人巨细胞病毒 (Wiebusch 等， (2004)J Gen Virol 85， 179-84)、 卡波西肉瘤相关性疱疹病 毒 (Godfrey 等， (2005)Blood 105， 2510-8)、 鸭疱疹病毒 (Mallanna 等， (2006)Virus Res 115， 192-7) 和 HSV-2(Palliser 等， (2006)Nature439， 89-94)。 这些研究涉及引入合成的 siRNA， 或者遗传转移能够在人细胞中产生 siRNA 或 shRNA 的 DNA 表达盒。 尽管这种方法可以使用培养物中的细胞就 RNAi 机制提供有价值的信 息， 但是其难以在体内达到同样的效果。存在与在目标细胞类型中表达所述 siRNA 并实现 充分的和可持续的表达水平的困难。
尽管 RNAi 的特异和有效的本质潜在地是一种非常强力的治疗手段， 但是可持续 的长期靶基因敲低 (knockdown) 仍然是 RNAi 广泛的治疗性使用的障碍。通过使用使用重 组病毒载体 ( 例如， 腺病毒、 腺伴随病毒 (AAV) 和慢病毒 ) 递送 siRNA 可以克服这些问题中 的一些。然而， 对于这些载体中的一些的安全性和因 siRNA 较高的表达水平而产生的 RNAi 途径的过饱和的顾虑还有待解决 (Aagard and Rossi(2007)Adv.Drug Delivery Reviews 59， 75-86)。
因此， 需要一种改进的 RNAi 递送机制， 提供 RNAi 在体内可持续的长期表达水平。 发明内容 本发明人已经发现可以修饰疱疹病毒的内源 miRNA 簇 ( 例如， 马立克病病毒 (MDV)) 以表达针对靶基因的 miRNA。由于疱疹病毒 miRNA 在整个疱疹病毒生命周期中高度 表达， 所以经修饰的 miRNA 的稳定高水平表达也能够实现。
在第一方面， 本发明提供一种疱疹病毒载体， 其包含编码针对靶序列的微小 RNA(miRNA) 的经修饰的基因组序列。
所述经修饰的 miRNA 可以为治疗性 miRNA， 并且所述载体可用于预防和 / 或治疗疾 病。
所述 miRNA 可以针对来自传染性病原体 ( 例如病毒 ) 的靶序列。所述 miRNA 能够 沉默来自所述传染性病原体的基因的表达， 例如， 其可以抑制传染性病原体的复制或传染 性病原体造成的感染。
所述传染性病原体可以为疱疹病毒。由于疱疹病毒载体基于疱疹病毒， 很有可能 与传染性病原体遵循相同的感染途径并达到相同的组织。其所具有的优势是所述 miRNA 会 在体内的正确位置处产生。
如果所述疱疹病毒载体编码针对来自病原性疱疹病毒 ( 所述载体基于这种疱疹 病毒 ) 的靶序列的 miRNA， 存在额外的优点在于所述载体可以起到传统疫苗的作用， 例如， 减毒活疫苗， 其刺激针对传染性病原体的免疫应答。
如果传染性病原体内的靶序列， 或者与其具有高同一性程度的序列出现在疱疹病 毒载体中， 那么其可以优选修饰疱疹病毒载体使得所述 miRNA 不使载体自身沉默。
本发明的第一方面的疱疹病毒载体可以基于马立克病病毒 (MDV)。本发明人已经 证明在 MDV-1 中存在 13 个 miRNA(Yao 等 (2008)J Virol 82 ： 4007-15) 而在 MDV-2 中存在 17 个 miRNA(Yao 等 (2007)J.Virol 81 ： 7164-70)， 其中大部分成簇表达。例如， 所述疱疹病 毒载体可以包含经修饰的 miR-M7 序列。
本发明的第一方面的载体能够表达多个经修饰的 miRNA。 例如， 所述载体可以包含
多个经修饰的基因组序列， 其每一个编码一经修饰的微小 RNA。 所述 miRNA 可以针对相同的 靶基因或不同的靶基因中的靶序列。如果 miRNA 直接针对多个靶基因， 那么它们可以是在 相同的靶病原体内的基因。
在病毒 ( 例如马立克病病毒 (MDV)) 中， 多个 miRNA 表达为多顺反子式 miRNA 转录 物， 促进多个经修饰的 miRNA 的共表达。
多个 miRNA 的表达特别有利于针对有逃逸倾向的病毒病原体， 例如 HIV。 靶序列中 较小的序列变化， 有时候甚至为单点突变， 也可以足以克服 RNAi- 介导的抑制， 原因是 RNAi 精密的底物特异性。 因此， 如果突变发生在靶序列中， 那么 HIV 能够避开 RNAi 的抑制。 这种 风险通过多个 miRNA 的同时表达大大降低， 因为逃逸将理论上地涉及所有靶序列的突变。
在第二方面， 本发明提供一种用于产生根据本发明的第一方面的载体的方法， 其 包括在编码形成 pri-miRNA 的茎环结构的茎的链的序列中引入一个或多个突变的步骤， 所 述 pri-miRNA 由疱疹病毒载体基因组编码。
在期望的 miRNA 编码序列的创建涉及多个点突变的情况下， 用外源序列替代所述 mi-RNA 序列可能更简单。
为了确保使 pre-miRNA 充分地被切丁酶 (dicer) 切割， 可以对突变进行设计从而 使经修饰的 pre-miRNA 保留天然 pre-miRNA 的结构特征。
本发明第二方面的方法可以包括下列步骤 ：
(i) 扩增疱疹病毒的基因组 miRNA ；
(ii)miRNA 的突变 ；
(iii) 通过 BAC 诱变生成突变体克隆以产生疱疹病毒载体， 所述疱疹病毒载体包 含经修饰的基因组序列， 其能够编码针对靶序列的微小 RNA(miRNA)。
在第三方面， 本发明提供包含根据本发明的第一方面的疱疹病毒载体的疫苗。
本发明的载体或疫苗可以用于防止和 / 或治疗疾病。所述疾病可以为病毒病。例 如， 所述疾病可以选自下组 ： HIV、 肝炎病毒、 呼吸道合胞病毒 (RSV)、 马立克病、 禽流感、 传 染性囊病、 鸡贫血、 新城疫、 传染性支气管炎、 呼肠病毒感染、 传染性喉气管炎和禽痘。
或者， 所述靶序列可以为任何宿主基因， 其表达可以通过依赖于疱疹病毒的嗜性 (tropism) 以细胞类型特异性方式表达针对所述基因的经修饰的 miRNA 的疱疹病毒来特异 性地沉默。例如， 亲神经疱疹病毒 ( 如 HSV-1) 能够用于沉默神经学病症中涉及的基因， 或 者能够使特定基因沉默的表达经修饰的 miRNA 的疱疹病毒能够在例如癌症的状况中用作 治疗性疫苗。 附图说明 图 1 显示由不同疱疹病毒编码的 miRNA 的细节和名称。
图 1A 显示使用 MFOLD 算法预测的 MDV-1 pre-miRNA 的二级结构。成熟 miRNA 链 以红色表示。
图 2 显示 MDV-1 miRNA 的基因组定位。 该示意图显示在此报告图谱中鉴定的 MDV-1 miRNAs 在何处 ( 小箭头 )。显示 TRL 和 IRL 区在独特的长区两侧， 而 TRS 和 IRS 区在独特的 短区两侧。指明了包含在所述 miRNA 基因座中的 MDV ORF 的基因组位置和取向。
图 3 显示 MDV-1 miR-6-7-8-10 簇的核苷酸序列。以颜色显示各 miRNA 的 miRNA
链的序列。
图 4 为列出用于修饰作为针对萤光素酶基因的 siRNA 的 MDV-1 miR-M7 序列的策 略的示意图。所有红色序列为天然 miRNA 序列， 黑色序列为萤光素酶 shRNA 序列， 而蓝色序 列为互补链并且仅是为了呈现。
图 4A 显示使用 MDV miR-6 和 miR-7 基因座 shRNA 沉默萤光素酶报告基因。
图 5 为在经修饰的 MDV-1 miRNA 簇中经修饰的 miRNA 结构的示意图， 其中 miR-M8、 miR-M6 和 miR-M7 已经过修饰。
图 6 显示 Northern 印迹分析， 其显示了由 MDV-1 编码的 miRNA 的表达。
图 7 显示 Northern 印迹分析， 其显示了由 MDV-2 编码的 miRNA 的表达。
图 8 显示 Northern 印迹分析， 其显示了由 MDV 的 HVT 菌株编码的 miRNA 的表达。
图 9 显示测量在经 MDV 转化的细胞中 ICP4、 Meq 和 miR-4、 miR-8 和 miR-12 转录物 水平的定量 RT-PCR。
发明详述
疱疹病毒载体
术语 “载体” 用于指示能够向靶细胞递送感兴趣的核苷酸 NOI 的疱疹病毒。在本 发明的上下文中， 所述 NOI 为 miRNA， 或者能够产生 miRNA。 所述 NOI 可以为， 例如， 能够编码 pre-miRNA、 priMRNA 序列、 pre-miRNA 序列或成 熟 miRNA 的基因组序列。
所述疱疹病毒载体可以从疱疹病毒递送， 所述疱疹病毒例如， MDV、 HVT、 HSV-1、 HSV-2、 VZV、 EBV 或 CMV( 见下文 )。
在载体 “基于” 特定疱疹病毒的情况下， 其指示所述载体可以从所述野生型病毒递 送， 但是可以经修饰， 例如以降低其毒力。所述载体可以， 例如， 经过减毒 (attenuated)( 见 下文 ) 和 / 或修饰以提高其免疫原性或将其靶向特定组织。
所述表达经修饰的 miRNA 的疱疹病毒可以依赖于疱疹病毒的嗜性以细胞类型特 异性方式沉默靶基因的表达。这意味着可以选择疱疹病毒 ( 基于其细胞嗜性 ) 以沉默感兴 趣的特定细胞中靶基因的表达。
表 1 显示编码 miRNA 的疱疹病毒和它们的细胞嗜性。
表1
RNAi
存 在 两 大 类 的 小 RNA， 其 为 RNAi 的 特 征 ： (i) 第 一 类 为 小 干 扰 RNA(siRN4)， 其 为 21-23 个碱基完全配对的双链体， 该双链体同与信使 RNA 转录物的区域进行完美碱基 配对的相互作用， 通过 RNA- 诱导性沉默复合物 (RISC) 引起该区域的特异性降解 (Rana， T.M.(2007)Nat Rev Mol Cell Biol 8， 23-36)。使用 siRNA 沉默特定基因和病毒的技术和 应用正在稳步进行， 并且一些实验也在进行中 (Aagaard， L.&Rossi， J.J.(2007)Adv Drug
Deliv Rev 59， 75-86 ； deFougerolles 等 (2007)Nat Rev Drug Discov 6， 443-53)。 这些通 常由来自短发夹 RNA(shRNA) 表达载体的聚合酶 III 启动子 ( 例如， U6、 H1 等 ) 诱导。(ii) 第二类为 21-23 个碱基的双链体的微小 RNA(miRN4)， 其碱基配对通常不完全， 通过 RISC 在 靶定转录物的 3’ 非翻译区 (UTR) 内形成部分双链体， 导致对翻译的抑制。在不同的物种 中鉴定了几种 miRNA(Griffiths-Jones 等 (2008)NucleicAcids Res 36， D154-8)。这些 被认为与来自聚合酶 II 启动子的蛋白质编码基因类似地得到表达和调节， 即首先作为长 的初级转录物 (pri-miRNA)(Lagos-Quintana， M. 等 (2002)Curr Biol 12， 735-9)。所述 pri-miRNA 由核 Drosha-DGCR8 复合体切割以产生 pre-miRNA， 其在细胞质中被进一步加工 成成熟的 miRNA 双链体。 许多这些 miRNA 的表达受限于特定细胞谱系和发育阶段， 且最近的 数据提示它们在多种状况和疾病 ( 包括癌症 ) 中对基因调节显示显著的影响 (Skaftnesmo 等 (2007)Curr Pharm Biotechnol 8， 320-5)。
miRNA
最先发现的病毒编码的 miRNA 是在 EBV 基因组中制备的 (Pfeffer， S. 等 (2004) Science 304， 734-6)。自此之后， 鉴定了几种病毒编码 miRNA(Pfeffer， S. 等 (2005)Nat Methods 2， 269-76 ； Cullen， B.R.(2006)Nat Genet 38 Suppl， S25-30 ； Nair， V.&Zavolan， M.(2006)Trends Microbiol 14， 169-75)， 其中疱疹病毒几乎占到 miRBase 中病毒编码的 miRNA 的全部 (124/127)。本发明人已经报告鉴定了马立克病病毒 (MDV)、 α 疱疹病毒 ( 属 于的疱疹病毒科 (familyHerpesviridae)Mardivirus 属 ) 的几种新 miRNA。 这些包括 MDV-1 中的 13 种 miRNA(Yao， Y. 等 (2008)J Virol 82， 4007-15)、 MDV-2 中的 17 种 (Yao， Y. 等 (2007)J Virol 81， 7164-70) 和 HVT 中的 11 种 ( 未发表 )。大多数的这些 miRNA 作为簇表 达， 并且这些 miRNA 的基因组结构在图 1 中给出。这些 miRNA 中的大多数在受感染的细胞 / 组织中以非常高的水平表达， 如 Northern 印迹 ( 图 6、 7 和 8) 和 qPCR 分析 ( 图 9) 所示。
本发明人已经发现可以修饰疱疹病毒 miRNA 簇中内源基因在 miRNA 编码序列从而 其表达经修饰的 miRNA。这种经修饰的 miRNA 可与感兴趣的靶序列互补。
因此， 在第一方面， 本发明提供包含编码针对靶序列的微小 RNA(miRNA) 的经修饰 的基因组序列的疱疹病毒载体。
术语 “修饰的 / 经修饰的” 用于表示包含一个或多个突变的基因组 miRNA 编码序 列， 使得其产生不同于未经突变的基因组序列本会产生的 miRNA 序列的经修饰的 miRNA。 所 述基因组 miRNA 编码序列为内源性的， 意思是其序列在修饰前天然存在于疱疹病毒基因组 中。
基因组 miRNA 编码序列中的所述 “修饰” ( 即突变 ) 是在编码形成茎环结构的茎的 两条链中进行的。应该在每条链的编码序列中造成对称的突变， 从而在 pri-miRNA 中产生 正确的茎环结构。
由本发明的载体产生的 miRNA 通常长度为 20 ～ 25， 例如， 21 ～ 23 个碱基对。
靶序列
所述靶序列可以是部分的靶基因。
在疾病为传染病的情况下， 所述靶序列或靶基因可以为来自传染性病原体的靶序 列或靶基因。
或者， 所述靶序列或靶基因可以为表达希望得到降低或沉默的宿主基因。 例如， 较合意的是沉默与在变态反应或自身免疫疾病过程中产生的病原性免疫应答相关的特定基 因的表达。此外， 在癌症中， 其可以沉默涉及异常细胞增殖的基因的表达。
疱疹病毒表达针对宿主基因的 miRNA 作为它们正常生物学的部分。在本发明的上 下文中， 在 miRNA 针对来自宿主基因的靶序列的情况下， 所述宿主基因不同于通常所述特 定 miRNA 沉默的基因。所述 miRNA 经过修饰以靶向选定的宿主基因， 其通常不被该 miRNA 沉默。
可选地， 靶序列或靶基因可以为动物模型中的感兴趣的基因。 以这种方式， 该技术 可以用于调查使宿主基因沉默的效果， 从而提供关于该基因的功能的信息。 在小鼠模型中， 鼠疱疹病毒 MHV-68 和 MCMV 可以用于该用途中， 因为它们靶向淋巴细胞、 巨噬细胞、 树突细 胞和内皮细胞， 并且在这些细胞中表达高水平的 miRNA。
所述靶序列为 miRNA 结合的序列。 所述靶序列可以为 RNA， 特别是信使 RNA(mRNA)。
在所述靶序列来自传染性病原体的情况下， 所述靶序列或靶基因可以为基本序 列 (essential sequence)， 即没有它们时所述传染性病原体无法执行基本功能， 例如复制 或感染宿主。如果基本靶序列的表达 ( 即， 转录或翻译 ) 受到阻断， 那么所述病原体不可 存活。在 MDV 中， 研究已经表明 gB 包膜糖蛋白对于 MDV 的复制是关键的 (Schumacher 等， 2000)， 并且可能涉及病毒传播。另一具有吸引力的候选为复制基因 UL29， 因为其是编码单 链 DNA 结合蛋白的高度保守的基因， 其已经证实为用于针对 HSV-2 进行的 RNAi 的优异候选 者 (Palliser 等， 2006)。
所述载体可以表达多个 miRNA， 每个均针对不同的靶序列。 所述靶序列可以为在相 同的靶基因内的或在不同的靶基因内的不同序列。 在针对相同的靶基因表达两个或更多个 miRNA 的情况下， 它们可以具有导致使靶基因沉默增强的 “累加效应” 。
术语 “针对” 指的是特异性识别靶序列的 miRNA。所述 miRNA 具有与靶序列互补的 核苷酸序列。所述 miRNA 通常会与靶序列 100％互补。然而， 与源自长 dsRNA 前体的 siRNA 不同的是， 认为 miRNA 能够容忍一定程度的不完全碱基配对。因此， 所述 miRNA 可以具有 3 个、 2 个或优选 1 个与靶序列的错配。
所述 miRNA 可以使靶序列或靶基因的表达沉默。 将表达的 miRNA 并入 RNA- 诱导性 沉默复合物 (RISC) 中， 在该复合物中其与靶序列配对。 在所述靶序列或靶基因为 mRNA 的情 况下， 所述 RISC 随后可以引起转录后基因沉默， 其中特异碱基配对通过 argonaute(RISC 复 合物的催化性部分 ) 引起靶序列的降解。与这方面相关， 所述靶序列可以在 mRNA 的 3’ UTR 内。
或者所述 RISC 复合物可以替代性地或额外地通过引起基因的外遗传变化影响靶 序列的转录 ( 因此所述靶序列可为 DNA 序列 )， 例如组蛋白修饰和 DNA 甲基化， 其影响基因 转录的程度。
术语 “沉默的” 表示与不存在 miRNA 时会见到的表达相比， 靶序列或靶基因的表达 部分或全部降低。可以使靶基因的表达沉默， 例如， 至少 50、 60、 70、 80、 90 或 95％。
一旦鉴定了靶基因， 就可以使用本领域已知的技术鉴定候选 miRNA 序列， 例如使 用来自 Eurogenetec 的 siRNA 设计平台。
本发明的载体的一个优点在于所述 miRNA 是以与内源 miRNA 序列相同的方式由疱 疹病毒载体基因组产生的， 并且随后能够使用天然疱疹病毒基因座的调节机制沉默所述靶基因。 在天然的 miRNA 成熟途径中， 初级 miRNA(pri-miRNA) 从其基因组位置转录并且由 微处理器 (microprocessor) 复合物 ( 包含 Drosha 和 DGCR8) 切割。所得的 pre-miRNA 通 过转运蛋白 5 主动运输至细胞质， 在细胞质中所述 pre-miRNA 经历通过切丁酶及其辅因子 (PACT 和 TAR RNA 结合蛋白 TBRP) 进行的进一步加工成为成熟 miRNA。所述成熟 miRNA 随 后装载到 RISC 复合物上。
应该设计对 miRNA 编码序列的修饰以保留得到 Drosha、 DGCR8、 转运蛋白 5、 切 丁酶及其辅助因子或 RISC 复合物有效识别所需的任何序列和结构特征。例如， 为了确保 pre-miRNA 被切丁酶充分切割， 故意错配可以包含在编码碱基配对的茎的两条链的序列中， 其可以经修饰以模拟天然 pre-miRNA 的结构特征。
在本发明的上下文中， “天然” pri-miRNA、 pre-miRNA 或 miRNA 序列为在没有任何 修饰的情况下会由疱疹病毒产生的序列。
疫苗
本发明还涉及疫苗。疫苗是一种用于对疾病建立免疫性的抗原性制备物。
疱疹病毒载体自身当施用给受试者时会诱导免疫应答。 这种免疫应答在治疗或预 防疾病中也可能是有价值的。 例如， 在疾病是传染病的情况下， 免疫应答可能还帮助控制或 消除病原体造成的感染。
本发明的第一方面的疱疹病毒载体可以基于已经作为疫苗使用的疱疹病毒。
其可以基于减毒的疱疹病毒， 即已经在降低其毒力的条件下培养过的疱疹病毒。
病毒可借由通过外来宿主进行的病毒的传代来减毒， 如通过组织培养或通过胚胎 化的卵或活的动物进行的传代。在这些方法中， 将初始病毒群体应用于外来宿主。对于感 染新宿主的能力增加的任何突变体都有选择压力。 这种突变体通常在原始宿主中会具有较 低的毒力， 但保持原始病毒诱导免疫应答的能力， 使其成为引人注目的疫苗候选者。
已经发现疱疹病毒的 miRNA 簇在减毒的疫苗株中是保守的。
减毒活疫苗广泛用于针对许多病毒感染的免疫接种， 特别是在兽医学中， 如针对 马立克病 ( 见下文 )。
在活疫苗接种中也可以使用不引起目标疾病的微生物， 但其引起对目标疾病的保 护性免疫应答的产生。 Jenner 在 1796 年的经典观察结果， 即暴露于牛痘提供了针对天花的 保护， 就是以这种免疫应答类型为基础的。
在马立克病中， 火鸡的疱疹病毒 (HVT) 可用于诱导会针对马立克病病毒 (MDV) 提 供保护的免疫应答。
本发明的基于疱疹病毒的疫苗会诱导抗 - 载体免疫应答。在载体是以靶传染性病 原体为基础或与其高度相似的情况下， 这种抗 - 载体免疫应答可能与针对所述传染性病原 体的保护直接相关。
在靶传染性病原体是与疱疹病毒载体不同的情况下 ( 例如在所述传染性病原体 是不同类型的病毒， 或者甚至是非病毒病原体的情况下 )， 抗 - 载体免疫应答的非 - 适应性 部分对病原体清除仍然是有用的。
对已建成的疫苗的修饰
病毒疫苗可以基于在疾病的治疗和 / 或预防中已经提出的或正在使用的已建成
的 (established) 活疫苗。
已建成的活疫苗包括 MMR 疫苗， 其为三种减毒活病毒的混合物， 用于针对麻疹、 腮 腺炎和风疹的免疫。
用于治疗疱疹病毒感染的已建成的疫苗包括 VarivaxTM， 一种针对水痘的水痘病毒 活疫苗， 和用针对 MD 的 MDV 的活减毒株进行接种。活的疱疹病毒疫苗针对马疱疹病毒感染 的使用已经取得了一定的成功 (Patel 等， (2003)Vet.Microbiology 20 ； 92(1-2) ： 1-17)。
MD 疫苗
在 20 世纪 70 年代， MD 控制主要通过用火鸡的疱疹病毒 (HVT， 血清型 3) 进行 接种来完成。这在 20 世纪 80 年代在某种程度上由血清型 2 疫苗的开发所取代， 如 SB-1 和 301B/1。最近， 开发了血清型 1 疫苗， 如减毒的 HPRS-16 和 CVI988(Rispens 疫苗 ) 株。 Rispens 疫苗 ( 产生自具有低致癌性的天然分离株 ) 已经得到广泛应用， 特别是由于已经发 现其针对 MDV 病毒的强毒力株非常有效。
就本发明而言， 基于原始 HVT 疫苗的疫苗具有一些优点。例如， 与血清型 1 和 2 的 病毒株不同， HVT 能够在无细胞体系中产生。而且， 由于 HVT 基因组与 MDV 基因组显示出相 对较低程度的序列同一性 ( 约 70％ )， 靶向 MDV 基因组上位点的 miRNA 序列很有可能不会 显著影响基于 HVT 的病毒疫苗的复制。 另一方面， 血清型 1 病毒株， 如 Rispens 疫苗诱导更有效的免疫应答， 特别是针对 高毒力的 MDV 株。本发明基于已建成的 MD 疫苗的抗 -MD 病毒具有如下优点， 即其将抗 -MD 免疫应答的诱导作用与通过 RNAi 对 MDV 复制的抑制作用相结合。为了最大化前一作用， 理 想的是使用血清型 1 疫苗。
尽管血清型 1 疫苗如 Rispens 与 HVT 相比与 MDV 有更高的序列同一性程度， 其仍 然可能设计表达 miRNA 分子的疫苗， 所述分子阻断 MD 的复制， 而不是疫苗的。例如， 一旦选 择了在 MDV 基因上的靶序列， 在疫苗基因组中的相应的序列可以进行突变以减少与 MDV 基 因的同一性程度。这使 miRNA 序列不太会可能识别疫苗基因组序列。定向诱变可用于改变 与靶序列具有高同一性程度的疫苗基因组的任何部分中的碱基。
为了避免对疫苗自身有任何影响的突变， 可以引入沉默突变以改变 DNA 序列， 但 不影响翻译出的蛋白质的氨基酸序列。这样的突变是可能的， 因为遗传密码有简并性。
疾病
本发明的经修饰的疱疹病毒载体可以用于治疗和 / 或预防疾病。
这里所用的 ‘治疗’ 是指为了改善、 治愈或减少疾病的症状， 或减少或停止疾病的 进展而对患病的受试者进行的处理。
术语 ‘预防’ 意指避免、 延缓、 阻止或妨碍疾病的传染。例如， 本发明的疫苗可以用 于预防受试者中的自身免疫疾病或变态反应。
所述疾病可以是传染病， 如传染性病毒病。哺乳动物受试者 ( 如人 ) 的传染性病 毒病， 包括， 但不限于， AIDS、 水痘 (varicella)、 感冒、 登革热、 单纯疱疹、 带状疱疹 (herpes roster)、 流感、 麻疹、 传染性单核细胞增多症 ( 腺热 )、 腮腺炎、 Noro 病毒 (norovirus)、 脊 髓灰质炎 (polio)、 狂犬病、 风疹、 SARS、 病毒性脑炎、 病毒性胃肠炎、 病毒性脑膜炎、 病毒性 肺炎、 西尼罗河病和黄热病。
鸟类受试者 ( 如鸡 ) 的传染病包括， 但不限于 ： 禽流感、 传染性囊病、 鸡贫血、 新城
疫、 传染性支气管炎、 呼肠病毒感染、 传染性喉气管炎、 禽痘。
具体而言， 所述疾病可由疱疹病毒引起。
疱疹病毒科包括已知八种不同的引起人类疾病的病毒， 如下表所示 ：
在动物病毒学中， 最重要的疱疹病毒可以总结如下 ： ● α- 疱疹病毒亚科 (Alphaherpesvirinae) ○单纯病毒属 (Simplexvirus) ■牛疱疹病毒 2 引起牛的乳头炎和伪皱皮病。 ■猕猴疱疹病毒 1， 也称作疱疹 B 病毒， 引起猕猴的单纯疱疹样疾病。 ■ Ateline 疱疹病毒 1， 蜘蛛猴疱疹病毒。 ○水痘病毒属 (Varicellovirus)■牛疱疹病毒 1 在牛中引起牛的传染性的鼻气管炎、 阴道炎， 龟头包皮炎和流产。 ■牛疱疹病毒 5 引起牛的脑炎。 ■山羊疱疹病毒 1 引起山羊的结膜炎和呼吸疾病。 ■猪疱疹病毒 1 引起伪狂犬病。 ■马疱疹病毒 1 马的流产。 ■马疱疹病毒 3 引起马的性交疹。 ■马疱疹病毒 4 引起马的鼻肺炎。 ■犬疱疹病毒 1 引起小狗的严重出血性疾病。 ■猫疱疹病毒 1 在猫中引起猫的病毒性鼻气管炎和角膜炎。 ■鸭疱疹病毒 1 引起鸭瘟 (duck plague)。 ○ Mardivirus 属 ■原鸡属疱疹病毒 2 引起马立克病。 ■原鸡属疱疹病毒 3(GaHV-3 或 MDV-2) ■火鸡的疱疹病毒 (HVT) ○ Iltovirus 属 ■原鸡属疱疹病毒 1 引起鸟的传染性喉气管炎。 ● β 疱疹病毒亚科 (Betaherpesvirinae) ○猪疱疹病毒 2 引起猪包含体鼻炎 ● γ 疱疹病毒亚科 (Gammaherpesvirinae) ○ Rhadino 病毒属 (Rhadinovirus) ■狷羚疱疹病毒 1 引起牛的恶性卡他热。 ■牛疱疹病毒 4 ■马疱疹病毒 2 引起马的巨细胞病毒感染。 ■马疱疹病毒 5 或者， 所述疾病可以为变态反应、 自身免疫疾病、 神经学病症、 高血压或癌症。 基于潜在的疱疹病毒 miRNA 的应用列于下表 2 中 ：
受试者
所述受试者可以是哺乳动物受试者， 如人。
或者， 所述受试者可以是禽类受试者， 例如家禽受试者， 特别是鸡。
该技术也可以运用在模式动物中， 如疾病的小鼠模型。
施用
递送系统的选择可根据处理的受试者的数量及种类。 本发明的方法和药物组合物 可用于治疗人或动物受试者。 通常， 医师会决定实际剂量， 其对于单独的受试者会使最合适 的并且其根据特定受试者的年龄、 体重和相应而变化。
哺乳动物受试者
哺乳动物受试者中的施用 ( 递送 ) 途径可包括但不限于以下的一种或多种 ： 口服 ( 例如作为片剂， 胶囊， 或作为摄入性溶液 ) ； 局部的 ； 粘膜 ( 例如鼻腔喷雾或吸入式气溶 胶)； 经鼻 ； 胃肠外 ( 例如通过可注射形式 ) ； 胃肠 ； 脊柱内 ； 腹膜内 ； 肌肉内 ； 静脉内 ； 子宫 内； 眼球内 ； 皮内 ； 颅内 ； 气管内药 ； 瘤内 ； 阴道内 ； 脑室内 ； 脑内 ； 皮下 ； 眼 ( 包括玻璃体内 及前房 ) ； 经皮 ； 直肠 ； 口腔 ； 阴道 ； 硬膜外 ； 舌下或系统性的。
施用的组合物可以任选地包含药学上可接受的载体、 稀释剂、 赋形剂或佐剂。 药学 载体、 赋形剂或稀释剂的选择可以参考预期的施用途径和标准药学实践来选择。所述药物 组合物可以包含任何合适的一种或多种粘合剂、 一种或多种润滑剂、 一种或多种助悬剂、 一 种或多种涂覆剂、 一种或多种增溶剂和其它本领域已知的载体物质作为所述载体、 赋形剂 或稀释剂， 或在所述载体、 赋形剂或稀释剂之外包含它们。
疫苗通常胃肠外地、 通过注射 ( 例如， 皮下或肌肉内 ) 施用给哺乳动物受试者。
对于胃肠外施用， 所述组合物最好以无菌水溶液的形式使用， 该水溶液可以包含 其它物质， 例如足够的盐或单糖以使所述溶液与血液等渗。
禽受试者
对于数量较多的鸟类， 个体施用系统可能是不实际的， 所以通过喷雾施用或经由 饲料或饮用水施用可能更合适。 对于数量较少的鸟类， 可以单独处理每只鸟， 其通常导致更均匀的剂量。 单独施用 方法包括滴眼液施用、 鼻内施用和胃肠外递送。
根据不同的递送体系， 存在不同的组合物 / 配制物要求。作为一个例子， 本发明的 组合物可以配制成通过口服途径 ( 例如， 在饮用水或饲料， 或者通过喷雾应用 )、 通过粘膜 途径、 或胃肠外地递送， 其中将所述组合物配制成可注射的形式， 用于递送， 通过， 例如， 静 脉内、 肌肉内或皮下途径。
所述组合物可以配制用于卵内或孵化后递送。
术语 “卵内” 指的是进入包含有生命的、 发育中的胚的鸟蛋中。
术语 “在卵内施用” 或 “卵内施用” 指的是将疫苗施用至包含有生命的、 发育中的 胚的鸟蛋中， 其通过任何穿透蛋壳并引入疫苗的手段进行。 这样的施用手段包括， 但不限于 注射疫苗。
各种卵内施用方法在本领域内已知。注射方法可以包括如下步骤 ： 使用适当的针 在卵较大的一端在卵壳上制造一个孔以使蛋的气室暴露， 插入与注射器连接的针并穿过气 室的膜， 然后将疫苗注射入卵。注射的位置可以在卵或胚的任何区域内。优选地， 通过卵较 大端的中心轴向地进行向膜内的注射。
可以使用自动卵注射系统。这种系统在本领域内已知 ( 参见， 例如， 美国专利号 4,681,063、 4,040,388、 4,469,047 和 4,593,646)。
用于鸟类的孵化后接种系统包括喷雾应用和通过饲料或饮用水施用。
对于喷雾应用， 可以使用特别的盒 (cabinet)。鸡可以在孵化处接种， 因为喷雾器 使得均匀分配成为可能。为装有 100 只鸡的每个盒递送一定量的喷雾 ( 如 20m1)。鸡 “用 嘴梳理” 以清洁并干燥它们的羽毛并摄取疫苗。与疫苗混合的红色染料得到它们的注意并 刺激它们用嘴梳理， 并且也指示那些鸡盒已经接种。
通过饲料 / 饮用水的施用不如喷雾均匀， 因为鸟的摄取之间存在差异。还存在可
能的污染问题。然而， 这种类型的施用对于更老的鸟是可行的 ( 即， 当孵化处应用不可行 时 )。
在将组合物通过胃肠粘膜以粘膜方式递送的情况下， 应该能够在通过胃肠道传送 的过程中保持稳定 ； 例如， 应该对蛋白水解性降解有抗性， 对酸性 pH 稳定并对胆汁的去污 作用有抗性。
方法
在第二方面， 本发明提供一种根据本发明的第一方面产生载体的方法， 包括在编 码疱疹病毒序列的基因组 miRNA 中引入一个或多个突变的步骤。
为了使 pri-miRNA 形成茎环结构， 可以在编码形成茎环结构的茎的链的序列中制 造对称的突变。
该突变可以是添加、 取代或缺失。 单个突变即点突变可以例如通过定向诱变产生。 在另一方面， 如果需要制造多个突变以取得需要的序列， 在外源序列中进行切除和连接可 能更简单。
术语 “外源 / 外来” 表示 miRNA 编码序列与内源序列不同， 且其产生一种不同的、 异源的 miRNA。 取代各个链编码序列的外源序列可包括故意错配以使经修饰的 pre-miRNA 模拟 天然 pre-miRNA 的结构特征。
在一个实施方式中， 本发明的方法包括如下 ：
(i) 疱疹病毒 miRNA 序列的扩增 ；
(ii)miRNA 的突变 ；
(iii) 包含编码经修饰的 miRNA 的基因组序列的突变疱疹病毒载体的生成。
突变细胞株可以通过本领域已知的方法产生， 如 BAC 诱变。
现在将通过实施例的方法进一步描述本发明， 所述实施例意在提供用于帮助本领 域普通技术人员实施本发明， 而非意在以任何方式限制本发明的范围。
实施例 实施例 1- 对 MDV1-miR-M8-13-6-7-10 簇的修饰
1 型马立克病病毒 (MDV-1) 编码簇集在所述病毒基因组的 MEQ 和 LAT 区中的 13 个 miRNA(Yao 等 (2008)J.Virol 82 ： 4007-4015)。 所有 13 个 MDVpre-miRNA 的预测的二级结构 显示在图 1 中。 各个 miRNA 的基因组定位显示在图 2 中。 这些包括定位在 ‘a- 样 (a-like)’ 序列和 LAT 的大内含子内的 ICP4 之间的 MDV1-miR-M8-13-6-7-10 簇。在由该簇编码的五 种 miRNA 中， miR-M13 和 miR-M10 以非常低的水平表达。带有 miRNA 序列的所述簇的完整 序列显示在图 3 中。
簇区通过 PCR 扩增并克隆入载体内以有助于操作。将 MDV-1 miR-M7 微小 RNA 突 变以将其修饰成如图 4 中所示的萤光素酶 siRNA。对 miR-M6 也进行相似诱变。
实施例 2- 报道基因的沉默
MDV 的突变克隆通过 BAC 诱变生成， 并测试了所述经修饰的 miRNA 对萤光素酶表达 的沉默效果。独立地对 miR-M6 重复了相似的流程。运用这种经修饰的 miR-M7 和 miR-M6 的初步结果证明了 miR-7-hRluc-22 和 miR6-hRluc19 构建体有沉默萤光素酶报告基因的功
能。 方法
在 miR-7 基因座含萤光素酶 shRNA 的用于萤光素酶测定法的构建体
合成的 miR-LAT 序列的特征为两个 BsmBI 限制位点， 在 DNA 两条相对链上各有一 个， 以允许插入退火的 DNA 寡核苷酸用于替代 miR-6。为了替代 miR-7， 将两个 AarI 限制位 点 ( 也在 DNA 两条相对链上 ) 用于插入退火的 DNA 寡核苷酸。将所述 shRNA 构建体克隆入 pEGFP 载体以驱动由 pCMV 启动子启动的表达。
简言之， 用 AarI 消化 miR-LAT-HPC 载体， 凝胶纯化并与编码花虫萤光素酶 shRNA 的经退火的互补 DNA 寡核苷酸一起用于连接反应 ( 见下文 )。对所有重组质粒进行 DNA 测 序以确证萤光素酶的插入。
pN1-miR-LAT-HPC miR-7 基因座
BamHI AarI
AACGCTCCAAG TGGCAGGTGCGGATCCGCACCTGCA TTTG GGGGA
TTGCGAGGTTC CTCT ACCGTCCACGCCTAGGCGTGGACGT CCCCT
AarI
用于生成萤光素酶 shRNA 的寡核苷酸
5 ′ -GAGAAC GTTGATGAAGGAGTCCAGCTCG TCTCTCCTACCAGCAAC CGAACTGGACTACTTCATGAAC GTT-3′
5 ′ -CAAAAAC GTTCATGAAGTAGTCCAGTTCG GTTGCTGGTAGGAGAGA CGAGCTGGACTCCTTCATCAAC GT-3′
注意 ： 寡核苷酸中带下划线的序列代表插入 AarI 位点所需的突出端。
DNA 转染和萤光素酶的测定
将品系 0 鸡胚成纤维细胞 (CEF)- 衍生型 DF-1 细胞系培养在补充有 10％胎牛血清 (FCS) 和 1％丙酮酸钠的 DMEM 培养基中。 在 24 孔板中用 Lipofectamine 2000(Invitrogen) 根据制造商的方案将萤光素酶报道基因转染至 DF-1 细胞中。简单地说， 在转染前在 24 孔 5 TM 板中接种 (1.1x10 个细胞 / 孔 ) 并保持 24 小时， 并用 500ng psiCHECK -2 载体 (Promega) 共转染 500ng shRNA 表达构建体 ( 和突变对照载体 )。用双萤光素酶 报道测定系统 (Promega) 利用 Lucy 1 发光计 (Anthos Labtec) 连续测定萤火虫与花虫萤光素酶活性。 在 TM 全部实例中， 在 psiCHECK -2 载体中组成型表达的萤火虫萤光素酶活性充当转染效率的标 准化对照。
以上说明书中提及的所有出版物通过提述并入本文。 在不被里本发明的范围和宗 旨的前提下， 对本发明所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易 见的。尽管已经结合具体优选的实施方案对本发明进行了描述， 但应该理解的是要求保护 的发明不应过分地局限于这些特定的实施方式。事实上， 对于为了实施发明而加以描述的 实施方式的多种修改形式对于使用流式细胞术进行细胞研究或相关领域的技术人员是显 而易见的， 意图将这些修改形式也包括在所附权利要求的范围之内。