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1、10申请公布号CN102089000A43申请公布日20110608CN102089000ACN102089000A21申请号200980126533122申请日2009070261/13422420080708USA61K39/00200601G01N33/5020060171申请人默沙东公司地址美国新泽西州72发明人MJ萨瓦奇GG金尼梁小平M奇特伦LB罗森74专利代理机构中国专利代理香港有限公司72001代理人李波刘健54发明名称用于治疗阿尔茨海默病的疫苗57摘要本发明提供了用于治疗患有较严重形式的阿尔茨海默病AD的患者的方法，其中严重形式的AD的特征在于淀粉状蛋白肽A的致病沉积物，所述方。
2、法包括施用能够诱导抗体形式的免疫应答的A的免疫原性片段，所述抗体对于A的致病沉积物，且特别对于A的神经毒性形式，包括A的N末端截短形式是特异性的。本发明进一步提供了用于选择A的合适免疫原性片段的方法，所述片段用于治疗较严重形式的AD。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2011010786PCT申请的申请数据PCT/US2009/0494752009070287PCT申请的公布数据WO2010/005858EN2010011451INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书11页序列表5页附图2页CN102089004A1/1页21治疗患有较严重形式的阿。
3、尔茨海默病AD的患者的方法，该方法包括I确定患者患有较严重形式的AD，和II以有效诱导免疫应答的量施用A的免疫原性片段。2权利要求1的方法，其中患有较严重形式的AD的患者选自简短精神状态检查MMSE得分为20或更低的个体、阿尔茨海默病评定量表认知分量表ADASCOG得分为35或更高的个体、总体衰退量表GDS得分为5期或更高的个体、多套临床痴呆评级总和CDRSB得分为2或更高的个体、在6064岁以下且表现AD症状的个体，或在遗传筛选后诊断患有早发阿尔茨海默病EOAD或家族型AD的个体。3权利要求2的方法，其中所述A的免疫原性片段构成多价疫苗，所述疫苗包括A的多个非邻接的免疫原性片段，所述片段各自。
4、缺乏T细胞表位。4权利要求3的方法，其中所述多价疫苗包括通过赖氨酸支架连接的A310和A2128。5权利要求4的方法，其中所述多价疫苗进一步包括与所述A免疫原性片段缀合的载体。6权利要求5的方法，其中所述多价疫苗与佐剂一起施用。7选择用作疫苗构建体的A的免疫原性片段的方法，所述疫苗构建体适合于治疗患有较严重形式的阿尔茨海默病AD的患者，所述方法包括I以有效诱导免疫应答的量给动物施用A的测试免疫原性片段；和II评估来自被免疫动物的抗血清与A的N末端截短形式的交叉反应性；其中合适的疫苗构建体将选择为能够诱导抗体形式的免疫应答的疫苗构建体，所述抗体对于A的一种或多种N末端截短形式是特异性的。8权利要。
5、求7的方法，其中所述A的N末端截短形式选自AX42、PGLUA340、PGLUA342、PGLUA1140和PGLUA1142，其中X与天然存在的A的残基217对应。权利要求书CN102089000ACN102089004A1/11页3用于治疗阿尔茨海默病的疫苗发明领域0001本发明涉及用于预防和治疗淀粉状蛋白生成疾病且特别是阿尔茨海默病的组合物和方法。0002发明背景0003阿尔茨海默病AD的特征在于进行性记忆损害和认知减退。它的标志病理损害是特定脑区域中的淀粉状蛋白沉积物老年斑、神经原纤维缠结和神经元丧失。淀粉状蛋白沉积物由4043个氨基酸残基的淀粉状蛋白肽A组成，其是淀粉状蛋白前体蛋白质。
6、APP的蛋白水解产物。神经原纤维缠结是高磷酸化蛋白质的细胞内丝状聚集物SELKOE，SCIENCE，275630631，1997。0004AD的发病机理仍未完全了解，但它预期是多因素事件。A在脑组织中的积累和聚集被认为在疾病过程中起关键作用，也称为淀粉状蛋白级联假设GOLDE，BRAINPATHOL，158487，1995。根据这个假设，A，特别是A42，易于形成各种形式的聚集物，范围从小寡聚物到大的延长的初原纤维结构。这些聚集物是神经毒性的，并且被称为负责与疾病早期阶段中的记忆丧失和认知减退相关的突触病理学KLEIN等人，NEUROBIOLAGING，25569580，2004。近期出版物暗。
7、示三重转基因小鼠模型中A的减少也阻止细胞内沉积ODDO等人，PROCNEURON，43321332，2004。这个发现暗示细胞外淀粉状蛋白沉积物可能是后续神经元纤维缠结形成的成因，这可能依次导致神经元丧失。0005用A抗原免疫APP转基因小鼠可以减少脑A沉积物且缓和疾病进展。这首先由SHENK等人，NATURE，400173177，1999报道，并且目前已由大量研究确证，所述大量研究涉及不同转基因动物模型、各种主动疫苗以及用A特异性单克隆抗体被动免疫BARD等人，NATUREMED，6916919，2000；JANUS等人，NATURE，408979982，2000；MORGAN等人，NATU。
8、RE，408982985，2000；DEMATTOS等人，PROCNATLACADSCI，9888508855，2001；BACSKAI等人，JNEUROSCI，2278737878，2002；WILCOCK等人，JNEUROSCI，2337453751，2003。与动物数据一致，来自先前已接受用预先聚集的A142肽作为免疫原AN1792，BETABLOC主动免疫的患者的死后人脑组织的3个公开评估显示老年斑的局部清除NICOLL等人，NATUREMED，9448452，2003；FERRER等人，BRAINPATHOL，141120，2004；MASLIAH等人，NEUROLOGY，64129。
9、131，2005。这些数据共同表明有效引起对A抗原的抗体应答的疫苗对在AD中发现的病理老年斑有效。然而，疫苗或抗体功效的机制仍有待确定。0006使用主动免疫方法治疗AD的最先进研究曾经是使用与佐剂QS21TMANTIGENICS，NEWYORK，NY共同施用的AN1792BETABLOC的II期试验。在2002年1月，当4个患者显示与脑膜脑炎一致的症状时，这个研究终止SENIOR，LANCETNEUROL，13，2002。最后，298个治疗患者中的18个发展脑膜脑炎体征ORGOGOZO等人，NEUROLOGY，614654，2003。在脑炎和抗体滴度之间无关联，并且已报道关于这种效应的可能成因。
10、机制是针对自身免疫原，特别是A42中部和羧基末端部分的T细胞的激活MONSONEGO等人，JCLININVEST，112415422，2003。支持这个结论，来自发展脑炎的两个疫苗接受者的脑组织尸体检查揭说明书CN102089000ACN102089004A2/11页4示在1个患者中CD4T细胞的大量脑膜浸润NICOLL等人，NATUREMED，9448452，2003和在另一个患者中CD4、CD8、CD3、CD5、CD7T细胞的大量脑膜浸润FERRER等人，BRAINPATHOL，141120，2004。部分基于这些发现，基于靶向A的N末端例如A17和A16将提供缺乏T细胞介导的不利事件的功。
11、效的概念，几个临床试验已用主动抗A疫苗起始。0007发明概述0008在一个实施方案中，本发明是治疗患有较严重形式的阿尔茨海默病AD的患者的方法，该方法包括I确定患者患有较严重形式的AD，和II以有效诱导免疫应答的量施用A的免疫原性片段。患有较严重形式的AD的患者选自简短精神状态检查MINIMENTALSTATEEXAMMMSE得分为20或更低的个体、阿尔茨海默病评定量表认知分量表ALZHEIMERSDISEASEASSESSMENTSCALECOGNITIVEADASCOG得分为35或更高的个体、总体衰退量表GLOBALDETERIORATIONSCALEGDS得分为5期或更高的个体、多套临床。
12、痴呆评级总和CLINICALDEMENTIARATINGSUMOFBOXESCDRSB得分为2或更高的个体、在6064岁以下且表现AD症状的个体，或在遗传筛选后诊断患有早发阿尔茨海默病EOAD或家族型AD的个体。A的免疫原性片段构成多价疫苗，所述疫苗包括A的多个、非邻接和非等同的免疫原性片段，所述片段各自具有至少一个抗原决定簇且缺乏T细胞表位。在另一个实施方案中，多价疫苗包括通过赖氨酸支架连接的A310和A2128。多价疫苗进一步包括与A肽片段缀合的载体，并且可以任选与佐剂一起施用。0009在另一个实施方案中，本发明是选择用作疫苗构建体的A的免疫原性片段的方法，所述疫苗构建体适合于治疗患有较严。
13、重形式的阿尔茨海默病AD的患者，所述方法包括I以有效诱导免疫应答的量给动物施用A的测试免疫原性片段；和II评估来自被免疫动物的抗血清与A的N末端截短形式的交叉反应性；其中合适的疫苗构建体将选择为能够诱导抗体形式的免疫应答的疫苗构建体，所述抗体对于A的一种或多种N末端截短形式是特异性的。A的N末端截短形式选自AX42、PGLUA340、PGLUA342、PGLUA1140和PGLUA1142，其中X与天然存在的A的残基217对应。0010附图简述0011图1表示从来自动物的抗血清的连续稀释液中检测的抗体，所述动物用与作为载体的KLH缀合的A18MOVC18的肽缀合物免疫且与一起施用。0012图2。
14、表示从来自动物的抗血清的连续稀释液中检测的抗体，所述动物用与作为载体的OMPC缀合的多价疫苗A310/A2128MVC免疫且与一起施用。0013发明详述0014术语“8聚体”意指与A片段、天然A肽类似物或肽模拟物对应的8氨基酸肽。一个或多个8聚体可以与至少一个间隔区组合，以形成多价线性肽或形成多价分支MAP。0015术语“A缀合物”意指与载体化学或生物连接的A的8聚体或免疫原性片段，所述载体例如匙孔血蓝蛋白或脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白质复合体OMPC。0016术语“A肽”意指本文在疫苗构建体中使用的任何合成与天然存在的淀粉状蛋白肽A比较A肽，包括但不限于线性8聚体、具有至少一个间隔区的多价线性。
15、肽和多价分支多抗原肽MAPS。说明书CN102089000ACN102089004A3/11页50017术语“表位”指抗原上的位点，B和/或T细胞对该位点有应答。B细胞表位可以由邻接氨基酸或通过蛋白质三级折叠而并列的非邻接氨基酸形成。由邻接氨基酸形成的表位一般在暴露于变性溶剂后保留，而由三级折叠形成的表位一般在用变性溶剂处理后丧失。T细胞表位由能够与宿主MHC分子形成复合体的肽组成。负责诱导CD8T细胞应答的人MHCI类分子的T细胞表位一般包括911个氨基酸残基，而负责CD4T细胞应答的人MHCII类分子的表位一般包括12个或更多个氨基酸残基BJORKMAN等人NATURE329506512，。
16、1987；MADDEN等人CELL75693708；BATALIA和COLLINS；ENGELHARDANNUREVIMMUNOL，121812076221995；MADDEN，ANNUREVIMMUNOL，135876221995。与T细胞不同，B细胞能够识别长度小至4个氨基酸的肽。由T细胞受体识别的T细胞表位/MHC复合体导致T细胞激活。0018术语“多价肽”指具有超过一个抗原决定簇的肽。0019术语“多价疫苗”或“MVC”意指包含多种A肽的疫苗构建体，所述A肽各自具有抗原决定簇且缺乏T细胞表位。在一个实施方案中，多价疫苗包括A的两个非邻接、非等同的免疫原性片段，例如A310和A2128，。
17、它们各自缺乏T细胞表位。0020术语“A的免疫原性片段”或“缺乏T细胞表位的A的免疫原性片段”意指能够诱导抗A的抗体形式的免疫应答的8聚体或A片段，但所述应答不包括对自身抗原A的T细胞应答。0021术语“免疫学”或“免疫”或“免疫原性”应答指脊椎动物个体中针对抗原的体液抗体介导的和/或细胞由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导的应答的发展。此应答可以是通过施用免疫原诱导的主动应答或通过施用抗体诱导的被动应答。0022术语“较严重形式的AD”指与年龄对照非AD患者或显示更晚期临床病理学的患者比较，具有与更晚期形式的神经元变性相关的任何形式AD的患者。此类患者包括但不限于简短精神状态检查MMSE得分为。
18、20或更低的个体、阿尔茨海默病评定量表认知分量表ADASCOG得分为35或更高的个体、总体衰退量表GDS得分为5期或更高的个体、多套临床痴呆评级总和CDRSB得分为2或更高的个体、在6064岁以下且表现AD症状的个体，或在遗传筛选后诊断患有早发阿尔茨海默病EOAD或家族型AD特别是与PS1突变相关的那些的个体，或患有特征在于A的致病沉积物的AD形式的患者。0023术语“淀粉状蛋白肽A的致病沉积物”或“A的致病沉积物”意指包括A的神经毒性形式例如A42，或已知与较多神经元变性或较严重临床表型相关的A的N末端或C末端截短形式的斑块沉积物。此类A形式包括但不限于A40、A42、A的N末端截短形式例如。
19、AX42，其中X与天然存在的A的残基217对应，和通过末端氨基酸环化，例如N末端谷氨酸的环化修饰的A的截短形式，即PGLUA342或PGLUA1142。0024术语“致病A沉积物的特异性抗体”指与A的神经毒性形式交叉反应的抗体，所述A的神经毒性形式包括全长A40或A42、A的N末端截短形式、或在末端氨基酸上具有修饰的A的N末端或C末端截短形式，例如PGLUA342或PGLUA1142。0025术语“药物组合物”意指适合施用于哺乳动物个体的化学或生物组合物。如本文使用的，它指任选连同或不连同佐剂一起施用的包括本文描述的8聚体、A的免疫原性片段和A缀合物的组合物。0026淀粉状蛋白肽A的致病沉积物。
20、说明书CN102089000ACN102089004A4/11页60027越来越多的证据显示在AD患者脑中沉积的A在结构上不是均质的SAIDO等人，NEUROSCIENCELETTERS，215173176，1996。除多种形式的全长淀粉状蛋白肽AA40和A42外，已检测出在肽的N末端和C末端上具有修饰的A的多种截短形式RUSSO等人，FEBSLETTERS，409411416，1997；SAIDO1996。越来越多地认为这些A的截短形式在AD发展中是关键的PICCINI等人，J，BIOLCHEM，280403418634192，2005。在这些A的截短形式中，从残基GLU3或GLU11上的焦。
21、谷氨酰开始的N末端截短的肽占优势RUSSO，1997。PGLU3形式A3PE42特别普遍，包括总A的约50YOUSSEF等人，NEUROBIOLAGING，2913191333，2008。0028已发现这些N末端截短形式在诊断患有散发性AD的患者的脑中、在早发家族性ADEOAD患者最特别地具有早老蛋白1PS1突变的那些中和在患有唐氏综合征DS的患者中早期积累RUSSO等人，FEBSLETT，409411416，1997；SAIDO等人，NEUROSCI，LETT，215173176，1996；TEKIRIAN等人，JNEUROPATHOLEXNEUROL，577694，1998。与患有不含突变。
22、的散发性、晚发ADLOAD的患者比较，患有由PS1突变驱动的EOAD的个体一般在6064岁前发展疾病症状。此外，患有唐氏综合征DS的患者由于其21号染色体与某些遗传形式的AD相关的基因位于同一染色体的额外拷贝也发展EOAD，导致多30的APP和增加的A产生。家族性丹麦痴呆是另一种形式的早发痴呆，其特征在于大的、几乎独占的PYROGLUN末端修饰A的比例TOMIDOKORO，等人，JBIOLCHEM，280443688336894，2005。与LOAD比较，由于PS1突变或携带DS，展示EOAD的个体在其脑中携带明显更多的PGLUA342RUSSO，1997；RUSSO等人，NATURE，405。
23、531532，2000；RUSSO等人，NEUROBIOLDIS，8173180，2001；HOSODA等人，JNEUROPATHOLEXPNEUROL，5710891095，1998。更重要的是，如尸体组织分析所测定的，具有更大比例的N末端截短形式，特别是占优势的PGLUA342形式的患者，获得在神经元变性程度和临床病理学严重性方面较严重的疾病RUSSO，1997；RUSSO2000。0029评估个体的AD或痴呆一般将包括某些形式的精神或认知评估，这可以通过各种方法进行，包括阿尔茨海默病评定量表认知分量表ADASCOG、总体衰退量表GDS、多套临床痴呆评级总和CDRSB或更典型地，简短精神状。
24、态检查MMSE。MMSE得分最大值是30，其中得分一般分类为轻度2126、中度1520和重度14或更低。ADASCOG的得分范围从0最可能到70最不可能，其中23附近的得分是轻度损伤的截止值，并且约35或更高的得分与中度和更高的损伤相关。CDR的得分最大值是4，其中得分分类为正常0、轻度051、中度2和重度34。类似地，GDS的得分从1期最佳到7期最差，其中4期与轻度损伤的约225的ADASCOG得分相似，并且5期与中度损伤的约35的ADASCOG得分相似。关于与AD和痴呆相关的MMSE的一般讨论，参见，FOLSTEIN等人，JPSYCHIAT，RES，12189198，1975。关于ADAS。
25、COG、MMSE和GDS评分和有效性的比较，参见DORAISWAMY等人，NEUROLOGY，48615111517，1997。ADASCOG和MMSE一般已被接受用于在临床试验中评价功效中使用。待考虑的另一种因素将是个体的家族史，即另一个或多个紧密相关的家族成员是否具有视为重度的AD形式。为了证实由于FAD突变导致的EOAD的存在，可以对来自患者的白细胞的基因组DNA执行序列分析FINCKH，等人，AMJHUMGENET，66110117，2000。因此，展示早期、迅速发展形式的AD或痴呆例如EOAD或FAD的个体，特别是在6064岁以下的个体，或MMSE评分20或更低的个体将被说明书CN1。
26、02089000ACN102089004A5/11页7视为患有较严重形式的AD，并且预期具有特征在于致病性淀粉状蛋白沉积物的斑块，包括N末端截短形式，并且将是本文多价疫苗的候选人。0030申请人在本文中已发现包括A的多个免疫原性片段的疫苗构建体提供更有效方法来治疗AD患者，所述AD患者患有与A的N末端截短形式相关的较严重形式的AD。多价疫苗是广谱疫苗，因为它能够治疗患有含斑块的AD形式的患者，所述斑块不仅包含与AD相关的A的全长形式，还包括A的N末端截短形式。本发明的多价疫苗能够与多种和更多形式的神经毒性A特别是就N末端截短形式而言交叉反应。申请人在本文中首次显示包括A的多个非邻接、非等同免疫。
27、原性片段，缺乏T细胞表位的多价疫苗，可以更有效地用于治疗AD，特别是以下那些患者其具有已知与在神经元变性和临床病理学方面较严重形式的疾病相关的A种类。0031治疗较严重形式的AD的疫苗构建体0032申请人在本文中已令人惊讶地发现包括缺乏T细胞表位的A的多个免疫原性片段的疫苗构建体本文称为多价疫苗可以提供广谱疫苗，以治疗患有较严重形式的AD的患者，且特别是具有A的致病沉积物的患者，所述沉积物包括A的N末端截短形式。由于在文献中报道的其他抗A疫苗构建体看起来针对A的单个免疫原性片段，本发明提供有利和更有效的疫苗，用于靶向已知与A的N末端截短形式的存在相关的那些AD形式。0033在相关共同未决的申请。
28、中，申请人已描述了肽缀合物的组合物和使用该肽缀合物来治疗AD的方法，所述肽缀合物包括缺乏T细胞表位并且能够诱导抗A抗体形式的有益免疫应答的A的免疫原性片段PCT/US2006/016481、WO2006/121656；USSN11/919,897、US20090098155，其教导引入本文，如同详尽阐述一样。其中的疫苗组合物包含A的免疫原性片段，所述免疫原性片段的大小限制为8个氨基酸8聚体，并且设计为去除任何潜在的C末端T细胞表位锚定残基。A的免疫原性片段可以是8聚体线性肽、具有至少一个PEG间隔区的多价线性A缀合物或多价分支多抗原肽MAP。在一个优选实施方案中，疫苗构建体是包括在赖氨酸支架上。
29、连接的A310和A2128的分支MAP。0034其中在主动免疫方案中使用以治疗AD的疫苗构建体可以以药物组合物形式施用，其中MAP的免疫原性片段可以与载体化学或生物连接，所述载体例如血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白KLH、免疫球蛋白分子、卵白蛋白、破伤风类毒素蛋白质，或来自其他致病细菌例如白喉、大肠杆菌、霍乱或幽门螺杆菌HPYLORI的类毒素，或减毒的毒素衍生物。在一个优选实施方案中，载体是脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白质复合体OMPC。0035其中在主动免疫方案中使用以治疗AD的疫苗构建体可以与佐剂一起施用，所述佐剂例如明矾ALUM、脂质例如3脱O酰化单磷酰脂质A3DMPL或基于皂苷的佐剂。在一个优选实。
30、施方案中，佐剂是基于皂苷的佐剂CSLLTD，PARKVILLE，AUSTRALIA。0036申请人在本文中已令人惊讶地发现其中肽缀合物的优选实施方案，即包括用赖氨酸支架连接的A310和A2128且与OMPC缀合的分支MAP的多价疫苗目前提供广谱主动疫苗用于治疗AD。这种多价疫苗MVC的结构如下0037说明书CN102089000ACN102089004A6/11页80038其中“AHA”表示6氨基己酸，并且“BRAC”表示溴乙酰。0039申请人在本文中已显示这种广谱MVC提供相对于目前正在进行临床评价的其他主动疫苗方法的优点。这种多价疫苗不仅已显示提供与A的多种形式且特别是与较严重形式的AD相。
31、关的A的N末端截短形式特异性交叉反应的抗体形式的免疫应答，它还提供更强的免疫应答，因为当X3时，A18疫苗不产生对AX42的任何免疫应答。因此，本文中的多价疫苗能够提供比在临床考虑下的其他主动疫苗更佳的、对A的N末端截短形式的免疫原性，即更广谱的应答。0040用于治疗较严重形式的AD的治疗剂0041申请人用多价疫苗构建体免疫豚鼠，所述构建体即包括经由赖氨酸支架连接的A310和A2128的分支MAP本文称为多价疫苗构建体MVC，其与载体OMPC缀合且与基于皂苷的佐剂一起施用。免疫的动物产生多克隆抗体形式的免疫应答。从动物中抽取血清，并且使抗血清系列稀释且测试对A的众多形式的交叉反应性，所述A的众。
32、多形式包括全长A40和A42、和表1中列出的A的N末端截短形式。0042类似地，申请人用与天然存在的A的氨基酸残基18对应的合成的单价A肽本文称为单价疫苗构建体MOVC18免疫豚鼠，所述合成的单价A肽与载体KLH缀合且与基于皂苷的佐剂一起施用。依据信息和信心，认为目前正在进行临床评估的其他主动疫苗采用与分别缀合于CRM197或VLP的A17和A16对应的类似单价疫苗构建体。A17/CRM197疫苗构建体被认为与基于皂苷的佐剂QS21一起施用，而A16/VLP构建体不与佐剂一起施用。0043目前在用于AD的临床试验中的主动疫苗包括A序列的N末端残基1，并且长度为67个氨基酸。与之形成对比，由申请。
33、人利用的MVC包括与A残基3对应且在残基10处终止的A的免疫原性片段，和与残基21对应且在残基28处终止的A的第二个免疫原性片段。如本文证实的，与采用从A残基1开始的肽的其他主动疫苗方法比较，这种MVC识别更多A的N末端截短形式。不希望受任何理论束缚，认为在WO2006/121656中描述的其他多价疫苗构建体将以相似特异性执行。本领域普通技术人员将认识到且理解多价8聚体抗原的使用将产生代表可以掺入如本文描述的疫苗构建体内的任何片段长度的应答，条件是该片段长度能够产生所需多克隆免疫应答，而不刺激针对T细胞应答的抗原。因此，在备选实施方案中，本文描述的本发明可以包括A片段，包括但不限于7聚体、6聚。
34、体、5聚体和4聚体。0044在进行本文实验前，申请人寻求基于疫苗构建体的组合物预测，来自接种的动物的抗血清将与A的何种形式交叉反应，即全长或N末端截短形式。与来自多价疫苗构建体A310/A2128MVC和单价疫苗构建体A18MOVC18所交叉反应的抗血清的实际种类比较，这些预测在表1中显示。每种A形式的交叉反应性程度也显示于图1和2中。如由图1和2显而易见的，与MOVC18构建体比较，本文描述的MVC不仅识别更大量的N末端修饰的A肽，它还与和最严重形式的疾病最相关的形式且特别是PGLU3A342具有更大的交叉反应性。最简洁地，这个数据证实与包括等于或少于8个氨基酸的肽的疫说明书CN102089。
35、000ACN102089004A7/11页9苗比较，多价疫苗可能诱导能够与从游离N末端开始的截短形式A1X结合的抗体。0045表100460047虽然与从残基1开始的肽比较，几种N末端截短的A肽毒性更高或毒性相等，但特别是一种肽的毒性高几个数量级；从残基3开始并且通过谷氨酰胺酰环化酶修饰的A，命名为PYROGLU3APGLU3A342。这种A的截短形式的优势已显示与神经元变性的强度和临床表型的严重性成正比YOUSSEF等人，NEUROBIOLOGYOFAGING，2913191333，2008。申请人已证实在用单价疫苗MOVC18免疫后由哺乳动物产生的血清不与毒性种类PGLU3A342相互作用。
36、。本领域技术人员也将理解且认识到目前临床试验中使用的较短肽免疫原A17和A16也将无法识别PGLU3A342形式。用其他多价疫苗例如包括A38和A2128的那些疫苗进行免疫，也将预期识别A的N末端截短形式，以及在各种羧基末端终止的那些A，包括38、40和42，这是最常见的C末端截短形式。0048如由这种交叉反应性证实的，要求保护的发明解决了患阿尔茨海默病的脑的斑块中存在的多种A的N末端截短形式的存在所导致的较严重形式的AD的临床问题。不希望受任何理论束缚，采用包括N末端残基1且长度限制于6或7个氨基酸的肽的AD疫苗，例如目前正进行临床评估的那些AD疫苗的一种可能局限性，是更可能并不是说必然它们。
37、在体内产生仅针对这些有限的A形式，特别是仅针对包括N末端残基的那些A形式的免疫应答。在优选形式中，将希望AD疫苗诱导与A的所有N末端截短形式以及包括残基1的形式特异性交叉反应的抗体形式的免疫应答。由于A的N末端截短形式与说明书CN102089000ACN102089004A8/11页10较严重形式的AD相关，所以这种更广泛的识别将预期允许在限制较少的临床群体中使用。因此，本领域技术人员应当理解且认识到在本文中要求保护的发明，即使用包括与A310和A2128对应的A的免疫原性片段的疫苗例示的多价疫苗的使用所述多价疫苗识别A的所有N末端截短形式将能够对患有较严重形式的AD的患者进行比单价疫苗提供的。
38、治疗更有效的治疗，所述单价疫苗仅识别包括N末端残基1的那些A形式。根据这个原理，用A16或A17免疫的患者将不会受到与用MVC接种的那些患者相同程度的保护，并且特别是将不受到避免A的N末端截短形式的毒性作用的保护。0049治疗方案0050用于治疗性处理较严重形式的AD和其他淀粉状蛋白疾病的本文多价疫苗的有效剂量将依赖于许多因素而改变，所述因素包括但不限于施用方式、靶部位、患者的生理学状态、施用的其他药物、和处理是治疗性的，即在疾病症状发作后，还是预防性的，即阻止疾病症状发作。在一个优选实施方案中，患者是人并且治疗剂要通过注射施用。0051待采用的免疫原或治疗剂的量也将依赖于佐剂是同时还是顺次施。
39、用，其中在不存在佐剂的情况下采用更高的剂量。0052待施用的免疫原或治疗剂的量将不同，但范围为每次注射0550G肽基于A肽含量的量考虑用于人使用。本领域技术人员将了解如何配制包括本文描述的抗原类型的组合物。0053施用方案将由以设定间隔进行的初次免疫以及随后的加强注射组成。初次免疫和加强免疫之间的间隔、加强注射之间的间隔、和加强免疫的次数将依赖于由疫苗引起的抗体滴度和持续时间。它还将依赖于抗体应答的功能性效力，即在AD患者中阻止AD发展或发挥疗效所需的抗体滴度水平。典型的方案将由在1、2和6个月时的起始注射组组成。另一种方案将由在1和2个月时的起始注射组成。对于任一方案，加强注射将每6个月或每。
40、年给予，这取决于抗体滴度和持续时间。施用方案也可以基于需要，这是通过监测患者中的免疫应答确定的。0054用于在治疗较严重形式的AD中使用的A的免疫原性片段的选择0055本领域技术人员应当理解本发明还提供了鉴定能够产生抗体形式的免疫应答的新疫苗，所述抗体与A的N末端或C末端截短形式广泛且特异性交叉反应。在一个实施方案中，A的测试免疫原性片段，即测试疫苗构建体，将用于免疫动物例如豚鼠或其他啮齿类动物。疫苗构建体可以进一步包括缀合物，其中肽构建体与蛋白质载体缀合。疫苗构建体也可以任选与佐剂一起施用，以改变免疫应答的性质和/或幅度。将评估来自被免疫动物的抗血清中通过用构建体接种而产生的多克隆抗体的存在。
41、，所述构建体与A的一种或多种截短形式包括但不限于PGLUA342、PGLUA1142、PGLUA340或PGLUA1140特异性交叉反应，所述交叉反应通过ELISA或其他形式测量。产生广泛和特异性交叉反应性的疫苗构建体将选择用于治疗患有较严重形式的AD或特征在于A的截短形式的相关病症的患者。因为疾病严重性与N末端截短种类的A的存在成正比，所以本领域普通技术人员应认识到且理解基于患者的认知得分、遗传筛选或临床观察鉴定的显示较严重形式的AD的患者，将特别反应于治疗。0056实施例10057A肽和免疫原的制备说明书CN102089000ACN102089004A9/11页110058除A42外，本文。
42、使用的肽都购自ANASPEC，SANJOSE，CA。这些肽的列表在表2中给出。A42如实施例1B中所示制备。0059表200600061BA142和其他A肽的制备0062从RINKAMIDEMBHA树脂开始，使用如由制造商APPLIEDBIOSYSTEMS，FOSTERCITY，CA供应的FMOC化学方案，在自动化肽合成仪上通过固相合成制备A142肽。在组装后，使用945三氟乙酸、251，2乙二硫醇、1三异丙基硅烷和25H2O的混合物，使树脂结合的肽去保护且从树脂中切割下来。在2小时处理后，将反应过滤，浓缩且用乙醚研磨所得到的油。使固体产物过滤，溶解于50乙酸/H2O中且冷冻干燥。使用C18载。
43、体上的01TFA/H2O/乙腈梯度，通过RPHPLC达到半纯化产物的纯化。通过分析HPLC评估馏分。将纯级分98合并且冷冻干燥。通过氨基酸分析和质谱分析证实特性。0063使用相似FMOC化学在ANASPEC，SANJOSECA合成所有其他肽。0064CA18KLH缀合物的制备0065使A肽8聚体，2MG悬浮于1ML商购马来酰亚胺缀合缓冲液83MM磷酸钠、01MEDTA、09MNACL、002叠氮化钠，PH72PIERCEBIOTECHNOLOGY，ROCKFORD，IL中。将商购马来酰亚胺活化的KLHPIERCEBIOTECHNOLOGY，ROCKFORD，IL的2MG样品加入肽中，并且使其在。
44、25下反应4小时。通过使用100,000DA透析管针对PBS缓冲液进行彻底透析，使缀合物与未反应的肽和试剂分离。通过氨基酸分析和随后的70小时酸水解评估掺入说明书CN102089000ACN102089004A10/11页12缀合物内的肽量。肽浓度测定为024003MG/ML。0066D溴乙酰化A3102128的合成0067使用双偶联方案用于在APPLIEDBIOSYSTEMS430A型自动化合成仪上引入氨基酸，通过标准TBOC固相合成制备溴乙酰化肽。在羧基末端FMOCLYSIVDDEOHIVDDE1，4，4二甲基2，6二氧代亚环己基3甲基丁基与MBHA树脂偶联后，使用哌啶去除氨基FMOC保护。
45、基，并且通过引入TBOCLYSFMOCOH继续进行合成。在TBOC基团去保护后，用下述TBOC保护的氨基酸延伸序列AHA、Y、G、S、D、H、R、F、E，并且通过在ABI合成仪上偶联乙酸给氨基末端加帽。用哌啶去除侧链赖氨酸FMOC保护基，并且通过引入下述受保护的氨基酸在ABI合成仪上延伸赖氨酸的N臂AHA、K、N、S、G、V、D、E、A，并且通过偶联乙酸使氨基末端加帽。通过用二甲基甲酰胺中的5肼处理5分钟而去除IVDDE保护基，提供在羧基末端赖氨酸上的未封闭N氨基基团。N氨基基团在作为溶剂的二氯甲烷中与溴乙酸酐反应30分钟。通过用作为清除剂的液体氢氟酸和10茴香醚处理，实现肽从树脂载体中的取出。
46、。使用01TFA/乙腈梯度，在反相C18二氧化硅柱上通过制备HPLC纯化肽。通过分析HPLC和质谱分析证实肽的特性和均一性。0068实施例20069豚鼠抗A肽血清的产生0070610周龄的雌性豚鼠得自CHARLESRIVER，INC，RALEIGH，NORTHCAROLINA，且依照机构指南维持在MERCKRESEARCHLABORATORIES的动物设施中。所有动物实验得到MERCKRESEARCHLABORATORIESINSTITUTIONALANIMALCAREANDUSECOMMITTEEIACUC批准。A肽缀合物A18MOVCA18KLH和A3102128MVCOMPC分别用100。
47、G/MLCSL，LTD，PARKVILLE，AUSTRALIA和100G/ML450G/MLMERCK铝明矾配制。基于肽含量的最终抗原浓度对于A18KLH和A3102128OMPC分别是8G/ML和4G/ML。2只豚鼠用400L每种缀合物以4周间隔肌内免疫2次，并且在第二次免疫后的3和4周之间收集血样。使来自每个组的血清样品合并且贮存于4直至使用。0071实施例30072豚鼠抗血清与各种形式的A肽的结合0073通过酶联免疫吸附测定ELISA执行豚鼠抗血清与全长和N末端截短的A肽的结合活性。在4下以在PBS中4G/ML的浓度用50L/孔的表2中所示各种A肽包被96孔板IMMUNO96MICROW。
48、ELLTMPLATE，THERMOFISHERSCIENTIFIC，ROCHESTER，NY过夜。平板用包含005TWEEN20的PBSPBST洗涤6次，且用在PBST中的3脱脂乳乳PBST封闭。豚鼠抗血清在乳PBST中以系列4倍稀释制备。每个孔中加入100L稀释的抗血清，并且使平板在室温下温育2小时，随后用PBST洗涤3次。每个孔加入50L在乳PBST中15000稀释的HRP缀合的山羊抗豚鼠第二抗体JACKSONIMMUNORESEARCH，WESTGROVE，PA，并且随后在室温下温育1小时。将平板洗涤6次，随后加入100L/孔的3，3，5，5四甲基联苯胺TMBVIROLABS，CHANT。
49、ILLY，VA。在室温下温育35分钟后，通过每个孔加入100L终止溶液VIROLABS，CHANTILLY，VA终止反应。平板在VERSAMAXTM微量滴定板读数器MOLECULARDEVICES，SUNNYVALE，CA中在450NM下读数。0074这种测定的结果图解显示于图1和2中，所述附图针对抗MOVCL8和MVC的豚鼠说明书CN102089000ACN102089004A11/11页13血清评估各种A肽。所述图使用来自针对每种肽一式三份进行的每种测试样品的平均吸光度。说明书CN102089000ACN102089004A1/5页1400010002序列表CN102089000ACN102089004A2/5页150003序列表CN。