 抗体的鼠源性成分， 有利于进一步开展体内试验。
(2) 保留了鼠源性抗体具备的抗体性质和特异性， 可潜在用于血管相关疾病 ( 包 括一些高表达 VEGFR-2 的肿瘤 ) 的靶向诊疗。
(3) 真核表达嵌合全抗体更接近天然结构， 使活性更强， 半衰期更长， 可大量表达， 便于纯化， 作为治疗性抗体的。 附图说明 图1 ： 抗 VEGFR-2 杂交瘤单克隆抗体细胞总 RNA 电泳实验结果 ： 显示 RNA 抽提较好， 没有发生降解。
图2： 提纯后单克隆抗 VEGFR-2 抗体轻链可变区 (mVL) 及重链可变区 (mVH)( 含 部分恒定区 )PCR 扩增产物电泳实验结果 ： M： 核酸标准分子量 (Takara DL2000) ； mVL 约 750bp( 含部分恒定区 ) ； mVH 约 750bp( 含部分恒定区 )。
图3： 以健康人淋巴细胞 RNA 为模板扩增的人 IgG1 的轻链恒定区 (hIgG1CLκ) 及 重 链 恒 定 区 (hIgG1CH) 片 段 电 泳 实 验 结 果 ： M： 核 酸 标 准 分 子 量 (Takara DL2000) ； hIgG1CLκ 约 350bp ； hIgG1CH 约 1000bp ； 图 3a ： 轻链恒定区 (hIgG1CLκ) ； 图 3b ： 重链恒定 区 (hIgG1CH)。
图4 ： 嵌合轻链和重链扩增产物 1％琼脂糖凝胶电泳实验结果 ： M： 核酸标准分子量 (TakaraDL2000) ； 图 4a ： 轻链可变区 (mVL) 约 350bp， 轻链恒定区 (CLκ) 约 350bp， 嵌合后 轻链 (LL) 约 350bp ； 图 4b ： 重链可变区 (mVH) 约 350bp， 重链恒定区 (hIgG1CH) 约 1000bp， 嵌合后重链 (HH) 约 1500bp。
图5： 嵌 合 IgG 扩 增 产 物 的 核 酸 电 泳 实 验 结 果 ： M1 ： 核 酸 标 准 分 子 量 (Takara DL5000) ； M2 ： 核酸标准分子量 (Takara DL15000) ； 1 为约 4000bp 的含 IRES 的 IgG 基因片 段。
图6： Western-bloting 检测抗人 VEGFR-2 嵌合抗体性质和分子量实验结果 ： 1为 50μg/ml 的抗人 VEGFR-2 嵌合抗体， 2 为 25μg/ml 的抗人 VEGFR-2 嵌合抗体， 图 6a 为 HRP 标记羊抗人 IgG 抗体检测结果， 图 6b 为 HRP 标记羊抗鼠 Fab 抗体检测结果。
图7： 在 HUVEC 和 AML 细胞上进行免疫组化实验结果 ： 其中以不加一抗而只加二抗 作为阴性对照， 图 7a、 图 7b 为 HUVEC 和 AML 细胞的阴性对照 ； 图 7c、 图 7d 分别为抗人 VEGFR2 嵌合抗体与 HUVEC 和 AML 细胞的结合图。
图8： 在 HUVEC 和 AML 细胞上进行竞争抑制免疫组化实验结果 ： 其中以只加重组人 VEGF 为阴性对照， 以抗人 VEGFR2 嵌合抗体作为竞争抑制抗体， 图 8a、 图 8b 为 HUVEC 和 AML 细胞的阴性对照 ； 图 8c、 图 8d 为抗人 VEGFR2 嵌合抗体与人 VEGF 在 HUVEC 和 AML 细胞上的 竞争结合图。
图9： 以商品化重组人 VEGFR-2 蛋白为抗原， 抗人 VEGFR2 嵌合抗体为一抗的间接 法 ELISA 实验结果 ： 其中 a、 b 为人 VEGFR2 嵌合抗体样品， posi 为阳性对照， neg 为阴性对 照。
图 10 ： 以商品化重组人 VEGFR-2 蛋白为抗原， 抗人 VEGFR2 嵌合抗体与 VEGF 竞争 抑制的 ELISA 实验结果 ： Posi 为阳性对照， Neg 为阴性对照。其中 a、 b 为抗 VEGFR-2 嵌合 抗体样品， 1/2a、 1/2b 为 1/2 浓度的抗人 VEGFR2 嵌合抗体样品， posi 阳性对照， neg 为阴性 对照。
具体实施方式
本发明所述的抗人血管内皮生长因子受体 2 的重组嵌合抗体的制备方法， 该抗体 片段是利用基因工程技术制备， 具体步骤如下 ：
( 一 ) 鼠抗体可变区基因片段的扩增及序列分析
鼠源性抗 VEGFR-2 抗体杂交瘤细胞 D3/D5 培养至对数生长期， Trizol- 氯仿 - 异 TM 丙醇法抽提细胞总 RNA ； 使用 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit， 其中小鼠轻链可变 区、 重链可变区的 GSPs(gene-specific primers) 分别为 ：
mCLκB ： 5-ACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGG，
mIgMCH1 ： 5-ACATGCAGATCTCTGTTTTTGCCTCCGTAGTGG， 以 总 RNA 中 的 mRNA 为 模 板， 5’ RACE 逆转录扩增获得含轻链可变区、 重链可变区的 DNA 片断 ； 逆转录条件为 42℃ 90 秒 ； 70℃ 10 分钟 ； PCR 使用 KOD plus taq Polyerase 体系， 扩增条件均为 95℃ 2 分钟 ； 95℃ 20 秒， 56℃ 10 秒， 70℃ 1 分钟， 30 个循环 ； 70℃延伸 5 分钟， 琼脂糖凝胶电泳， 均扩增出约 750bp 的条带， 胶回收纯化扩增目的条带， 加 “A” 尾， 然后 TA 克隆到 pMD19T-Simple(TakaRa) 载体， 将连接产物转化 XL1-Blue 感受态菌， 涂布含 100μg/ml 氨苄青霉素的 LB 平板， 置 37℃ 15h ； 随机挑取单个菌落共 10 个过夜摇菌， 然后提取质粒， 送上海生工测序， 测序结果经 DNAStar 软件分析显示 ： VL 克隆除有 1 个发生突变外， 其他 VL 序列相同， VH 克隆除有 3 个发生突变 外， 其他 VH 序列也相同， 相同的序列被确定为目的序列， 如下 ：
轻链可变区 VL 包括部分恒定区 ： 336bp
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAG TCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAAC TGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC ACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCAAGCAATCTTATAATCTGTGGACGTT CGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCA...
重链可变区 (VH)( 包括部分恒定区 ) ： 366bp
TAACT GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGAGAAGCCTGGCGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGG TTACTCATTCACTGGCTACAACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCAATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTG ATCCTTACTATGGTGGTACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGC ACAGCCTACATGCAGCTCAAGAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCTGGGTATGGTTA CGGGGAGGGTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGAGAGTC
将序列输入 BLAST 对比分析， 确定下划双横线标记序列为前导序列 ： 轻链为 60bp， 重链为 336bp， 下单横线标记的序列为抗体可变区序列 ： 轻链为 60bp， 重链为 366bp。
( 二 ) 人 IgG 抗体恒定区基因片段的扩增及序列分析
提取健康志愿者外周血淋巴细胞中的 RNA， RT-PCR 获得 cDNA， 以 cDNA 为模板， PCR 使用 KOD plus polyerase 体系， 分别扩增人 IgG 抗体的 CLκ 和 CH 链核苷酸片段 ；CLκ 段 的 上 游 引 物 为 hCLκF ： 5-TTCTAGACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTT， 下游引物为 hCLκB ： 5-TACGCGTTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACG ； 其 中 CLκ 段 的 上 游 引 物 引入 XbaI 内切酶位点， CLκ 段的下游引物引入 MluI 内切酶位点， CH 的上游引物为 hCHF ： 5-AGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC， 下游引物为 hCHB ： 5-TGCGGCCGCCTATCATTTACCCGGAGA CAGGGAGAGGCTCTTC ； CH 上游引物引入 SalI 内切酶位点， CH 下游引物引入 NotI 内切酶位点， 扩增条件均为 95℃ 2 分钟 ； 95℃ 20 秒， 56℃ 10 秒， 70℃ 1 分钟， 30 个循环 ； 70℃延伸 5 分 钟， 1％琼脂糖凝胶电泳， 扩增出 CLκ 约 750bp 和 CH 约 1000bp 的条带， 胶回收纯化扩增目 的条带， 加 “A” 尾， 然后 TA 克隆到 pMD19T-Simple(TaKaRa) 载体， 将连接产物转化 XL1-Blue 感受态菌， 涂布含 100μg/ml 氨苄青霉素的 LB 平板， 置 37℃ 15h ； 随机挑取单个菌落 5 个过 夜摇菌， 然后提取质粒， 送上海生工测序， 测序结果与 pubmed 上序列比对， 经 DNA Star 软件 分析显示 ： CLκ 各克隆除均有点突变， 其中一个编号为 CLκ#2 克隆的氨基酸序列与参考序 列完全相同， CH 各克隆除有均有点突变， 其中一个编号为 CH#5 克隆的氨基酸序列与 IgG1 参 考序列 95％以上相同。相同的序列被确定为目的序列， 如下 ( 下横线标记的序列为抗体内 切酶位点 ) ：
轻链恒定区核苷酸序列为 ： 327bp TCTAGACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGA ACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCT CCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGA CGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTC
ACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
ACGCGT......轻链恒定区氨基酸序列为 ： 107aa
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重链恒定区核苷酸序列 ： 996bp
GCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCG GCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCA GCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCC AAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTT CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACG AAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG CAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAG GCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCC CGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAA A CGGCCGC......重链恒定区核苷酸序列为 ： 330aa
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
( 三 ) 轻链及重链的嵌合
1、 轻链的嵌合 ：
根据 pIRES 载体特性及 Overlap PCR 原理设计带内酶切位点轻链嵌合扩增引物， 如下 ：
LL1 ： 5-AAGCTAGCATGGATTCACAGGCCCAGGTTCLL2 ： 5-CAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTC LL3 ： 5-GAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTG LL4 ： 5-TCGACGCGTCCTGCAGG ACACTCTCCCCTGTTGAAGC其中引物 LL1、 LL2 扩增 VL 片段， 引物 LL3、 LL4 扩增 CLκ 片段， 在引物 LL1 的 5′ 端引入内切酶位点 NheI 即下划线部分序列及真核表达用的 Kozak 序列即方框部分序列， 在 引物 LL4 的 5′端引入了内切酶位点 MluI 和 SbfI 即下划线部分序列及真核表达用的终止 序列即方框部分序列， 引物 LL3 和 LL4 中用下划线标记的为 VL 尾部序列， 未用下划线未标 记的为 CLκ 的首端序列， 以利于鼠源性抗 VEGFR-2 抗体的 VL 与人 IgG 的 CLκ 片段的重叠 PCR 扩增 ； 扩增的步骤 ： PCR 使用 KOD plus polyerase 体系， 以 VL 序列为模板， 用引物 LL1、 LL2 扩增， 得到产物 A。以 CLκ 序列为模板， 用引物 LL3、 LL4 扩增， 得到产物 B。琼脂糖凝 胶电泳， 产物 A、 B 均为约 350bp 的条带。将产物 A、 B 各取等量混合， 再稀释 10 倍， 以此为模 板， 用引物 LL1、 LL4 进扩增， 得到产物 C， 琼脂糖凝胶电泳， 产物 C 为约 700bp 的条带， 产物 C 即所需嵌合抗体的轻链 (CLκ) 基因。后续 TA 克隆及质粒提取等处理同上面， 序列分析嵌 合抗体轻链 (CLκ) 基因序列与设计完全相符。测序所得序列如下 ：
嵌合抗体轻链核苷酸序列为 ： (663bp， 序列中下划双横线部分的为引导序列， 下划 单横线部分为内切酶位点， 划波浪线部分为可变区序列， 方框内部分为终止序列， 未划线部 分为恒定区序列 )
GCTAGCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCC TGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAG GAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTA11102093479 A CN 102093485说CCTGCAGGACGCGT明书9/11 页CGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGG GAGAGTGT
2、 重链的嵌合 ： 根据 pIRES 载体特性及 Overlap PCR 原理设计带内酶切位点轻链嵌合扩增引物， HH1 ： 5-ATCTAGA ATGGGATGGACCTGGATC如下 ：
HH2 ： 5-GATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTG HH3 ： 5-CACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATC HH4 ： 5-TGCGGCCGC TTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTC其中引物 HH 1、 HH 2 扩增 VH 片段， 引物 HH 3、 HH 4 扩增 CH 片段， 在引物 HH 1 的 5′端引入了内切酶位点 XbaI 即下划线部分序列及真核表达用的 Kozak 序列即方框部分序 列， 在引物 HH 4 的 5′端引入了内切酶位点 Not 即下划线部分序列及真核表达用的终止序 列即方框部分序列， 引物 HH 3 和 HH 4 中用下划线标记的为 VH 尾部序列， 未用下划线标记 的为 CH 的首端序列， 以利于鼠源性抗 VEGFR-2 抗体的 VH 与人 IgG 的 CH 片段的重叠 PCR 扩 增； 扩增的步骤 ： PCR 使用 KOD plus polyerase 体系， 以 VH 序列为模板， 用引物 HH 1、 HH 2 扩增， 得到产物 E。以 CH 序列为模板， 用引物 HH 3、 HH 4 扩增， 得到产物 F。琼脂糖凝胶电 泳， 产物 E 为约 350bp 的条带、 F 为约 1000bp 的条带。将产物 E、 F 各取等量混合， 再稀释 10 倍， 以此为模板， 用引物 HH 1、 HH4 进扩增， 得到产物 G， 琼脂糖凝胶电泳， 产物 G 为约 1500bp 的条带， 产物 G 即所需嵌合抗体的重链 (CH) 基因。后续 TA 克隆及质粒提取等处理方法同 步骤 (1)， 序列分析嵌合抗体轻链 (CH) 基因序列与设计完全相符。测序所得序列如下 ： 嵌 合抗体重链核苷酸序列为 ： (1362bp， 序列中下划双横线部分的为引导序列， 下划单横线部 分为内切酶位点， 划波浪线部分为可变区序列， 方框内部分为终止序列， 未划线部分为恒定 区序列 )
TCTAGAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCT CTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC GCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGAC CGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACA AGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCG TCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGT GGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAAT GGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGG GCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAG ACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCA GCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC TCCGGGTAAA
CGGCCGC( 四 ) 嵌合 IgG1 逆转录病毒载体的构建和鉴定
1、 pIRES-IgG 重组载体的构建
用内切酶 NheI 和 MluI 从嵌合轻链 (CLκ) 基因序列 T 载体获得并连接至质粒 pIRES 多克隆位点 A 处， 用内切酶 XhoI 和 NotI 从嵌合重链 (CH) 基因序列 T 载体获得并连接 至质粒 pIRES 多克隆位点 B 处。此时， 轻链和重链置于同一启动子 CMV 启动子的控制之下， 轻链基因后接一核糖体进入位点序列 (IRES)， 其后是重链基因， 转录出来的双顺反子 mRNA 可因 IRES 的存在同时翻译轻、 重链。
2、 pMSCV-antiVEGFR2-IgG 逆转录病毒载体构建
PCR 法将获取重组 pIRES-IgG 载体上从 CMV 启动子至 SV40PolyA 片段， 所用 PCR 引 物 为： IRES1 ： 5-GACGAATTCTCAATATTGGCCATTAGCCATATTA， IRES2 ： 5-CTTCTCGAGTTTTAC CACATTTGTAGAGGTTTTAC， 并 通 过 XhoI 和 EcoRI 连 接 至 pMSCV 载 体 多 克 隆 位 点 处， 获得 pMSCV-antiVEGFR2-IgG 重组载体。经过测序鉴定确定无突变。
( 五 ) 表达嵌合 IgG 抗体细胞的筛选鉴定及表达蛋白的纯化
1、 逆转录病毒的包装
将含有正确重组逆转录病毒 pMSCV-antiVEGFR2-IgG 质粒脂质体转染 GP2-293 细 胞， 培养 24 个孔， 置 37℃ 6h 后， 加入 α-MEM 培养基， 培养 24h 时， 取上清用终浓度为 0.45M 的 NaCl 和 8％的 PEG60004℃过夜沉淀， 然后 4℃ 10000rpm 离心 30min， 取沉淀并且提取转 染细胞的总 RNA， 用轻链和重链引物 PCR 检测转染效率。
将细胞沉淀收获， 超声破碎后， 连同培养上清沉淀冻存于 -80℃。
2、 抗人 VEGFR-2 嵌合抗体在 CHO 细胞的表达
将冻存于 -80℃的 pMSCV-antiVEGFR2-IgG， 100CCID50/ml37℃吸附于 CHO 细胞 1h， 然后加入无血清培养基， 37℃、 5％ CO2 培养， 于 2-6 天取上清进行检测， 用 ELISA 法和免疫 组化进行检测。 3、 抗人 VEGFR2 嵌合抗体纯化
将无血清培养 CHO 的培养上清收集， 以 2 ～ 10ml/min 的速度过 SPA 亲和层析柱， 然后用 5mol/L 盐酸胍洗脱， 再用 0.001mol/mLPBS 透析后备用。
( 六 ) 抗人 VEGFR2 嵌合抗体的功能鉴定
1、 Western-bloting 检测抗人 VEGFR-2 嵌合抗体特性和分子量
将真核表达的 50μg/ml 的抗人 VEGFR-2 嵌合抗体和 25μg/ml 的抗人 VEGFR-2 嵌 合抗体进行 4-10％ SDS-PAGE 电泳并电转到硝酸纤维素膜上， 分别与 HRP 标记羊抗人 IgG 抗 体和 HRP 标记羊抗鼠 Fab 抗体 4℃孵育过夜， DAB 显色， 在 150kDa 处与 HRP 标记羊抗人 IgG 抗体和 HRP 标记羊抗鼠 Fab 抗体均有条带显示， 与理论相符， 说明含有目的抗体鼠的可变区
和人的恒定区。
2、 间接 ELISA 法检测抗人 VEGFR-2 嵌合抗体亲和力
用含 0.1M 碳酸盐缓冲液， pH9.6 的包被液稀释重组人 VEGFR-2 蛋白， 以 1μg/ml 的 浓度包被 96 孔 ELISA 板， 每孔加入 100μl， 4℃过夜 ； PBST 洗涤 5 次后， 用含 3％ BSA 的 PBS 缓冲液封闭， 37℃孵育 2h ； PBST 洗涤 5 次， 每次 3min ； 两个孔中加入 100μl 抗人 VEGFR-2 嵌合抗体， 37℃ 2h， PBST 洗涤 5 次， 每次 3min， 再用 1 ∶ 5000 稀释的 HRP 标记羊抗人 IgG 抗 体 100μl/ 孔， 37℃孵育 1h ； PBST 洗涤 5 次， 每次 3min， TMB 显色液 100μl/ 孔， 室温下 15 分钟后用 2M 硫酸中止反应， 检测采用双波长 450nm/630nm， 结果嵌合抗人 VEGFR-2 嵌合抗体 能与重组人 VEGFR-2 蛋白起抗原抗体 ELISA 反应。
3、 VEGF 与 VEGFR2 竞争抑制 ELISA
用含 0.1M 碳酸盐缓冲液， pH9.6 的包被液稀释重组人 VEGFR-2 蛋白， 以 1μg/ml 的浓度包被 96 孔 ELISA 板， 每孔加入 100μl， 4℃过夜 ； PEST 洗涤 5 次后， 用含 3％ BSA 的 PBS 缓冲液封闭， 37℃孵育 2h ； PBST 洗涤 5 次后， 每个孔中加入 100ng/50μl 抗 VEGFR-2 嵌 合 IgG 抗体 +100ng/50μl 重组人 VEGF， 37℃孵育 2h ； PBST 洗涤 5 次后， 加入 100ng/100μl 羊抗人 VEGF 抗体 37 ℃孵育 1h ； PBST 洗涤 5 次， 每次 3min， 再加入 1 ∶ 5000 稀释的 HRP 标 记 鼠 抗 羊 IgG 抗 体 100μl/ 孔， 37 ℃ 孵 育 1h ； PBST 洗 涤 5 次， 每 次 3min， TMB 显 色 液 100μl/ 孔， 室温下 15 分钟后用 2M 硫酸中止反应， 检测采用双波长 450nm/630nm， 实验中用 VEGF100ng/50μl+0.002M PBS/50μl/ 孔做阳性对照， 0.002M PBS/10μl/ 孔做阴性对照， 结果显示抗人 VEGFR-2 嵌合抗体能与重组人 VEGF 蛋白竞争结合于已包被于 96 孔板的重组 人 VEGFR-2 蛋白。
4、 免疫组化
用一定浓度的 HUVEC 和 AML 细胞制片， 吹干后用 4％的甲醛固定 10min， 然后滴加 100ng/10μl 抗 VEGFR-2 嵌合 IgG 抗体 ( 稀释液为 1％ BSA 的 PBS)， 1％ BSA 的 PBS 作阴性 对照 4℃孵育过夜， 然后用 PBST 洗 5 次， 滴加 HRP 标记鼠抗人 IgG 抗体， 室温孵育 2h， 于显 微镜下观察， 结果显示抗人 VEGFR-2 嵌合抗体能与 HUVEC 细胞上的 VEGFR2 结合。
5、 和竞争抑制免疫组化
背景技术 近几年免疫靶向疗法在临床诊疗中显示出较好的前景， 血管生成和血管相关疾病 ( 包括肿瘤 ) 主要依靠血管生长因子 (VEGF) 和血管生长抑制因子的调控， 其中最密切的是 血管内皮生长因子及其受体 (VEGFR)， 特别是血管内皮生长因子及其受体 2(VEGFR-2)。若 有理想的靶向药物识别 VEGR/VEGFR 通道， 则可起到诊疗疾病的作用。
由于抗体的高度特异性， 利用抗体将药物导向靶点细胞是一种理想的途径， 当前 单克隆抗体药物或抗体偶联药物已成为制药行业中增长最快、 获利最大的市场之一。
以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术在制备治疗性抗体药物 是今年来的研究热点， 其在感染、 心血管疾病、 自身免疫性疾病、 肿瘤治疗中有巨大的潜力 与应用前景。 抗体药物作用靶点的选择性、 抗体药物的人源化、 小型化和高效化也是今后的 研究重点。
由于抗体的高度特异性， 利用抗体将药物导向靶点细胞是一种理想的途径， 当前 单克隆抗体药物或抗体偶联药物已成为制药行业中增长最快、 获利最大的市场之一。
以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术在制备治疗性抗体药物 是今年来的研究热点， 其在感染、 心血管疾病、 自身免疫性疾病、 肿瘤治疗中有巨大的潜力 与应用前景。 抗体药物作用靶点的选择性、 抗体药物的人源化、 小型化和高效化也是今后的 研究重点。
由于鼠源单克隆抗体的临床应用的产生人抗鼠抗体反应 (HAMA) 和过敏反应， 减 低了药物的疗效， 因而运用基因工程技术将鼠源抗体进行改造， 降低 HAMA 反应， 同时仍然 保留了抗体的特异性和亲和力， 利用真核表达系统进行表达 IgG 全抗体， 使目标抗体结构 更接近天然， 更具有使用价值。发明内容
本发明的目的之一在于提供一种抗人血管内皮生长因子受体 2 的重组嵌合抗体 及其编码基因。
本发明所述的一种抗人血管内皮生长因子受体 2 的重组嵌合抗体， 包含 ：
(1) 抗人血管内皮生长因子受体 2 鼠源抗体的轻链可变区和人免疫球蛋白 IgG 的 κ 轻链恒定区组成的嵌合轻链， 所述的嵌合轻链含有 SEQ NO1 所示的氨基酸序列， SEQ NO1 氨基酸序列如下 ： SEQ NO1
PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
以及
(2) 抗人血管内皮生长因子受体 2 鼠源抗体的重链可变区和人免疫球蛋白 IgG1 的 重链恒定区组成的嵌合重链， 所述的嵌合重链含有 SEQ NO2 列出的氨基酸序列， SEQ NO2 氨 基酸序列如下 ： SEQ NO2ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ NO1 和 SEQ NO2 序列中， 下划双横线部分为前导肽序列， 下划波浪线部分为可 变区序列， 未划线部分为恒定区序列。
所述的嵌合轻链含有 SEQ NO1 列出的氨基酸序列。编码 SEQ NO1 氨基酸序列的 DNA 如下 ： SEQ NO1 DNA
C CATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGT GTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGA GAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGG GAGAGTGT
所述的嵌合重链含有 SEQ NO2 列出的氨基酸序列。编码 SEQ NO2 氨基酸序列的 DNA 如下 ： SEQ NO2DNAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCC CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCG TGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGC TTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCC CCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAA GACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCA GTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGT GCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCA CAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCT TCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTG CTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCT TCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA上述所列的 SEQ NO1DNA 和 SEQ NO2DNA 序列中， 其中下划双横线部分为前导肽序 列， 下划波浪线部分为可变区序列， 方框内为终止序列， 未划线部分为恒定区序列。
本发明应用一套设计的引物从自主构建并培养的抗人 VEGFR-2 鼠单克隆抗体 mAb 杂交瘤细胞株克隆出了抗人 VEGFR-2 抗体的轻链、 重链可变区基因 VL 和 VH， 用生物软件 BLAST 分析表明 VL 和 VH 的保守区与数据库中相应的基因高度一致， 证实本发明人通过 PCR 技术从能分泌 mAb 的杂交瘤细胞株中正确克隆出了抗人 VEGFR-2 抗体的轻链、 重链可变区 基因。本发明又应用一套设计的引物从志愿者外周淋巴细胞中提取人 IgG1 的轻链 CL 和重 链 CH 基因， 用生物软件 BLAST 分析表明 CL 和 CH 保守区与数据库中相应的基因高度一致， 证实本发明人通过 PCR 技术从志愿者外周淋巴细胞中正确克隆出了人 IgG1 的轻链 CL 和重 链 CH 基因。本发明再应用一套设计的引物将鼠 VL 和 VH 分别与人 IgG1 的 CL 和 CH 嵌合重 组， 将嵌合后的抗体轻链和重链连接到真核细胞内部核糖体插入位点 (IRES) 的前后， 再连 接到 CMV 启动子和 SV40Poly A 之间， 最终构建成逆转录病毒重组载体， 转染 CHO 细胞， 筛选 并制备抗 VEGFR-2 嵌合 IgG 抗体。实验所用的抗 VEGFR-2 抗体杂交瘤细胞株 D3-D3 已于 2010 年 8 月 5 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC C201076。
包含 SEQ NO1 和 SEQ NO2 序列的 DNA 表达载体， 如 pIRES、 pMSCV 或基因工程常用 的其他表达载体。
所述的 DNA 载体转化的宿主细胞， 如 CHO 细胞或基因工程常用的其他表达细胞。
本发明的目的之二在于提供一种构建和表达嵌合抗体的方法。
将嵌合后的抗体轻链和重链连接到真核细胞内部核糖体插入位点 IRES 的前后， 再连接到 CMV 启动子和 SV40Poly A 之间， 构建形式是 CMV 启动子 - 嵌合轻链 -IRES- 嵌 合重链 -SV40PolyA， 最终构建成表达载体 pIRES-antiVEGFR2-IgG 和逆转录病毒表达载体 pMSCV-antiVEGFR2-IgG， 所述的 pIRES-antiVEGFR2-IgG 上有固定的 IgG1 恒定区基因和相 应酶切位点， 可以通过置换不同的抗体可变区基因， 构建针对不同抗原的的动物 - 人嵌合 抗体。
为了实现嵌合抗体在真核细胞中的稳定地高表达， 本发明采用了 CHO 细胞和携带 新霉素 neo 基因的逆转录病毒载体表达系统， 该系统的优点是 ： 嵌合抗体连同新霉素 neo 基 因一起经逆转录病毒载体转染整合到 CHO 细胞染色体上， 只有转染并整合上了 neo 基因才 能存活， 可方便的用新霉素筛选出稳定高表达外源基因的阳性细胞克隆。
本发明目的之三在于提供一种抗人血管内皮生长因子受体 2 的重组嵌合抗体的 制备方法， 包括以下步骤 ： 培养如前所述的宿主细胞， 回收所表达的抗体。
利用 5’ RACE 反转录技术和聚合酶链反应， 从分泌抗人血管内皮生长因子受体 2 抗体的鼠杂交瘤细胞中分别扩增抗体的轻链和重链可变区基因， 再提取人免疫球蛋白 IgG1 的轻链和重链恒定区的基因， 利用重叠聚合酶链反应 Overlap 技术将鼠轻链和重链可变区 基因分别与人 IgG1 的轻链和重链恒定区的基因嵌合重组， 将嵌合后抗体的轻链和重链连 接到真核细胞内部核糖体插入位点 IRES 的前后， 再连接到巨细胞病毒启动子 PCMV 和腺病 毒聚合腺苷酸 SV40Poly A 之间， 最终构建成逆转录病毒重组载体 pMSCV-antiVEGFR2-IgG， 转染中国仓鼠卵巢癌细胞 CHO， 筛选并制备抗人血管内皮生长因子受体 2 的重组嵌合 IgG 抗 体， 所述分泌抗人血管内皮生长因子受体 2 抗体的鼠杂交瘤细胞株 D3-D3 已被已于 2010 年 8 月 5 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC C201076。
将含有正确重组逆转录病毒 pMSCV-antiVEGFR2-IgG 质粒脂质体转染 GP2-293 细 胞， 37℃吸附 6h， 加入 α-MEM 培养基， 培养 24h 时取上清， 用终浓度为 0.45M 的 NaCl 和 8％ 的 PEG60004℃过夜沉淀， 获得具有感染力的重组逆转录病毒 pMSCV-antiVEGFR2-IgG。
将重组逆转录病毒 pMSCV-antiVEGFR2-IgG 感染经过表达压力筛选的 CHO 细胞， 无 血清培养， 37℃培养上清中含分泌的抗人 VEGFR2 人鼠嵌合 IgG 抗体， 收集培养上清， 以2～ 10ml/min 的速度过 SPA 亲和层析柱， 然后用 5mol/L 盐酸胍洗脱， 再用 0.001mol/mL 的 PBS 透析后备用。 本发明目的之四在于提供含如前所述的重组嵌合抗体为活性成分的药物组合药 物， 该组合物含有所述的重组嵌合抗体和药物学上可接受的载体。
所述嵌合抗体用于制备抑制或中和人血管内皮生长因子受体 2 活性的药物 ； 所述 嵌合抗体用于制备诊断性试剂和肿瘤血管抑制治疗的抗体靶向药物治疗中的应用。
本发明构建了嵌合 IgG 抗体的真核表达质粒并进行可溶性表达， 建立了表达蛋白 的纯化方法， 获得了高纯度的可溶性蛋白， 该蛋白保持了鼠源性抗 VEGFR-2 抗体具备的抗 体性质和特异性， 在用于血管相关疾病 ( 包括一些高表达 VEGFR-2 的肿瘤 ) 的靶向诊疗药 物中具有潜在的应用前景。
本发明与现有技术相比具有的优点 ：
随着现代生物技术的迅猛发展， 运用功能基因组学、 蛋白质组学、 生物信息学等现 代生化与分子生物学技术， 结合基因工程、 蛋白质工程、 细胞工程等技术， 使得生物技术药 物研发进入飞跃发展的时代。 治疗性抗体是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体 工程技术制备的药物， 以其特异性强、 安全有效而成为当前生物技术药物研发的热点。 制备 的抗 VEGFR-2 人鼠嵌合 IgG 抗体， 抗体骨架使用人 IgG， 抗原结合位点使用小鼠抗 VEGFR-2 的 VL 和 VH， 构建成的嵌合全抗体结构， 并应用真核系统表达， 使抗体构象接近于天然 ； 通过 试验表明保留了鼠源性抗 VEGFR-2 抗体的抗原性质和特异性， 但较天然抗体具有更强的特 异性和较长的半衰期， 用于血管相关疾病， 特别是高表达 VEGFR-2 的肿瘤研究， 可用于制备 抗 VEGFR-2 的诊断性试剂、 治疗性药物。
使用基因重组技术对该鼠源单克隆抗体进行改造制备嵌合 IgG 抗体， 制备的抗体 片段有以下优点 ：
(1) 大大降低了抗 VEGFR-2 抗体的鼠源性成分， 有利于进一步开展体内试验。
(2) 保留了鼠源性抗体具备的抗体性质和特异性， 可潜在用于血管相关疾病 ( 包 括一些高表达 VEGFR-2 的肿瘤 ) 的靶向诊疗。
(3) 真核表达嵌合全抗体更接近天然结构， 使活性更强， 半衰期更长， 可大量表达， 便于纯化， 作为治疗性抗体的。 附图说明 图1 ： 抗 VEGFR-2 杂交瘤单克隆抗体细胞总 RNA 电泳实验结果 ： 显示 RNA 抽提较好， 没有发生降解。
图2： 提纯后单克隆抗 VEGFR-2 抗体轻链可变区 (mVL) 及重链可变区 (mVH)( 含 部分恒定区 )PCR 扩增产物电泳实验结果 ： M： 核酸标准分子量 (Takara DL2000) ； mVL 约 750bp( 含部分恒定区 ) ； mVH 约 750bp( 含部分恒定区 )。
图3： 以健康人淋巴细胞 RNA 为模板扩增的人 IgG1 的轻链恒定区 (hIgG1CLκ) 及 重 链 恒 定 区 (hIgG1CH) 片 段 电 泳 实 验 结 果 ： M： 核 酸 标 准 分 子 量 (Takara DL2000) ； hIgG1CLκ 约 350bp ； hIgG1CH 约 1000bp ； 图 3a ： 轻链恒定区 (hIgG1CLκ) ； 图 3b ： 重链恒定 区 (hIgG1CH)。
图4 ： 嵌合轻链和重链扩增产物 1％琼脂糖凝胶电泳实验结果 ： M： 核酸标准分子量 (TakaraDL2000) ； 图 4a ： 轻链可变区 (mVL) 约 350bp， 轻链恒定区 (CLκ) 约 350bp， 嵌合后 轻链 (LL) 约 350bp ； 图 4b ： 重链可变区 (mVH) 约 350bp， 重链恒定区 (hIgG1CH) 约 1000bp， 嵌合后重链 (HH) 约 1500bp。
图5： 嵌 合 IgG 扩 增 产 物 的 核 酸 电 泳 实 验 结 果 ： M1 ： 核 酸 标 准 分 子 量 (Takara DL5000) ； M2 ： 核酸标准分子量 (Takara DL15000) ； 1 为约 4000bp 的含 IRES 的 IgG 基因片 段。
图6： Western-bloting 检测抗人 VEGFR-2 嵌合抗体性质和分子量实验结果 ： 1为 50μg/ml 的抗人 VEGFR-2 嵌合抗体， 2 为 25μg/ml 的抗人 VEGFR-2 嵌合抗体， 图 6a 为 HRP 标记羊抗人 IgG 抗体检测结果， 图 6b 为 HRP 标记羊抗鼠 Fab 抗体检测结果。
图7： 在 HUVEC 和 AML 细胞上进行免疫组化实验结果 ： 其中以不加一抗而只加二抗 作为阴性对照， 图 7a、 图 7b 为 HUVEC 和 AML 细胞的阴性对照 ； 图 7c、 图 7d 分别为抗人 VEGFR2 嵌合抗体与 HUVEC 和 AML 细胞的结合图。
图8： 在 HUVEC 和 AML 细胞上进行竞争抑制免疫组化实验结果 ： 其中以只加重组人 VEGF 为阴性对照， 以抗人 VEGFR2 嵌合抗体作为竞争抑制抗体， 图 8a、 图 8b 为 HUVEC 和 AML 细胞的阴性对照 ； 图 8c、 图 8d 为抗人 VEGFR2 嵌合抗体与人 VEGF 在 HUVEC 和 AML 细胞上的 竞争结合图。
图9： 以商品化重组人 VEGFR-2 蛋白为抗原， 抗人 VEGFR2 嵌合抗体为一抗的间接 法 ELISA 实验结果 ： 其中 a、 b 为人 VEGFR2 嵌合抗体样品， posi 为阳性对照， neg 为阴性对 照。
图 10 ： 以商品化重组人 VEGFR-2 蛋白为抗原， 抗人 VEGFR2 嵌合抗体与 VEGF 竞争 抑制的 ELISA 实验结果 ： Posi 为阳性对照， Neg 为阴性对照。其中 a、 b 为抗 VEGFR-2 嵌合 抗体样品， 1/2a、 1/2b 为 1/2 浓度的抗人 VEGFR2 嵌合抗体样品， posi 阳性对照， neg 为阴性 对照。
具体实施方式
本发明所述的抗人血管内皮生长因子受体 2 的重组嵌合抗体的制备方法， 该抗体 片段是利用基因工程技术制备， 具体步骤如下 ：
( 一 ) 鼠抗体可变区基因片段的扩增及序列分析
鼠源性抗 VEGFR-2 抗体杂交瘤细胞 D3/D5 培养至对数生长期， Trizol- 氯仿 - 异 TM 丙醇法抽提细胞总 RNA ； 使用 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit， 其中小鼠轻链可变 区、 重链可变区的 GSPs(gene-specific primers) 分别为 ：
mCLκB ： 5-ACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGG，
mIgMCH1 ： 5-ACATGCAGATCTCTGTTTTTGCCTCCGTAGTGG， 以 总 RNA 中 的 mRNA 为 模 板， 5’ RACE 逆转录扩增获得含轻链可变区、 重链可变区的 DNA 片断 ； 逆转录条件为 42℃ 90 秒 ； 70℃ 10 分钟 ； PCR 使用 KOD plus taq Polyerase 体系， 扩增条件均为 95℃ 2 分钟 ； 95℃ 20 秒， 56℃ 10 秒， 70℃ 1 分钟， 30 个循环 ； 70℃延伸 5 分钟， 琼脂糖凝胶电泳， 均扩增出约 750bp 的条带， 胶回收纯化扩增目的条带， 加 “A” 尾， 然后 TA 克隆到 pMD19T-Simple(TakaRa) 载体， 将连接产物转化 XL1-Blue 感受态菌， 涂布含 100μg/ml 氨苄青霉素的 LB 平板， 置 37℃ 15h ； 随机挑取单个菌落共 10 个过夜摇菌， 然后提取质粒， 送上海生工测序， 测序结果经 DNAStar 软件分析显示 ： VL 克隆除有 1 个发生突变外， 其他 VL 序列相同， VH 克隆除有 3 个发生突变 外， 其他 VH 序列也相同， 相同的序列被确定为目的序列， 如下 ：
轻链可变区 VL 包括部分恒定区 ： 336bp
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAG TCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAAC TGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC ACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCAAGCAATCTTATAATCTGTGGACGTT CGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCA...
重链可变区 (VH)( 包括部分恒定区 ) ： 366bp
TAACT GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGAGAAGCCTGGCGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGG TTACTCATTCACTGGCTACAACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCAATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTG ATCCTTACTATGGTGGTACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGC ACAGCCTACATGCAGCTCAAGAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCTGGGTATGGTTA CGGGGAGGGTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGAGAGTC
将序列输入 BLAST 对比分析， 确定下划双横线标记序列为前导序列 ： 轻链为 60bp， 重链为 336bp， 下单横线标记的序列为抗体可变区序列 ： 轻链为 60bp， 重链为 366bp。
( 二 ) 人 IgG 抗体恒定区基因片段的扩增及序列分析
提取健康志愿者外周血淋巴细胞中的 RNA， RT-PCR 获得 cDNA， 以 cDNA 为模板， PCR 使用 KOD plus polyerase 体系， 分别扩增人 IgG 抗体的 CLκ 和 CH 链核苷酸片段 ；CLκ 段 的 上 游 引 物 为 hCLκF ： 5-TTCTAGACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTT， 下游引物为 hCLκB ： 5-TACGCGTTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACG ； 其 中 CLκ 段 的 上 游 引 物 引入 XbaI 内切酶位点， CLκ 段的下游引物引入 MluI 内切酶位点， CH 的上游引物为 hCHF ： 5-AGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC， 下游引物为 hCHB ： 5-TGCGGCCGCCTATCATTTACCCGGAGA CAGGGAGAGGCTCTTC ； CH 上游引物引入 SalI 内切酶位点， CH 下游引物引入 NotI 内切酶位点， 扩增条件均为 95℃ 2 分钟 ； 95℃ 20 秒， 56℃ 10 秒， 70℃ 1 分钟， 30 个循环 ； 70℃延伸 5 分 钟， 1％琼脂糖凝胶电泳， 扩增出 CLκ 约 750bp 和 CH 约 1000bp 的条带， 胶回收纯化扩增目 的条带， 加 “A” 尾， 然后 TA 克隆到 pMD19T-Simple(TaKaRa) 载体， 将连接产物转化 XL1-Blue 感受态菌， 涂布含 100μg/ml 氨苄青霉素的 LB 平板， 置 37℃ 15h ； 随机挑取单个菌落 5 个过 夜摇菌， 然后提取质粒， 送上海生工测序， 测序结果与 pubmed 上序列比对， 经 DNA Star 软件 分析显示 ： CLκ 各克隆除均有点突变， 其中一个编号为 CLκ#2 克隆的氨基酸序列与参考序 列完全相同， CH 各克隆除有均有点突变， 其中一个编号为 CH#5 克隆的氨基酸序列与 IgG1 参 考序列 95％以上相同。相同的序列被确定为目的序列， 如下 ( 下横线标记的序列为抗体内 切酶位点 ) ：
轻链恒定区核苷酸序列为 ： 327bp TCTAGACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGA ACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCT CCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGA CGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTC
ACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
ACGCGT......轻链恒定区氨基酸序列为 ： 107aa
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重链恒定区核苷酸序列 ： 996bp
GCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCG GCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCA GCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCC AAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTT CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACG AAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAG CAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAG GCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCC CGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAA A CGGCCGC......重链恒定区核苷酸序列为 ： 330aa
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
( 三 ) 轻链及重链的嵌合
1、 轻链的嵌合 ：
根据 pIRES 载体特性及 Overlap PCR 原理设计带内酶切位点轻链嵌合扩增引物， 如下 ：
LL1 ： 5-AAGCTAGCATGGATTCACAGGCCCAGGTTCLL2 ： 5-CAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTC LL3 ： 5-GAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTG LL4 ： 5-TCGACGCGTCCTGCAGG ACACTCTCCCCTGTTGAAGC其中引物 LL1、 LL2 扩增 VL 片段， 引物 LL3、 LL4 扩增 CLκ 片段， 在引物 LL1 的 5′ 端引入内切酶位点 NheI 即下划线部分序列及真核表达用的 Kozak 序列即方框部分序列， 在 引物 LL4 的 5′端引入了内切酶位点 MluI 和 SbfI 即下划线部分序列及真核表达用的终止 序列即方框部分序列， 引物 LL3 和 LL4 中用下划线标记的为 VL 尾部序列， 未用下划线未标 记的为 CLκ 的首端序列， 以利于鼠源性抗 VEGFR-2 抗体的 VL 与人 IgG 的 CLκ 片段的重叠 PCR 扩增 ； 扩增的步骤 ： PCR 使用 KOD plus polyerase 体系， 以 VL 序列为模板， 用引物 LL1、 LL2 扩增， 得到产物 A。以 CLκ 序列为模板， 用引物 LL3、 LL4 扩增， 得到产物 B。琼脂糖凝 胶电泳， 产物 A、 B 均为约 350bp 的条带。将产物 A、 B 各取等量混合， 再稀释 10 倍， 以此为模 板， 用引物 LL1、 LL4 进扩增， 得到产物 C， 琼脂糖凝胶电泳， 产物 C 为约 700bp 的条带， 产物 C 即所需嵌合抗体的轻链 (CLκ) 基因。后续 TA 克隆及质粒提取等处理同上面， 序列分析嵌 合抗体轻链 (CLκ) 基因序列与设计完全相符。测序所得序列如下 ：
嵌合抗体轻链核苷酸序列为 ： (663bp， 序列中下划双横线部分的为引导序列， 下划 单横线部分为内切酶位点， 划波浪线部分为可变区序列， 方框内部分为终止序列， 未划线部 分为恒定区序列 )
GCTAGCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCC TGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAG GAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTA11102093479 A CN 102093485说CCTGCAGGACGCGT明书9/11 页CGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGG GAGAGTGT
2、 重链的嵌合 ： 根据 pIRES 载体特性及 Overlap PCR 原理设计带内酶切位点轻链嵌合扩增引物， HH1 ： 5-ATCTAGA ATGGGATGGACCTGGATC如下 ：
HH2 ： 5-GATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTG HH3 ： 5-CACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATC HH4 ： 5-TGCGGCCGC TTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTC其中引物 HH 1、 HH 2 扩增 VH 片段， 引物 HH 3、 HH 4 扩增 CH 片段， 在引物 HH 1 的 5′端引入了内切酶位点 XbaI 即下划线部分序列及真核表达用的 Kozak 序列即方框部分序 列， 在引物 HH 4 的 5′端引入了内切酶位点 Not 即下划线部分序列及真核表达用的终止序 列即方框部分序列， 引物 HH 3 和 HH 4 中用下划线标记的为 VH 尾部序列， 未用下划线标记 的为 CH 的首端序列， 以利于鼠源性抗 VEGFR-2 抗体的 VH 与人 IgG 的 CH 片段的重叠 PCR 扩 增； 扩增的步骤 ： PCR 使用 KOD plus polyerase 体系， 以 VH 序列为模板， 用引物 HH 1、 HH 2 扩增， 得到产物 E。以 CH 序列为模板， 用引物 HH 3、 HH 4 扩增， 得到产物 F。琼脂糖凝胶电 泳， 产物 E 为约 350bp 的条带、 F 为约 1000bp 的条带。将产物 E、 F 各取等量混合， 再稀释 10 倍， 以此为模板， 用引物 HH 1、 HH4 进扩增， 得到产物 G， 琼脂糖凝胶电泳， 产物 G 为约 1500bp 的条带， 产物 G 即所需嵌合抗体的重链 (CH) 基因。后续 TA 克隆及质粒提取等处理方法同 步骤 (1)， 序列分析嵌合抗体轻链 (CH) 基因序列与设计完全相符。测序所得序列如下 ： 嵌 合抗体重链核苷酸序列为 ： (1362bp， 序列中下划双横线部分的为引导序列， 下划单横线部 分为内切酶位点， 划波浪线部分为可变区序列， 方框内部分为终止序列， 未划线部分为恒定 区序列 )
TCTAGAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCT CTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC GCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGAC CGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACA AGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCG TCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGT GGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAAT GGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGG GCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAG ACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCA GCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC TCCGGGTAAA
CGGCCGC( 四 ) 嵌合 IgG1 逆转录病毒载体的构建和鉴定
1、 pIRES-IgG 重组载体的构建
用内切酶 NheI 和 MluI 从嵌合轻链 (CLκ) 基因序列 T 载体获得并连接至质粒 pIRES 多克隆位点 A 处， 用内切酶 XhoI 和 NotI 从嵌合重链 (CH) 基因序列 T 载体获得并连接 至质粒 pIRES 多克隆位点 B 处。此时， 轻链和重链置于同一启动子 CMV 启动子的控制之下， 轻链基因后接一核糖体进入位点序列 (IRES)， 其后是重链基因， 转录出来的双顺反子 mRNA 可因 IRES 的存在同时翻译轻、 重链。
2、 pMSCV-antiVEGFR2-IgG 逆转录病毒载体构建
PCR 法将获取重组 pIRES-IgG 载体上从 CMV 启动子至 SV40PolyA 片段， 所用 PCR 引 物 为： IRES1 ： 5-GACGAATTCTCAATATTGGCCATTAGCCATATTA， IRES2 ： 5-CTTCTCGAGTTTTAC CACATTTGTAGAGGTTTTAC， 并 通 过 XhoI 和 EcoRI 连 接 至 pMSCV 载 体 多 克 隆 位 点 处， 获得 pMSCV-antiVEGFR2-IgG 重组载体。经过测序鉴定确定无突变。
( 五 ) 表达嵌合 IgG 抗体细胞的筛选鉴定及表达蛋白的纯化
1、 逆转录病毒的包装
将含有正确重组逆转录病毒 pMSCV-antiVEGFR2-IgG 质粒脂质体转染 GP2-293 细 胞， 培养 24 个孔， 置 37℃ 6h 后， 加入 α-MEM 培养基， 培养 24h 时， 取上清用终浓度为 0.45M 的 NaCl 和 8％的 PEG60004℃过夜沉淀， 然后 4℃ 10000rpm 离心 30min， 取沉淀并且提取转 染细胞的总 RNA， 用轻链和重链引物 PCR 检测转染效率。
将细胞沉淀收获， 超声破碎后， 连同培养上清沉淀冻存于 -80℃。
2、 抗人 VEGFR-2 嵌合抗体在 CHO 细胞的表达
将冻存于 -80℃的 pMSCV-antiVEGFR2-IgG， 100CCID50/ml37℃吸附于 CHO 细胞 1h， 然后加入无血清培养基， 37℃、 5％ CO2 培养， 于 2-6 天取上清进行检测， 用 ELISA 法和免疫 组化进行检测。 3、 抗人 VEGFR2 嵌合抗体纯化
将无血清培养 CHO 的培养上清收集， 以 2 ～ 10ml/min 的速度过 SPA 亲和层析柱， 然后用 5mol/L 盐酸胍洗脱， 再用 0.001mol/mLPBS 透析后备用。
( 六 ) 抗人 VEGFR2 嵌合抗体的功能鉴定
1、 Western-bloting 检测抗人 VEGFR-2 嵌合抗体特性和分子量
将真核表达的 50μg/ml 的抗人 VEGFR-2 嵌合抗体和 25μg/ml 的抗人 VEGFR-2 嵌 合抗体进行 4-10％ SDS-PAGE 电泳并电转到硝酸纤维素膜上， 分别与 HRP 标记羊抗人 IgG 抗 体和 HRP 标记羊抗鼠 Fab 抗体 4℃孵育过夜， DAB 显色， 在 150kDa 处与 HRP 标记羊抗人 IgG 抗体和 HRP 标记羊抗鼠 Fab 抗体均有条带显示， 与理论相符， 说明含有目的抗体鼠的可变区
和人的恒定区。
2、 间接 ELISA 法检测抗人 VEGFR-2 嵌合抗体亲和力
用含 0.1M 碳酸盐缓冲液， pH9.6 的包被液稀释重组人 VEGFR-2 蛋白， 以 1μg/ml 的 浓度包被 96 孔 ELISA 板， 每孔加入 100μl， 4℃过夜 ； PBST 洗涤 5 次后， 用含 3％ BSA 的 PBS 缓冲液封闭， 37℃孵育 2h ； PBST 洗涤 5 次， 每次 3min ； 两个孔中加入 100μl 抗人 VEGFR-2 嵌合抗体， 37℃ 2h， PBST 洗涤 5 次， 每次 3min， 再用 1 ∶ 5000 稀释的 HRP 标记羊抗人 IgG 抗 体 100μl/ 孔， 37℃孵育 1h ； PBST 洗涤 5 次， 每次 3min， TMB 显色液 100μl/ 孔， 室温下 15 分钟后用 2M 硫酸中止反应， 检测采用双波长 450nm/630nm， 结果嵌合抗人 VEGFR-2 嵌合抗体 能与重组人 VEGFR-2 蛋白起抗原抗体 ELISA 反应。
3、 VEGF 与 VEGFR2 竞争抑制 ELISA
用含 0.1M 碳酸盐缓冲液， pH9.6 的包被液稀释重组人 VEGFR-2 蛋白， 以 1μg/ml 的浓度包被 96 孔 ELISA 板， 每孔加入 100μl， 4℃过夜 ； PEST 洗涤 5 次后， 用含 3％ BSA 的 PBS 缓冲液封闭， 37℃孵育 2h ； PBST 洗涤 5 次后， 每个孔中加入 100ng/50μl 抗 VEGFR-2 嵌 合 IgG 抗体 +100ng/50μl 重组人 VEGF， 37℃孵育 2h ； PBST 洗涤 5 次后， 加入 100ng/100μl 羊抗人 VEGF 抗体 37 ℃孵育 1h ； PBST 洗涤 5 次， 每次 3min， 再加入 1 ∶ 5000 稀释的 HRP 标 记 鼠 抗 羊 IgG 抗 体 100μl/ 孔， 37 ℃ 孵 育 1h ； PBST 洗 涤 5 次， 每 次 3min， TMB 显 色 液 100μl/ 孔， 室温下 15 分钟后用 2M 硫酸中止反应， 检测采用双波长 450nm/630nm， 实验中用 VEGF100ng/50μl+0.002M PBS/50μl/ 孔做阳性对照， 0.002M PBS/10μl/ 孔做阴性对照， 结果显示抗人 VEGFR-2 嵌合抗体能与重组人 VEGF 蛋白竞争结合于已包被于 96 孔板的重组 人 VEGFR-2 蛋白。
4、 免疫组化
用一定浓度的 HUVEC 和 AML 细胞制片， 吹干后用 4％的甲醛固定 10min， 然后滴加 100ng/10μl 抗 VEGFR-2 嵌合 IgG 抗体 ( 稀释液为 1％ BSA 的 PBS)， 1％ BSA 的 PBS 作阴性 对照 4℃孵育过夜， 然后用 PBST 洗 5 次， 滴加 HRP 标记鼠抗人 IgG 抗体， 室温孵育 2h， 于显 微镜下观察， 结果显示抗人 VEGFR-2 嵌合抗体能与 HUVEC 细胞上的 VEGFR2 结合。
5、 和竞争抑制免疫组化
用 一 定 浓 度 的 HUVEC 和 AML 细 胞 制 片， 吹 干 后 用 4 ％ 的 甲 醛 固 定 10min， 然后 分 别 100ng/10μl 抗 VEGFR-2 嵌 合 IgG 抗 体、 100ng/10μlVEGF、 PBS 结 合 于 细 胞 片、 100ng/10μl 抗 VEGFR-2 嵌合 IgG 抗体 +100ng/10μlVEGF， 4 ℃孵育过夜， 然后用 PBST 洗 5次； 100ng/10μl 抗 VEGFR-2 嵌合 IgG 抗体加 HRP 标记鼠抗人 IgG 抗体， 、 VEGF、 PBS、 抗 VEGFR-2 嵌合 +VEGF 均加 HRP 标记抗 VEGF 的抗体， 室温孵育 2h， 于显微镜下观察， 结果显示 抗人 VEGFR-2 嵌合抗体能与 VEGF 在 HUVEC 细胞上竞争与 VEGFR2 结合。14102093479 A CN 102093485
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