BGIos372 基因及其用途 【技术领域】
本发明涉及一种基因， 特别是涉及 BGIos372 基因， 及其促进植物、 特别是单子叶 植物籽粒变大的用途及方法。背景技术
水稻 (Oryza sativa) 是全世界最重要的粮食作物之一， 全世界约 30 多亿人口以 稻米为主食 (Delseny M et al， 2001)。 水稻也是我国第一大粮食作物， 其面积、 单产和总产 量均居首位， 水稻生产在我国国民经济中具有举足轻重的地位。随着人口增长和人民生活 水平的提高， 市场对优质稻米有更大需求。 粮食生产不但要提高品种的产量潜力， 更要注重 品质的改良， 而水稻粒型 ( 粒长、 粒宽和长宽比 ) 和千粒重会影响稻米外观、 产量及市场价 值。 因此， 选育大粒优质的水稻新品种已成为水稻育种的一个主要目标， 发掘控制水稻粒型 和千粒重的主要基因是当前遗传学家和育种家们共同关注的焦点。 这对提高稻谷产量和稻 米市场的竞争力具有重要意义。
水稻产量主要由千粒重、 有效穗数和每穗粒数决定。据国内外研究， 在构成水稻 产量的三要素中， 千粒重也即谷粒重量的遗传比较稳定， 其变异系数为 40％～ 60％。菲律 宾国际水稻研究所研究认为， 增加粒重可提高水稻产量 30％以上 ( 姚国新和卢磊， 安徽农 业科学， 2007， 35(27) ： 8468-8478)。从代谢生理和形态学上看， 高产必须具备两个条件， 即高水平的代谢源和足够大的贮藏库， 其中后者表现在粒数多和谷粒大， 即对光合产物有 较大的容纳力。基于以上分析， 想实现水稻产量的进一步飞跃， 提高粒重的途径是值得重 视的， 提高粒重是提高粮食产量的有效途径 ( 熊振民和孔繁林， 江苏农业科学 4， 1981， 48 ： 25-30)。
水稻千粒重由谷粒长度、 宽度和厚度三者决定， 是一个典型的受多基因控制的数 量性状遗传。克隆控制粒重的主要基因并加以改造利用是提高粮食产量的有效方法。目前 水稻的全基因组测序工作已经完成， 在水稻上已经积累了相当详细的资料， 为水稻重要性 状基因的定位克隆提供了便利。但是关于水稻粒重的基因定位克隆任务依然艰巨 ( 姚国新 和卢磊， 安徽农业科学， 2007， 35(27) ： 8468-8478)。
当前， 已经定位的粒重数量性状位点多达 89 个， 分布于水稻的所有 12 条染色体上 ( 玛丽莲， 中国农业科学院， 硕士学位论文， 2007)。徐建龙等 ( 中国水稻科学， 2002， 16(3) ： 6-10) 应用 292 个 Lemont/ 特青的重组自交系 (RILs) 检测到影响千粒重的 11 个作物数 量性状位点 (quantitativetraitlocus， QTL)， 分别位于第 1、 2、 3、 4、 5、 10 和 12 染色体上， 联合贡献率为 53.9％。林荔辉和吴为人 ( 分子植物育种， 2003(1) ： 337-342) 利用以两个 釉稻品种 H 359 和 Acc8558 为亲本杂交建立的重组自交系群体检测到 16 个与粒重有关的 可解释 81.40％的表型变异， 分布在 8 条不同的染色体上， 其中有 5 个分布在第 3 染色 QTL， 体上。美国康奈尔大学选用热带粳稻品种为轮回亲本， 与普通野生稻材料配制组合， 构建 了 353 个株系组成的 BCZF2 ： 2 群体， 在千粒重性状上检测到 8 个 QTL， 其中位于水稻第 3 染 色体的近中心粒区间的 gw3.1 表现最稳定， 贡献率也较高 (Li et al， Genetics 2004， 168 ：2187-2195)。 Li et al(Genetics 1997， 145 ： 453-465)、 Guo LB 等 (plant breeding 2005， 124 ： 127-132) 和 Ishimaru(Plant Physiology 2003， 133 ： 1083-1090) 等利用不同的遗传 群体也将一个粒重 QTL 定位在第 6 染色体上。
虽然已经定位的粒重 QTL 有 89 个， 但是能够将粒重基因精细定位的很少。根据现 有文献， 关于粒重基因的精细定位仅有 gw3.1(Li et al， Genetics 2004， 168 ： 2187-2195)、 Lk-4(t)(ZHOU LQ et al， Acta GenetSin， 2006， 33 ： 72-79)、 gw8.1(Xie et al， Theor Appl Genet， 2006， 113 ： 885-894)、 GS3(FAN CC et al， Theor Appl Genel， 2006， 12(6) ： 1164-1171) 和 GW2(XIAN-JUN S et al， Nature Genetic， 2007， 39 ： 623-630)。克隆的粒重 基因仅有 GS3 粒长 (FAN CC et al， Theor Appl Genel， 2006， 12(6) ： 1164-1171) 和 GW2 粒 宽 (XIAN-JUN S et al， Nature Genetic， 2007， 39 ： 623-630) 基因。 所以精细定位和克隆更 多的粒重基因成为当前提高水稻产量的重要工作。 发明内容
发明人在已完成的水稻全基因组测序的基础上， 克隆了 517 个基因， 并分别进行 转基因验证其功能， 通过与对照组比较， 发现转化了 BGIos372 基因的转基因植株所产谷粒 明显比对照组大， 即转基因植株的千粒重大大提高了。由此初步验证了 BGIos372 基因是与 控制颗粒大小的数量性状相关的功能基因， 完成了本发明。 具体地， 本发明包括以下几方面 ：
本发明的一个方面涉及一种具有促进植物籽粒变大功能的核苷酸序列， 所述核苷 酸序列含有 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列， 即 BGIos372 基因， 所述基因的序列如下 ：
ATGTCTCTACAGGTGCCAAATGTGCAGGAACTCGCACTGACTTGCAACCGACCTGACCAGCAGATACCT GACAGGTACATCAGGCCGGAGGCTGGCACCGAAGAGGTCATCTGCGGCCAAGGCATCAACACGGCAATCCCGGTCAT CGATCTCGCCAAGCTGCTCAACCCGCAGTCATCCCAAGAGGAGTGTGCCAAGCTGCGATCTGCATGTCAGCACTGGG GTTTCTTCCAGGTACGTCAAGATTATGTAATCAAGCTTTTACTTTGATGATTCACAAGGTGATACAACTATTATTAA ACTGAATGATCAATAAACCATGTGGGAGAGAATTAAATAGTGTTTTTTTTCAAATTTGGACAAGGTGACACTGATTT AAGTAGGATAAACTGTGATTGATCTCACAAATTAAACTGCAGCTCGTCAACCATGGGGTGCCTGACGATGTGATCAG CGACGTGAGGAGAGACTTAACTGAGTTCTTCAAGCTACCACTTGAAGCCAAGGAGGCGTACGCTAAACCACCAGACA AGTACGAAGGCTATGGCCAGCACTTCGTCGTTTCAGAGAAGCAGAAGCTGGACTGGGGAGACCTGCTACACCTCCGG CTTCGCCCAACCGAGTCCAGGGATTTGAGGTTCTGGCCTGCCCATCCTTCATCTTTCAGGTCTGCCTCACAAACAAA ACCACAACTAATCTTTGCATTGATCATGACTATGGGAAATAAGTAGTTTTGAGAAATTTCAACCAAGAAATGAACAA TTTTTTTTATTTCCAAGGTTTAGTTTTTCAGTCTGAACGTTCATGGCTTCTCTTGTTCCAATGAGCCATTTTGCTGC ATATCACAACACAAATGTTTGACAGGAATTCCATGGAGAGGTACTCCTTGGAGACGGCAAAAGTAGCACGCTGCCTG TTGGAGTTCTTGGCCATGGACATGGGCGTTGATCCGGAGTCTCTCCTGGAGGTATTCAGAGGCCAGCCCCAGAACAT GAGGGTGAACTACTACCCGCCGTGCAGGCAAACCGGCAAGGTGCTCGGCCTGTCGCCGCACTGCGACGCGACCAGCC TGACGCTGCTGCTCCATGTGAACGACATGCAGGGCCTCCAGATCAGGAAGGACGGCAAGTGGCTCACCATCGAAGCC CTCGACGGCGCGTTCGTCGTCAACGTCGGCGACATGCTTGAGGTAAAATATTGACCAGGCTTTCACCTGATGCGTCG ATCTGAAACCGAAACAGTTTTTCTTTGCTGATCGATGTTGAATTGCTGGTGCACACCAGTACAGAGTTTCTAGCTTA ATCATCTACCAACATGGCTGCTGCTTGCAGATTCTGAGCAATGGGAGGTACAGGAGCGTTGAGCACAGGGCCGTGGT GCACCCGGAGAAGGAGCGCATCTCGGCGGCGGTGTTCCACCAGGCGTGCCGGGACGCGACGGTCGGGCCTCTGCCGG
AGCTCGTGACGAAGGACGGTGGCAGGCCGGTGTACAAGTCGATGGCCTACGAGGATTTCATGAAGCGCTTCTTCTCG GCCAAACTTGACGGAAGGGCTAACGTCGAGGGCATGA
(SEQ ID NO ： 1)
本发明还涉及与 SEQ ID NO ： 1 所示序列互补的核苷酸序列， 或其具有促进植物籽 粒变大功能的选自如下的变体 ：
1) 在高等严紧条件下与 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，
2) 对 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、 缺失、 添加修 饰的核苷酸序列， 和
3) 与 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列具有至少 90％的序列同一性的核苷酸序列。
典型地， “杂交条件” 根据测量杂交时所用条件的 “严紧性” 程度来分类。严紧性 程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度 (Tm) 为依据。例如， “最大严紧性” 典 型地发生在约 Tm-5℃ ( 低于探针 Tm 5℃ ) ； “高等严紧性” 发生在 Tm 以下约 5-10℃； “中等 严紧性” 发生在探针 Tm 以下约 10-20℃ ； “低严紧性” 发生在 Tm 以下约 20-25℃。作为替 代， 或者进一步地， 杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和 / 或一或多次的严紧性洗 涤为依据。例如， 6×SSC ＝极低严紧性 ； 3×SSC ＝低至中等严紧性 ； 1×SSC ＝中等严紧性 ； 0.5×SSC ＝高等严紧性。从功能上说， 可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一 或近严紧同一的核酸序列 ； 而采用高等严紧性条件确定与该探针有约 80％或更多序列同 一性的核酸序列。
对于要求高选择性的应用， 典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体， 例如， 选择相对低的盐和 / 或高温度条件。Sambrook 等 (Sambrook， J. 等 (1989) 分子克隆， 实验 室手册， Cold Spring HarborPress， Plainview， N.Y.) 提供了包括中等严紧性和高等严紧 性在内的杂交条件。
为便于说明， 用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧 条件包括 ： 用 5×SSC、 0.5％ SDS、 1.0mM EDTA(pH8.0) 溶液预洗 ； 在 50-65℃下在 5×SSC 中 杂交过夜 ； 随后用含 0.1 ％ SDS 的 2×、 0.5× 和 0.2×SSC 在 65 ℃下各洗涤两次 20 分钟。 本领域技术人员应当理解， 能容易地操作杂交严紧性， 如改变杂交溶液的含盐量和 / 或杂 交温度。例如， 在另一个实施方案中， 合适的高度严紧杂交条件包括上述条件， 不同之处在 于杂交温度升高到例如 60-65℃或 65-70℃。
在本发明中， 所述在高等严紧条件下与 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列杂交的核 苷酸序列， 其具有与 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列相同或相似的促植物籽粒变大活性。
在本发明中， 所述对 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、 缺失、 添加修饰的核苷酸序列， 是指分别或同时在所述核苷酸序列的 5’ 端和 / 或 3’ 端， 和 / 或序列内部进行例如不超过 2-45 个， 或者不超过 2-30 个， 或者不超过 3-20 个， 或者不超 过 4-15 个， 或者不超过 5-10 个， 或者不超过 6-8 个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取 代、 缺失、 添加修饰。
在本发明中， 所述对 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列进行如上述一个或多个碱基 的取代、 缺失、 添加修饰的核苷酸序列具有与 SEQ IDNO ： 1 所示的核苷酸序列相同或相似的 促植物籽粒变大活性。
通过一种多核苷酸进行说明， 其所具有的核苷酸序列例如与 SEQID NO ： 1 的参考核苷酸序列至少具 95％的 “同一性” 是指 ： 在 SEQ IDNO ： 1 的参考核苷酸序列之每 100 个核 苷酸中， 该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达 5 个核苷酸的不同外， 该多核苷酸之核苷 酸序列与参考序列相同。换句话说， 为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少 95％相同 的多核苷酸， 参考序列中多达 5％的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代 ； 或可将一些核 苷酸插入参考序列中， 其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的 5％ ； 或在一些核苷 酸中， 存在删除、 插入和替换的组合， 其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的 5％。 参考 序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的 5’ 或 3’ 末端位置， 或在这些末端位置之间的 任意地方， 它们或单独散在于参考序列的核苷酸中， 或以一个或多个邻近的组存在于参考 序列中。
在本发明中， 用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是例如 BLAST 和 BLAST 2.0 算 法， 它 们 分 别 描 述 在 Altschul 等 (1977)Nucl.Acid.Res.25 ： 3389-3402 和 Altschul 等 (1990)J.Mol.Biol.215 ： 403-410。采用例如文献中所述或者默认参数， BLAST 和 BLAST 2.0 可以用于确定本发明的核苷酸序列同一性百分数。执行 BLAST 分析的软件可 以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。
在本发明中， 所述与 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列具有至少 90％的序列同一 性的核苷酸序列包括与 SEQ ID NO ： 1 所公开序列基本同一的多核苷酸序列， 例如当采用本 文所述方法 ( 例如采用标准参数的 BLAST 分析 ) 时， 与本发明多核苷酸序列相比含有至少 90％序列同一性、 优选至少 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％或更高的 序列同一性的那些序列。 在本发明中， 所述与 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列具有至少 90％的序列同一性 的核苷酸序列具有与 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列相同或相似的促植物籽粒变大活性。
在本发明中， 所述的 BGIos372 基因来源于普通野生稻元江 (Oryza.rifupongon Yuanjiang)。
本发明的另一方面涉及一种载体， 其特征在于， 所述载体含有本发明所述的核苷 酸序列， 所述载体可以通过例如将上述核苷酸序列插入克隆载体或表达载体而得到， 或者 可以通过人工合成得到。
本发明的另一方面涉及一种重组载体， 其特征在于所述重组载体含有本发明所述 的核苷酸序列， 所述重组载体可以通过将上述核苷酸序列插入克隆载体或表达载体而得 到。
适于构建本发明所述重组载体的克隆载体包括但不限于， 例如 ： pUC18、 pUC19、 pUC118、 pUC119、 pMD19-T、 pMD20-T、 pMD18-T SimpleVecter、 pMD19-T Simple Vecter 等。
适于构建本发明所述的表达载体包括但不限于， 例如 ： pBI121、 p13W4、 pGEM 等。
在本发明的一个实施方案中， 所述重组载体为 p6+BGIos372 重组载体。
本发明的另一方面涉及一种含有本发明所述载体的重组细胞， 所述重组细胞可以 通过将含有本发明所述的载体转化至宿主细胞而得到。
适于构建本发明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于， 例如 ： 根癌农杆菌细胞 LBA4404、 EHA105、 GV3101 等。
在 本 发 明 的 一 个 实 施 方 案 中， 所 述 重 组 细 胞 为 重 组 农 杆 菌 (Agrobacterium tumefaciens)EHA105-p6+BGIos372。
本发明的还一方面涉及一种单子叶植物愈伤组织， 其特征在于， 所述愈伤组织转 化有本发明的核苷酸序列和 / 或载体和 / 或感染有本发明的重组细胞。
本发明的还一方面涉及一种转基因植物， 其特征在于， 所述转基因植物转化有本 发明的核苷酸序列和 / 或载体和 / 或感染本发明的重组细胞。
本发明的还一方面涉及本发明的核苷酸序列和 / 或载体和 / 或重组细胞用于促进 植物籽粒变大的用途， 以及用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。
本发明的还一方面涉及本发明的愈伤组织用于制备转基因植物或用于植物育种 的用途。
本发明的还一方面涉及一种促进植物籽粒变大的方法， 所述方法包括将本发明的 核苷酸序列和 / 或载体转化入植物， 或用本发明的重组细胞感染植物。
所述方法包括用本发明的核苷酸序列转化单子叶植物的愈伤组织的步骤。 在本发 明的一个实施方案中， 所述单子叶植物愈伤组织的转化利用了含有本发明的核苷酸序列的 重组细胞。在本发明的一个实施方案中， 所述单子叶植物愈伤组织的转化过程中利用了前 述的重组农杆菌 EHA105-p6+BGIos372。在本发明的一个具体实施方案中， 所述单子叶植物 的愈伤组织为水稻愈伤组织， 具体地， 所述水稻为日本晴。 在本发明中， 可采用植物基因转化技术将目的基因插入到植物基因组中， 包括农 杆菌介导转化、 病毒介导的转化、 显微注射、 粒子轰击、 基因枪转化和电穿孔等。本领域周 知， 农杆菌介导的基因转化常被用于单子叶植物和双子叶植物的基因转化， 但其它转化技 术也可用于本发明所述单子叶植物的基因转化。当然， 适于本发明的转化单子叶植物的另 一种方法是粒子轰击 ( 显微金或钨粒子包覆转化的 DNA) 胚性愈伤组织或胚胎开发。另外， 还可以采用的转化单子叶植物的方法是原生质体转化。基因转化后， 采用通用的方法来筛 选和再生整合有表达单元的植株。
本发明的还一方面涉及一种产生籽粒变大的转基因植物的方法， 所述方法包括以 下步骤 ：
1) 将本发明的核苷酸序列和 / 或载体转化入植物愈伤组织， 或用本发明的重组细 胞感染植物愈伤组织 ；
2) 利用所述愈伤组织再生转基因植物。
在本发明中， 所述植物优选是单子叶植物， 所述单子叶植物包括但不限于水稻、 谷 子、 小麦、 高粱、 玉米， 特别优选为水稻， 所述水稻包括但不限于， 中花 9、 中花 10、 中花 11、 台 北 309、 丹江 8 号、 云稻 2 号、 汕优 63、 汕优 608、 丰优 22， 黔优 88、 II 优 416、 II 优 107、 II 优 128、 II 优 718、 准两优 527、 川农 1 号、 杂 0152、 皖稻 88、 皖稻 90、 皖稻 92、 皖稻 94、 皖稻 96、 皖稻 185、 皖稻 187、 皖稻 189、 皖稻 191、 皖稻 193、 皖稻 195、 皖稻 197、 皖稻 199、 皖稻 201、 皖 稻 203、 皖稻 205、 皖稻 207， 以及津原 101( 上述水稻品种均可购自安徽徽商农家福有限公 司 )。在本发明的一个实施方案中， 所述水稻为日本晴。
在本发明中， 所述籽粒变大是指在饱满程度相当的情况下， 籽粒体积变大， 千粒重 增加。
在本发明的一个实施方案中， 发明人从水稻元江中扩增得到基因 BGIos372， 将该 基因重组入新构建的 p6 载体中得到含有该基因的重组表达载体， 转化根癌农杆菌， 利用重 组农杆菌转化水稻愈伤组织， 通过水稻愈伤组织的 GUS 染色、 转基因小苗根、 叶 GUS 染色及
转基因水稻籽粒的性状观察， 并与未转入 BGIos372 基因的组织或植物对比， 证明 BGIos372 基因能够促进植物籽粒变大。
发明的有益效果
本发明利用高通量测序技术， 通过基因的遗传转化， 挖掘出促进籽粒变大的 BGIos372 基因， 所述基因能够大大提高转基因植物的千粒重， 证明了 BGIos372 基因是与控 制水稻颗粒大小的数量性状相关的功能基因， 这将有利于在分子水平上更深入探讨该性状 形成的生理机理和机制， 达到对产量和品质的合理调控作用， 对水稻的遗传育种产生重大 的意义。
关于生物材料保藏的说明
本发明涉及以下生物材料 ：
普通野生稻元江种子， 其于 2010 年 9 月 6 日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉 大学保藏中心， 即中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 保藏编号为 CCTCC P201011。 附图说明
图 1p6 载体示意图。 图 2 经转化的水稻愈伤组织的 GUS 染色结果。 其中， 由带有本发明所述 BGIos 372 基因的重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos372 转化的水稻愈伤组织 ( 右 ) 经 GUS 染色后呈 现蓝色 ； 不带有本发明 BGIos372 基因的重组根癌农杆菌 EHA105-p6 质粒的水稻愈伤组织 ( 对照， 左 ) 经 GUS 染色后颜色未发生变化。
图 3 转基因水稻的籽粒观察。其中， 经含有 p6+BGIos372 重组载体的根癌农杆菌 介导转化的水稻籽粒 ( 图 3 右 ) 与阴性对照 ( 图 3 左 ) 相比， 籽粒更大。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述， 但是本领域技术人员将会 理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限定本发明的范围。 实施例中未注明具体 条件者， 按照常规条件或制造商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为 可以通过市购获得的常规产品。
实施例 1BGIos372 基因的 PCR 扩增和 pMD18-T+BGIos372 重组载体的构建
PCR 扩增
使用植物基因组 DNA 提取试剂盒 (TIANGEN 新型植物基因组 DNA 提取试剂盒， 目录 号： DP320-02) 提取普通野生稻元江 (Oryza.rifupongonYuanjiang) 的基因组 DNA， 根据该 基因在 gDNA 中的序列， 分别在首尾设计一对 PCR 特异性扩增引物 ( 上游引物 F1， 加限制性 酶切位点 BamHI 和保护碱基， 下游引物 R1， 加限制性酶切位点 Xba I 和保护碱基 )。以上述 提取的元江的 gDNA 为模板， 高保真 Ex Taq(TaKaRa， DRR100B) 聚合酶进行 PCR 扩增。如表 1 所示。
表 1 目的基因扩增的 PCR 体系
PCR 扩增程序为 ： 94℃预变性 5min， 然后以 94℃变性 45s， 55℃退火 50s， 72℃延伸 90s， 进行 35 个反应循环， 最后 72℃延伸 7min。
其中， 上游引物 F1 ： CGCGGATCCATGTCTCTACAGGTGCCAAATG(SEQ ID NO ： 2)， 含 BamHI 酶切位点。下游引物 R1 ： TGCTCTAGAAATCTTCATGCCCTCGACGTTAG(SEQ ID NO ： 3)， 含 Xba I 酶 切位点。
PCR 扩增产物经 1.0％琼脂糖凝胶电泳分离， 得到大小为 1570bp 左右的条带， 使用 TIANGEN 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒 ( 目录号 ： DP209-03) 进行纯化回收。
pMD18-T+BGIos372 重组载体的构建
将上述得到的 PCR 扩增产物进行 T/A 克隆 (pMD18-T 质粒， TaKaRa， D103A)， 转化大 证明准确。 肠杆菌， 挑取阳性克隆测序，
其中， T/A 克隆的连接条件如下 ：
T/A 连接体系 ： 10μl
pMD18-T 1μl
2×solution I 5μl
PCR 扩增产物 ( 回收插入片段 )10-20ng， 根据其浓度定
ddH2O 补齐至 10μl
于 16 ℃ 在 节 能 型 智 能 恒 温 槽 ( 宁 波 新 芝， SDC-6) 中 连 接 8h 以 上， 得到 pMD18-T+BGIos372 重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌 ：
从超低温冰箱中取出按照 《分子克隆实验指南》 ( 第三版， 科学出版社 ) 所示氯化 钙法制备的感受态细胞 100μl DH5α( 中国科学院昆明动物研究所董杨提供 ； 或者可从例 如： 上海生工购得 )， 冰上融化后， 加入 10μl 如上所得的连接产物， 即 pMD18-T+BGIos372 重组载体， 轻轻搅匀， 冰浴 30min， 42℃热激 60s， 冰浴 5min， 加入 600μl4℃预冷的 SOC 培养 基 ( 具体配方详见 《分子克隆实验指南》 ， 第三版， 科学出版社 )， 37℃ 220rpm 复苏 45min， 8000rpm 离心 30s， 去上清， 留取 150μl， 用剩下的 150μl 上清重悬沉淀后的混合物， 轻轻吹 匀， 玻璃珠涂布 LB( 加卡那霉素， Kan) 平板 ( 具体配方详见 《分子克隆实验指南》 ， 第三版， 科学出版社 )， 37℃倒置培养 16-24h。获得含有 pMD18-T+BGIos372 克隆载体的重组大肠杆 菌， 命名为 DH5α-BGIos372。 深圳华大基因科技有限公司对 pMD18-T+BGIos372 克隆载体中 的 BGIos372 进行测序， 测序结果与 SEQ ID NO ： 1 一致。表明获得的 pMD18-T+BGIos372 克 隆载体中 BGIos372 基因序列正确。
实施例 2p6 重组载体的构建
1) 玉米 Ubiquitin 启动子片段的 PCR 扩增和 pMD18-T+Ubi 重组载体的构建
Ubi 启动子 PCR 扩增
使用植物基因组 DNA 提取试剂盒 (TIANGEN 新型植物基因组 DNA 提取试剂盒， 目
录号 ： DP320-02) 提取玉米品种 B73(Zea mays mays cv.B73) 的基因组 DNA(http://www. maizegdb.org/)， 根据该启动子在玉米 B73gDNA 中的序列， 分别在首尾设计一对 PCR 特异性 扩增引物 ( 上游引物 F2 ： GGCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTCGT(SEQ ID NO ： 4)， 加限制性酶切位 点 Pst I 和保护碱基， 下游引物 R2 ： GGCTGCAGAAGTAACACCAAAC(SEQ ID NO ： 5)， 加限制性酶 切位点 Pst I 和保护碱基 )。 以上述提取的玉米 B73 的 gDNA 为模板， 高保真 Ex Taq(TaKaRa， DRR100B) 聚合酶进行 PCR 扩增。如表 2 所示。
表 2Ubi 启动子扩增的 PCR 体系
PCR 扩增程序为 ： 94℃预变性 5min， 然后以 94℃变性 45s， 55℃退火 50s， 72℃延伸 90s， 进行 35 个反应循环， 最后 72℃延伸 7min。
PCR 扩增产物经 1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后， 使用 TIANGEN 琼脂糖凝胶 DNA 回收 试剂盒 ( 目录号 ： DP209-03) 纯化回收。
pMD18-T+Ubi 重组载体的构建
将上述得到的 PCR 扩增产物进行 T/A 克隆 (pMD18-T 质粒， TaKaRa， D103A)， 转化大 肠杆菌， 挑取阳性克隆由深圳华大基因科技有限公司测序， 证明准确。
其中， T/A 克隆的连接条件如下 ：
T/A 连接体系 ： 10μl
pMD18-T 1μl
2×solution I 5μl
PCR 扩增产物 10-20ng， 根据其浓度定
ddH2O 补齐至 10μl
于 16 ℃ 在 节 能 型 智 能 恒 温 槽 ( 宁 波 新 芝， SDC-6) 中 连 接 8h 以 上， 得到 pMD18-T+Ubi 重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌 ：
从超低温冰箱中取出按照 《分子克隆实验指南》 ( 第三版， 科学出版社 ) 所示氯 化钙法制备的感受态细胞 100μl DH5α( 中国科学院昆明动物研究所董杨提供 ； 或者可从 例如 ： 上海生工购得 )， 冰上融化后， 加入 10μl 如上所得的连接产物， 即 pMD18-T+Ubi 重 组载体， 轻轻搅匀， 冰浴 30min， 42℃热激 60s， 冰浴 5min， 加入 600μl 4℃预冷的 SOC 培养 基 ( 具体配方详见 《分子克隆实验指南》 ， 第三版， 科学出版社 )， 37℃ 220rpm 复苏 45min， 8000rpm 离心 30s， 去上清， 留取 150μl， 用剩下的 150μl 上清重悬沉淀后的混合物， 轻轻 《分子克隆实验指南》 ， 第三版， 科学 吹匀， 玻璃珠涂布 LB( 卡那霉素 ) 平板 ( 具体配方详见 出版社 )， 37℃倒置培养 16-24h。获得含有 pMD18-T+Ubi 克隆载体的重组大肠杆菌， 命名为
DH5α-Ubi。
2)pCAMBIA-1301+Ubi 重组载体的构建
按照 TIANGEN 普通质粒小提试剂盒 ( 目录号 ： DP103-03) 的操作手册， 从步骤 1) 构 建的转化有启动子 Ubi 的大肠杆菌 DH5α-Ubi 中提取带有玉米 Ubi 启动子序列的克隆载体 pMD18-T+Ubi ； 纯化后用相应的限制性内切酶 Pst I(NEB) 进行酶切， 然后用 TIANGEN 琼脂糖 凝胶 DNA 回收试剂盒 ( 目录号 ： DP209-03) 回收相应的启动子片段。
同时用限制性内切酶 Pst I 酶切 pCAMBIA-1301 质粒 ( 中国科学院昆明动物研究 所董杨提供 ； 或者可从例如上海国瑞基因科技有限公司购得， 该公司的 pCAMBIA-1301 质粒 的原始来源是 The CAMBIA Bios(biological open source)Licensee， Australia) 并回收。
酶切体系 ： 50μl
ddH2O 34.9μl
10*buffer 35μl
Pst I 0.1μl(10U)
克隆载体 pMD18-T+Ubi 或 pCAMBIA-1301 质粒 10μl( ＜ 1000ng)
将回收的启动子片段 Ubi 与回收的载体片段根据 T4 连接酶 (TaKaRa， D2011A) 操 作说明， 按照如下条件进行连接 ： 连接体系 ： 10μl
10×T4buffer 1μl
回收的 pCAMBIA-1301 质粒 1μl(20ng)
回收的启动子 Ubi 插入片段 10-20ng， 根据其浓度定
ddH2O 补齐至 9.5μl
T4ligase(TaKaRa， D2011A)0.5μl
于 16℃节能型智能恒温槽 ( 宁波新芝， SDC-6) 中连接 8h 以上。
将 100μl 氯化钙法制得的感受态细胞 DH5α 从超低温冰箱取出， 冰上融化后， 加 入 10μl 上面的连接产物， 轻轻搅匀， 冰浴 30min， 42℃热激 60s， 冰浴 5min， 加 600μl 4℃ 预冷的 SOC， 37℃下 220rpm 复苏 45min， 8000rpm 离心 30s， 去上清， 留取 150μl， 轻轻吹匀， 玻璃珠涂布 LB(Kan)， 37℃倒置培养 16-24h。得到重组载体 pCAMBIA-1301+Ubi。
分别以 F2 和 R2 为引物对所得重组载体 pCAMBIA-1301+Ubi 进行 PCR 检测， 以确证 所得重组载体 pCAMBIA-1301+Ubi 中含有所需启动子 Ubi。
3)NOS 终止子的 PCR 扩增和 pMD18-T+NOS 重组载体的构建
根据 pCAMBIA-1301 质粒中 NOS 终止子的序列， 分别在首尾设计一对 PCR 特异性扩 增引物 ( 上游引物 F3 ： GGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAA(SEQ ID NO ： 6)， 加限制性酶切位 点 Sac I 和保护碱基， 下游引物 R3 ： GGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT(SEQ ID NO ： 7)， 加限 制性酶切位点 EcoR I 和保护碱基 )。以上述提取的 pCAMBIA-1301 质粒为模板， 高保真 Ex Taq(TaKaRa， DRR100B) 聚合酶进行 PCR 扩增。如表 3 所示。
表 3NOS 终止子扩增的 PCR 体系
将上述得到的 PCR 扩增产物进行 T/A 克隆 (pMD18-T 质粒， TaKaRa， D103A)， 转化大 肠杆菌， 获得含有 pMD18-T+NOS 克隆载体的重组大肠杆菌， 命名为 DH5α-NOS。挑取阳性克 隆由深圳华大基因科技有限公司测序， 证明准确。
4)pCAMBIA-1301+Ubi+NOS 即 p6 重组载体的构建
按照 TIANGEN 普通质粒小提试剂盒 ( 目录号 ： DP103-03) 的操作手册， 提取步骤 3) 构建的克隆载体 pMD18-T+NOS ； 纯化后用相应的限制性内切酶 Sac I(NEB) 和 EcoR I(NEB) 进行酶切， 然后用 TIANGEN 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒 ( 目录号 ： DP209-03) 回收相应的 NOS 终止子片段。同时用限制性内切酶 Sac I 和 EcoR I 酶切 pCAMBIA-1301+Ubi 质粒并回收。
酶切体系 ： 50μl
ddH2O 34.9μl
10*buffer 15μl
Sac I 0.1μl(10U)
EcoR I 0.1μl(10U)
载体 pMD18-T+NOS 或 pCAMBIA-1301+Ubi 质粒 10μl( ＜ 1000ng)
将回收的终止子片段 NOS 与回收的载体片段用 T4 连接酶进行连接， 转化感受态细 胞 DH5α 得到重组载体 pCAMBIA-1301+Ubi+NOS， 即 p6( 参见图 1)。
实施例 3p6+BGIos372 重组载体的构建
提 取 pMD18-T+BGIos372 质 粒， 并 用 限 制 性 内 切 酶 BamHI/Xba I 酶 切 后 回 收 BGIos372 基因片段， 同时提取 p6 质粒， 并用相应的限制性内切酶 BamHI/XbaI 酶切后回收大 片段， 将回收产物进行连接， 随后转化感受态细胞 DH5α 得到重组载体 p6+BGIos372。筛选 阳性克隆进行 PCR 检测后测序确定。
实施例 4 重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos372 细胞的制备
将如实施例 3 所述方法构建的 p6+BGIos372 重组载体质粒， 转化按照 《分子克隆 实验指南》 ( 第三版， 科学出版社 ) 中所述氯化钙方法制备的根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)EHA105( 已经于 2010 年 9 月 22 日在申请号为 200910238992.0， 发明名称为一 种启动子 BgIosP587、 其制备方法及用途的专利文献中公开， 保藏编号为 CCTCC M 209315) 感受态细胞， 具体方法如下 ：
将根癌农杆菌感受态细胞 EHA105 于超低温冰箱中取出， 至于冰上解冻。融化后， 加入 5μl 的 p6+BGIos372 重组载体， 轻轻混匀， 冰浴 10min， 放入液氮中冷冻 5min， 37℃解 冻 5min， 加入 800μl 常温的 LB 液体培养基， 28℃ 160rpm 复苏 3h， 8000rpm 离心 30s， 吸去
上清， 留下 200μl 吹匀， 涂布于加有 kan-rif( 卡那霉素 - 利福平 ) 双抗的 YM 培养基平板 上 (50mg/l Kan， 10mg/l Rif， 具体配方参见表 4)。28℃倒置培养 2-3 天。
以 F1 和 R1 为引物进行 PCR 检测和通过 BamHI/XbaI 酶切筛选转化子。PCR 扩增出 约 1570bp 左右条带和酶切出约 1570bp 左右条带的为重组载体 p6+BGIos372 的重组根癌农 杆菌。
本发明中， 按照如上述方法得到的带有重组载体 p6+BGIos372 的重组农杆菌， 命 名为重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos372 ； 同时设立带有空载体 p6 的重组根癌农杆菌， 即 EHA105-p6 作为本发明的阴性对照， 用于后续实验。
实施例 5 水稻愈伤组织的诱导和转化
按照如下步骤诱导水稻愈伤组织， 并分别用重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos372 转化所述愈伤组织。
1) 将水稻日本晴种子 ( 已经于 2010 年 9 月 22 日在申请号为 200910238992.0， 发 明名称为一种启动子 BgIosP587、 其制备方法及用途的专利文献中公开， 保藏编号为 CCTCC P200910) 去壳， 70％乙醇表面消毒 30s， 然后用有效氯 1.5％的次氯酸钠消毒 30min， 期间剧 烈摇动， 消毒后用灭菌水清洗 5 次 ； 将消毒后的种子置于 N6D 培养基 ( 具体配方参见表 4) 上， 用封口膜封口 ； 29.5℃光照培养 3-4 周 ；
2) 选取活跃生长的愈伤组织 ( 黄白色， 干燥， 直径 1-3mm)， 在新 N6D 培养基上 29.5℃光照培养 3 天 ；
3) 分别挑取如实施例 4 所构建的重组根癌农杆菌单菌落 ( 重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos372)， 于添加抗生素 (50mg/l Kan， 10mg/lRif) 的 YM 培养基 ( 具体配方参 见表 5、 表 6) 上划线培养 3 天， 培养温度 28℃ ； 分别刮取上述重组根癌农杆菌置于添加了 30μl 100mM 的 AS(Acetosyringone， 乙酰丁香酮 ) 的 30ml AAM 培养基 ( 具体配方参见表 7) 中， 温和重悬所述重组根癌农杆菌细胞 ( 重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos372) ；
4) 将继代培养的愈伤组织置于灭菌培养皿中 ； 将如步骤 3) 制备的重组根癌农杆 菌悬液倒入培养皿中， 将愈伤组织浸入其中 15min ；
5) 倒掉重组根癌农杆菌悬液， 将愈伤组织用灭菌吸水纸吸掉多余的液体 ； 于 N6-AS 培养基 ( 配方参见表 8) 上放一张灭菌滤纸， 加 1ml 如上述含 AS 的 AAM 培养基， 将愈 伤组织转移至滤纸上 ； 密封培养皿， 28℃暗培养 48-60h ；
6) 将受感染的愈伤组织置于 50ml 灭菌管中， 用灭菌水摇动清洗， 直至上清液变 澄清 ； 将愈伤组织浸泡于含 500mg/l 羧苄青霉素 (Carb) 的无菌水中以杀死重组根癌农杆 菌； 用灭菌吸水纸除去愈伤组织上多余的水分， 然后将其转移至含 1mg/l 潮霉素 B(HmB) 和 50mg/l Carb 的 N6-AS 培养基上 ； 用封口膜密封培养皿， 29.5℃光照培养 3-4 周。
实施例 6 水稻愈伤组织中的 GUS 的表达
为检测经过实施例 5 所述转化的水稻愈伤组织中目的基因 GUS 的表达情况， 按照 Chen S Y 等在 Journal of Integrative Plant Biology， 2008， 50(6) ： 742-751 所述的方 法， 对分别用重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos372 转化的水稻愈伤组织进行染色。
GUS 染色液的配方 (1ml) ： 610μl 0.2M Na2HPO4 溶液 (pH ＝ 7.0) ； 390μl 0.2M NaH2PO4 溶液和 10μl 0.1M X-gluc。
将用重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos372 转化的水稻愈伤组织浸泡在 GUS 染色液中， 37℃保温至出现蓝色， 拍照记录， 结果如图 2 所示， 含有 p6+BGIos372 重组载体的根癌 农杆菌介导转化的水稻愈伤组织 ( 图 2 右 ) 经染色后呈现蓝色， 阴性对照 ( 图 2 左 ) 经 GUS 染色后颜色未发生变化。结果显示， 本发明 p6+BGIos372 转入水稻愈伤组织。
实施例 7 ： 转基因水稻苗中 GUS 的表达
将实施例 5 中得到的愈伤组织转移至含 50mg/l 潮霉素 B(HmB) 的 MS-R 分化培养 基 ( 具体配方见表 9) 分化苗 ； 用封口膜密封培养皿， 29.5℃光照培养 3-4 周 ； 待幼苗长至 3-4cm 时转移到含 50mg/l 潮霉素 B(HmB) 的 1/2MS 生根培养基 ( 具体配方参见表 10) 进行 生根筛选。
转基因水稻苗的 GUS 染色过程同实施例 6 中愈伤组织的染色过程。结果显示经含 有 p6+BGIos372 重组载体的根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根和叶经染色后呈现蓝色， 阴 性对照的根和叶经 GUS 染色后颜色未发生变化。表明本发明 p6+BGIos372 转入水稻苗中。
实施例 8 ： 转基因水稻籽粒的性状观察
待实施例 7 的转基因水稻幼苗和对照幼苗在培养基中生长 20 天后， 平行条件移栽 入大田， 平行条件培养至收获籽粒。转基因水稻和对照分别观察了 52 株， 其中 48 株转基因 水稻的籽粒饱满， 且均比对照大 ( 参见图 3， 其中右侧为含有 BGIos372 基因的转基因水稻籽 粒， 左侧为阴性对照 )。
本发明实施例中所使用的相关培养基配方说明如下 ：
以下有关培养基中所称的 “常规灭菌” 是指如下条件的灭菌 ： 121 ℃下蒸气灭菌 20min。
表 4N6D 培养基
用 1N 氢氧化钾调节 pH 值到 5.8， 封口后按常规方法灭菌。
N6macro 母液 (20X) ： 硝酸钾 56.60g， 磷酸二氢钾 8.00g， 硫酸铵 9.26g， 硫酸镁 3.70g， 氯化钙 3.32g， 蒸馏水定容至 1L， 4℃保存备用。
N6micro 母液 (1000X) ： 碘化钾 0.80g， 硼酸 1.60g， 硫酸锰 3.33g， 硫酸锌 1.50g， 蒸 馏水定容至 1L， 4℃保存备用。
铁盐 (Fe2EDTA) 贮存液 (100X) ： 将 3.73g 乙二铵四乙酸二钠 (Na2EDTA·2H2O) 和
2.78g FeSO4.7H2O 分别溶解， 混合并用。用蒸馏水定容至 1000ml， 70 温浴 2h， 冷却后 4℃保 存不超过 1 个月。
N6 维生素贮存液 (1000X) ： 维生素 B10.10g， 维生素 B60.05g， 烟酸 0.05g， 甘氨酸 0.20g， 加蒸馏水定容至 100ml， 过滤除菌， 4℃保存不超过 1 周。
表 5YM 液体培养基 ( 含有 50mg/L Kan， 10mg/L Rif)
表 6YM 固体培养基 ( 含有 50mg/L Kan， 10mg/L Rif)
表 7AAM 培养基
1N 氢氧化钾调节 pH 值至 5.2， 常规灭菌。
AAM macro(10X) ： 2.5g 七水硫酸镁 (MgSO4· 7H2O)， 1.5g 二水氯化钙 (CaCl2· 2H2O)， 1.33g 二水磷酸二氢钠 (NaH2PO4.2H2O)， 蒸馏水定容至 1L， 4℃保存备用。
AAM micro(100X) ： 0.7g 单水硫酸锰 (MnSO4· H2O)， 0.2g 七水硫酸锌 (ZnSO4· 7H2O)， 0.075g 碘化钾 (KI)， 0.3g 硼酸 (H3BO3)， 25mg 二水钼酸钠 (Na2MoO4.2H2O)， 2.5mg 五水硫酸铜 (CuSO4.5H2O)， 2.5mg 六水氯化钴 (CoCl2.6H2O)， 蒸馏水定容至 1L， 4℃保存备用。
AAM 有机 (1000X) ： 0.75g 甘氨酸 (Glycine)， 0.1g 烟酸 (Nicotinic acid)， 0.1g VB6(Pyridoxine)， 1g VB1(Thiamine)， 蒸馏水定容至 100ml， 4℃保存备用。
铁盐 (Fe2EDTA) 贮存液 (100X) ： 见表 2。
表 8N6-AS 共培养基
调 pH 至 5.2。
N6macro 母液 (20X)， N6micro 母液 (1000X)， 铁盐 (Fe2EDTA) 贮存液 (100X)， N6 维 生素贮存液 (1000X) ： 均见表 2。
表 9MS-R 分化培养基
调 PH 值至 5.8， 常规方式灭菌。
MS macro(20X) ： 硝酸铵 33.0g， 硝酸钾 38.0g， 磷酸二氢钾 3.4g， 硫酸镁 7.4g， 氯化 钙 8.8g 逐一溶解， 然后室温下用蒸馏水定容至 1L， 4℃保存。
MS micro(1000X) ： 硫酸锰 16.90g， 硫酸锌 8.60g， 硼酸 6.20g， 碘化钾 0.83g， 钼酸 钠 0.25g， 硫酸铜 0.025g， 氯化钴 0.025g， 上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至 1L， 4℃ 保存。
MS 维生素贮存液 (1000X) ： 维生素 B10.010g， 维生素 B60.050g， 烟酸 0.050g， 甘氨 酸 0.200g， 加蒸馏水定容至 100ml， 过滤除菌， 4℃保存不超过 1 周。
铁盐 (Fe2EDTA) 贮存液 (100X) ： 见表 2。
表 101/2MS 生根培养基
调 PH 值至 5.8。 MS macro(20X) 见表 9。 MS micro(1000X)MS 维生素贮存液 (1000X) 见表 9。铁盐 (Fe2EDTA) 贮存液 (100X) ： 见表 4。
本发明涉及一种基因， 特别是涉及 BGIos372 基因， 及其促进植物、 特别是单子叶 植物籽粒变大的用途及方法。背景技术
水稻 (Oryza sativa) 是全世界最重要的粮食作物之一， 全世界约 30 多亿人口以 稻米为主食 (Delseny M et al， 2001)。 水稻也是我国第一大粮食作物， 其面积、 单产和总产 量均居首位， 水稻生产在我国国民经济中具有举足轻重的地位。随着人口增长和人民生活 水平的提高， 市场对优质稻米有更大需求。 粮食生产不但要提高品种的产量潜力， 更要注重 品质的改良， 而水稻粒型 ( 粒长、 粒宽和长宽比 ) 和千粒重会影响稻米外观、 产量及市场价 值。 因此， 选育大粒优质的水稻新品种已成为水稻育种的一个主要目标， 发掘控制水稻粒型 和千粒重的主要基因是当前遗传学家和育种家们共同关注的焦点。 这对提高稻谷产量和稻 米市场的竞争力具有重要意义。
水稻产量主要由千粒重、 有效穗数和每穗粒数决定。据国内外研究， 在构成水稻 产量的三要素中， 千粒重也即谷粒重量的遗传比较稳定， 其变异系数为 40％～ 60％。菲律 宾国际水稻研究所研究认为， 增加粒重可提高水稻产量 30％以上 ( 姚国新和卢磊， 安徽农 业科学， 2007， 35(27) ： 8468-8478)。从代谢生理和形态学上看， 高产必须具备两个条件， 即高水平的代谢源和足够大的贮藏库， 其中后者表现在粒数多和谷粒大， 即对光合产物有 较大的容纳力。基于以上分析， 想实现水稻产量的进一步飞跃， 提高粒重的途径是值得重 视的， 提高粒重是提高粮食产量的有效途径 ( 熊振民和孔繁林， 江苏农业科学 4， 1981， 48 ： 25-30)。
水稻千粒重由谷粒长度、 宽度和厚度三者决定， 是一个典型的受多基因控制的数 量性状遗传。克隆控制粒重的主要基因并加以改造利用是提高粮食产量的有效方法。目前 水稻的全基因组测序工作已经完成， 在水稻上已经积累了相当详细的资料， 为水稻重要性 状基因的定位克隆提供了便利。但是关于水稻粒重的基因定位克隆任务依然艰巨 ( 姚国新 和卢磊， 安徽农业科学， 2007， 35(27) ： 8468-8478)。
当前， 已经定位的粒重数量性状位点多达 89 个， 分布于水稻的所有 12 条染色体上 ( 玛丽莲， 中国农业科学院， 硕士学位论文， 2007)。徐建龙等 ( 中国水稻科学， 2002， 16(3) ： 6-10) 应用 292 个 Lemont/ 特青的重组自交系 (RILs) 检测到影响千粒重的 11 个作物数 量性状位点 (quantitativetraitlocus， QTL)， 分别位于第 1、 2、 3、 4、 5、 10 和 12 染色体上， 联合贡献率为 53.9％。林荔辉和吴为人 ( 分子植物育种， 2003(1) ： 337-342) 利用以两个 釉稻品种 H 359 和 Acc8558 为亲本杂交建立的重组自交系群体检测到 16 个与粒重有关的 可解释 81.40％的表型变异， 分布在 8 条不同的染色体上， 其中有 5 个分布在第 3 染色 QTL， 体上。美国康奈尔大学选用热带粳稻品种为轮回亲本， 与普通野生稻材料配制组合， 构建 了 353 个株系组成的 BCZF2 ： 2 群体， 在千粒重性状上检测到 8 个 QTL， 其中位于水稻第 3 染 色体的近中心粒区间的 gw3.1 表现最稳定， 贡献率也较高 (Li et al， Genetics 2004， 168 ：2187-2195)。 Li et al(Genetics 1997， 145 ： 453-465)、 Guo LB 等 (plant breeding 2005， 124 ： 127-132) 和 Ishimaru(Plant Physiology 2003， 133 ： 1083-1090) 等利用不同的遗传 群体也将一个粒重 QTL 定位在第 6 染色体上。
虽然已经定位的粒重 QTL 有 89 个， 但是能够将粒重基因精细定位的很少。根据现 有文献， 关于粒重基因的精细定位仅有 gw3.1(Li et al， Genetics 2004， 168 ： 2187-2195)、 Lk-4(t)(ZHOU LQ et al， Acta GenetSin， 2006， 33 ： 72-79)、 gw8.1(Xie et al， Theor Appl Genet， 2006， 113 ： 885-894)、 GS3(FAN CC et al， Theor Appl Genel， 2006， 12(6) ： 1164-1171) 和 GW2(XIAN-JUN S et al， Nature Genetic， 2007， 39 ： 623-630)。克隆的粒重 基因仅有 GS3 粒长 (FAN CC et al， Theor Appl Genel， 2006， 12(6) ： 1164-1171) 和 GW2 粒 宽 (XIAN-JUN S et al， Nature Genetic， 2007， 39 ： 623-630) 基因。 所以精细定位和克隆更 多的粒重基因成为当前提高水稻产量的重要工作。 发明内容
发明人在已完成的水稻全基因组测序的基础上， 克隆了 517 个基因， 并分别进行 转基因验证其功能， 通过与对照组比较， 发现转化了 BGIos372 基因的转基因植株所产谷粒 明显比对照组大， 即转基因植株的千粒重大大提高了。由此初步验证了 BGIos372 基因是与 控制颗粒大小的数量性状相关的功能基因， 完成了本发明。 具体地， 本发明包括以下几方面 ：
本发明的一个方面涉及一种具有促进植物籽粒变大功能的核苷酸序列， 所述核苷 酸序列含有 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列， 即 BGIos372 基因， 所述基因的序列如下 ：
ATGTCTCTACAGGTGCCAAATGTGCAGGAACTCGCACTGACTTGCAACCGACCTGACCAGCAGATACCT GACAGGTACATCAGGCCGGAGGCTGGCACCGAAGAGGTCATCTGCGGCCAAGGCATCAACACGGCAATCCCGGTCAT CGATCTCGCCAAGCTGCTCAACCCGCAGTCATCCCAAGAGGAGTGTGCCAAGCTGCGATCTGCATGTCAGCACTGGG GTTTCTTCCAGGTACGTCAAGATTATGTAATCAAGCTTTTACTTTGATGATTCACAAGGTGATACAACTATTATTAA ACTGAATGATCAATAAACCATGTGGGAGAGAATTAAATAGTGTTTTTTTTCAAATTTGGACAAGGTGACACTGATTT AAGTAGGATAAACTGTGATTGATCTCACAAATTAAACTGCAGCTCGTCAACCATGGGGTGCCTGACGATGTGATCAG CGACGTGAGGAGAGACTTAACTGAGTTCTTCAAGCTACCACTTGAAGCCAAGGAGGCGTACGCTAAACCACCAGACA AGTACGAAGGCTATGGCCAGCACTTCGTCGTTTCAGAGAAGCAGAAGCTGGACTGGGGAGACCTGCTACACCTCCGG CTTCGCCCAACCGAGTCCAGGGATTTGAGGTTCTGGCCTGCCCATCCTTCATCTTTCAGGTCTGCCTCACAAACAAA ACCACAACTAATCTTTGCATTGATCATGACTATGGGAAATAAGTAGTTTTGAGAAATTTCAACCAAGAAATGAACAA TTTTTTTTATTTCCAAGGTTTAGTTTTTCAGTCTGAACGTTCATGGCTTCTCTTGTTCCAATGAGCCATTTTGCTGC ATATCACAACACAAATGTTTGACAGGAATTCCATGGAGAGGTACTCCTTGGAGACGGCAAAAGTAGCACGCTGCCTG TTGGAGTTCTTGGCCATGGACATGGGCGTTGATCCGGAGTCTCTCCTGGAGGTATTCAGAGGCCAGCCCCAGAACAT GAGGGTGAACTACTACCCGCCGTGCAGGCAAACCGGCAAGGTGCTCGGCCTGTCGCCGCACTGCGACGCGACCAGCC TGACGCTGCTGCTCCATGTGAACGACATGCAGGGCCTCCAGATCAGGAAGGACGGCAAGTGGCTCACCATCGAAGCC CTCGACGGCGCGTTCGTCGTCAACGTCGGCGACATGCTTGAGGTAAAATATTGACCAGGCTTTCACCTGATGCGTCG ATCTGAAACCGAAACAGTTTTTCTTTGCTGATCGATGTTGAATTGCTGGTGCACACCAGTACAGAGTTTCTAGCTTA ATCATCTACCAACATGGCTGCTGCTTGCAGATTCTGAGCAATGGGAGGTACAGGAGCGTTGAGCACAGGGCCGTGGT GCACCCGGAGAAGGAGCGCATCTCGGCGGCGGTGTTCCACCAGGCGTGCCGGGACGCGACGGTCGGGCCTCTGCCGG
AGCTCGTGACGAAGGACGGTGGCAGGCCGGTGTACAAGTCGATGGCCTACGAGGATTTCATGAAGCGCTTCTTCTCG GCCAAACTTGACGGAAGGGCTAACGTCGAGGGCATGA
(SEQ ID NO ： 1)
本发明还涉及与 SEQ ID NO ： 1 所示序列互补的核苷酸序列， 或其具有促进植物籽 粒变大功能的选自如下的变体 ：
1) 在高等严紧条件下与 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，
2) 对 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、 缺失、 添加修 饰的核苷酸序列， 和
3) 与 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列具有至少 90％的序列同一性的核苷酸序列。
典型地， “杂交条件” 根据测量杂交时所用条件的 “严紧性” 程度来分类。严紧性 程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度 (Tm) 为依据。例如， “最大严紧性” 典 型地发生在约 Tm-5℃ ( 低于探针 Tm 5℃ ) ； “高等严紧性” 发生在 Tm 以下约 5-10℃； “中等 严紧性” 发生在探针 Tm 以下约 10-20℃ ； “低严紧性” 发生在 Tm 以下约 20-25℃。作为替 代， 或者进一步地， 杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和 / 或一或多次的严紧性洗 涤为依据。例如， 6×SSC ＝极低严紧性 ； 3×SSC ＝低至中等严紧性 ； 1×SSC ＝中等严紧性 ； 0.5×SSC ＝高等严紧性。从功能上说， 可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一 或近严紧同一的核酸序列 ； 而采用高等严紧性条件确定与该探针有约 80％或更多序列同 一性的核酸序列。
对于要求高选择性的应用， 典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体， 例如， 选择相对低的盐和 / 或高温度条件。Sambrook 等 (Sambrook， J. 等 (1989) 分子克隆， 实验 室手册， Cold Spring HarborPress， Plainview， N.Y.) 提供了包括中等严紧性和高等严紧 性在内的杂交条件。
为便于说明， 用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧 条件包括 ： 用 5×SSC、 0.5％ SDS、 1.0mM EDTA(pH8.0) 溶液预洗 ； 在 50-65℃下在 5×SSC 中 杂交过夜 ； 随后用含 0.1 ％ SDS 的 2×、 0.5× 和 0.2×SSC 在 65 ℃下各洗涤两次 20 分钟。 本领域技术人员应当理解， 能容易地操作杂交严紧性， 如改变杂交溶液的含盐量和 / 或杂 交温度。例如， 在另一个实施方案中， 合适的高度严紧杂交条件包括上述条件， 不同之处在 于杂交温度升高到例如 60-65℃或 65-70℃。
在本发明中， 所述在高等严紧条件下与 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列杂交的核 苷酸序列， 其具有与 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列相同或相似的促植物籽粒变大活性。
在本发明中， 所述对 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、 缺失、 添加修饰的核苷酸序列， 是指分别或同时在所述核苷酸序列的 5’ 端和 / 或 3’ 端， 和 / 或序列内部进行例如不超过 2-45 个， 或者不超过 2-30 个， 或者不超过 3-20 个， 或者不超 过 4-15 个， 或者不超过 5-10 个， 或者不超过 6-8 个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取 代、 缺失、 添加修饰。
在本发明中， 所述对 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列进行如上述一个或多个碱基 的取代、 缺失、 添加修饰的核苷酸序列具有与 SEQ IDNO ： 1 所示的核苷酸序列相同或相似的 促植物籽粒变大活性。
通过一种多核苷酸进行说明， 其所具有的核苷酸序列例如与 SEQID NO ： 1 的参考核苷酸序列至少具 95％的 “同一性” 是指 ： 在 SEQ IDNO ： 1 的参考核苷酸序列之每 100 个核 苷酸中， 该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达 5 个核苷酸的不同外， 该多核苷酸之核苷 酸序列与参考序列相同。换句话说， 为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少 95％相同 的多核苷酸， 参考序列中多达 5％的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代 ； 或可将一些核 苷酸插入参考序列中， 其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的 5％ ； 或在一些核苷 酸中， 存在删除、 插入和替换的组合， 其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的 5％。 参考 序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的 5’ 或 3’ 末端位置， 或在这些末端位置之间的 任意地方， 它们或单独散在于参考序列的核苷酸中， 或以一个或多个邻近的组存在于参考 序列中。
在本发明中， 用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是例如 BLAST 和 BLAST 2.0 算 法， 它 们 分 别 描 述 在 Altschul 等 (1977)Nucl.Acid.Res.25 ： 3389-3402 和 Altschul 等 (1990)J.Mol.Biol.215 ： 403-410。采用例如文献中所述或者默认参数， BLAST 和 BLAST 2.0 可以用于确定本发明的核苷酸序列同一性百分数。执行 BLAST 分析的软件可 以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。
在本发明中， 所述与 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列具有至少 90％的序列同一 性的核苷酸序列包括与 SEQ ID NO ： 1 所公开序列基本同一的多核苷酸序列， 例如当采用本 文所述方法 ( 例如采用标准参数的 BLAST 分析 ) 时， 与本发明多核苷酸序列相比含有至少 90％序列同一性、 优选至少 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％或更高的 序列同一性的那些序列。 在本发明中， 所述与 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列具有至少 90％的序列同一性 的核苷酸序列具有与 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列相同或相似的促植物籽粒变大活性。
在本发明中， 所述的 BGIos372 基因来源于普通野生稻元江 (Oryza.rifupongon Yuanjiang)。
本发明的另一方面涉及一种载体， 其特征在于， 所述载体含有本发明所述的核苷 酸序列， 所述载体可以通过例如将上述核苷酸序列插入克隆载体或表达载体而得到， 或者 可以通过人工合成得到。
本发明的另一方面涉及一种重组载体， 其特征在于所述重组载体含有本发明所述 的核苷酸序列， 所述重组载体可以通过将上述核苷酸序列插入克隆载体或表达载体而得 到。
适于构建本发明所述重组载体的克隆载体包括但不限于， 例如 ： pUC18、 pUC19、 pUC118、 pUC119、 pMD19-T、 pMD20-T、 pMD18-T SimpleVecter、 pMD19-T Simple Vecter 等。
适于构建本发明所述的表达载体包括但不限于， 例如 ： pBI121、 p13W4、 pGEM 等。
在本发明的一个实施方案中， 所述重组载体为 p6+BGIos372 重组载体。
本发明的另一方面涉及一种含有本发明所述载体的重组细胞， 所述重组细胞可以 通过将含有本发明所述的载体转化至宿主细胞而得到。
适于构建本发明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于， 例如 ： 根癌农杆菌细胞 LBA4404、 EHA105、 GV3101 等。
在 本 发 明 的 一 个 实 施 方 案 中， 所 述 重 组 细 胞 为 重 组 农 杆 菌 (Agrobacterium tumefaciens)EHA105-p6+BGIos372。
本发明的还一方面涉及一种单子叶植物愈伤组织， 其特征在于， 所述愈伤组织转 化有本发明的核苷酸序列和 / 或载体和 / 或感染有本发明的重组细胞。
本发明的还一方面涉及一种转基因植物， 其特征在于， 所述转基因植物转化有本 发明的核苷酸序列和 / 或载体和 / 或感染本发明的重组细胞。
本发明的还一方面涉及本发明的核苷酸序列和 / 或载体和 / 或重组细胞用于促进 植物籽粒变大的用途， 以及用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。
本发明的还一方面涉及本发明的愈伤组织用于制备转基因植物或用于植物育种 的用途。
本发明的还一方面涉及一种促进植物籽粒变大的方法， 所述方法包括将本发明的 核苷酸序列和 / 或载体转化入植物， 或用本发明的重组细胞感染植物。
所述方法包括用本发明的核苷酸序列转化单子叶植物的愈伤组织的步骤。 在本发 明的一个实施方案中， 所述单子叶植物愈伤组织的转化利用了含有本发明的核苷酸序列的 重组细胞。在本发明的一个实施方案中， 所述单子叶植物愈伤组织的转化过程中利用了前 述的重组农杆菌 EHA105-p6+BGIos372。在本发明的一个具体实施方案中， 所述单子叶植物 的愈伤组织为水稻愈伤组织， 具体地， 所述水稻为日本晴。 在本发明中， 可采用植物基因转化技术将目的基因插入到植物基因组中， 包括农 杆菌介导转化、 病毒介导的转化、 显微注射、 粒子轰击、 基因枪转化和电穿孔等。本领域周 知， 农杆菌介导的基因转化常被用于单子叶植物和双子叶植物的基因转化， 但其它转化技 术也可用于本发明所述单子叶植物的基因转化。当然， 适于本发明的转化单子叶植物的另 一种方法是粒子轰击 ( 显微金或钨粒子包覆转化的 DNA) 胚性愈伤组织或胚胎开发。另外， 还可以采用的转化单子叶植物的方法是原生质体转化。基因转化后， 采用通用的方法来筛 选和再生整合有表达单元的植株。
本发明的还一方面涉及一种产生籽粒变大的转基因植物的方法， 所述方法包括以 下步骤 ：
1) 将本发明的核苷酸序列和 / 或载体转化入植物愈伤组织， 或用本发明的重组细 胞感染植物愈伤组织 ；
2) 利用所述愈伤组织再生转基因植物。
在本发明中， 所述植物优选是单子叶植物， 所述单子叶植物包括但不限于水稻、 谷 子、 小麦、 高粱、 玉米， 特别优选为水稻， 所述水稻包括但不限于， 中花 9、 中花 10、 中花 11、 台 北 309、 丹江 8 号、 云稻 2 号、 汕优 63、 汕优 608、 丰优 22， 黔优 88、 II 优 416、 II 优 107、 II 优 128、 II 优 718、 准两优 527、 川农 1 号、 杂 0152、 皖稻 88、 皖稻 90、 皖稻 92、 皖稻 94、 皖稻 96、 皖稻 185、 皖稻 187、 皖稻 189、 皖稻 191、 皖稻 193、 皖稻 195、 皖稻 197、 皖稻 199、 皖稻 201、 皖 稻 203、 皖稻 205、 皖稻 207， 以及津原 101( 上述水稻品种均可购自安徽徽商农家福有限公 司 )。在本发明的一个实施方案中， 所述水稻为日本晴。
在本发明中， 所述籽粒变大是指在饱满程度相当的情况下， 籽粒体积变大， 千粒重 增加。
在本发明的一个实施方案中， 发明人从水稻元江中扩增得到基因 BGIos372， 将该 基因重组入新构建的 p6 载体中得到含有该基因的重组表达载体， 转化根癌农杆菌， 利用重 组农杆菌转化水稻愈伤组织， 通过水稻愈伤组织的 GUS 染色、 转基因小苗根、 叶 GUS 染色及
转基因水稻籽粒的性状观察， 并与未转入 BGIos372 基因的组织或植物对比， 证明 BGIos372 基因能够促进植物籽粒变大。
发明的有益效果
本发明利用高通量测序技术， 通过基因的遗传转化， 挖掘出促进籽粒变大的 BGIos372 基因， 所述基因能够大大提高转基因植物的千粒重， 证明了 BGIos372 基因是与控 制水稻颗粒大小的数量性状相关的功能基因， 这将有利于在分子水平上更深入探讨该性状 形成的生理机理和机制， 达到对产量和品质的合理调控作用， 对水稻的遗传育种产生重大 的意义。
关于生物材料保藏的说明
本发明涉及以下生物材料 ：
普通野生稻元江种子， 其于 2010 年 9 月 6 日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉 大学保藏中心， 即中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 保藏编号为 CCTCC P201011。 附图说明
图 1p6 载体示意图。 图 2 经转化的水稻愈伤组织的 GUS 染色结果。 其中， 由带有本发明所述 BGIos 372 基因的重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos372 转化的水稻愈伤组织 ( 右 ) 经 GUS 染色后呈 现蓝色 ； 不带有本发明 BGIos372 基因的重组根癌农杆菌 EHA105-p6 质粒的水稻愈伤组织 ( 对照， 左 ) 经 GUS 染色后颜色未发生变化。
图 3 转基因水稻的籽粒观察。其中， 经含有 p6+BGIos372 重组载体的根癌农杆菌 介导转化的水稻籽粒 ( 图 3 右 ) 与阴性对照 ( 图 3 左 ) 相比， 籽粒更大。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述， 但是本领域技术人员将会 理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限定本发明的范围。 实施例中未注明具体 条件者， 按照常规条件或制造商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为 可以通过市购获得的常规产品。
实施例 1BGIos372 基因的 PCR 扩增和 pMD18-T+BGIos372 重组载体的构建
PCR 扩增
使用植物基因组 DNA 提取试剂盒 (TIANGEN 新型植物基因组 DNA 提取试剂盒， 目录 号： DP320-02) 提取普通野生稻元江 (Oryza.rifupongonYuanjiang) 的基因组 DNA， 根据该 基因在 gDNA 中的序列， 分别在首尾设计一对 PCR 特异性扩增引物 ( 上游引物 F1， 加限制性 酶切位点 BamHI 和保护碱基， 下游引物 R1， 加限制性酶切位点 Xba I 和保护碱基 )。以上述 提取的元江的 gDNA 为模板， 高保真 Ex Taq(TaKaRa， DRR100B) 聚合酶进行 PCR 扩增。如表 1 所示。
表 1 目的基因扩增的 PCR 体系
PCR 扩增程序为 ： 94℃预变性 5min， 然后以 94℃变性 45s， 55℃退火 50s， 72℃延伸 90s， 进行 35 个反应循环， 最后 72℃延伸 7min。
其中， 上游引物 F1 ： CGCGGATCCATGTCTCTACAGGTGCCAAATG(SEQ ID NO ： 2)， 含 BamHI 酶切位点。下游引物 R1 ： TGCTCTAGAAATCTTCATGCCCTCGACGTTAG(SEQ ID NO ： 3)， 含 Xba I 酶 切位点。
PCR 扩增产物经 1.0％琼脂糖凝胶电泳分离， 得到大小为 1570bp 左右的条带， 使用 TIANGEN 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒 ( 目录号 ： DP209-03) 进行纯化回收。
pMD18-T+BGIos372 重组载体的构建
将上述得到的 PCR 扩增产物进行 T/A 克隆 (pMD18-T 质粒， TaKaRa， D103A)， 转化大 证明准确。 肠杆菌， 挑取阳性克隆测序，
其中， T/A 克隆的连接条件如下 ：
T/A 连接体系 ： 10μl
pMD18-T 1μl
2×solution I 5μl
PCR 扩增产物 ( 回收插入片段 )10-20ng， 根据其浓度定
ddH2O 补齐至 10μl
于 16 ℃ 在 节 能 型 智 能 恒 温 槽 ( 宁 波 新 芝， SDC-6) 中 连 接 8h 以 上， 得到 pMD18-T+BGIos372 重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌 ：
从超低温冰箱中取出按照 《分子克隆实验指南》 ( 第三版， 科学出版社 ) 所示氯化 钙法制备的感受态细胞 100μl DH5α( 中国科学院昆明动物研究所董杨提供 ； 或者可从例 如： 上海生工购得 )， 冰上融化后， 加入 10μl 如上所得的连接产物， 即 pMD18-T+BGIos372 重组载体， 轻轻搅匀， 冰浴 30min， 42℃热激 60s， 冰浴 5min， 加入 600μl4℃预冷的 SOC 培养 基 ( 具体配方详见 《分子克隆实验指南》 ， 第三版， 科学出版社 )， 37℃ 220rpm 复苏 45min， 8000rpm 离心 30s， 去上清， 留取 150μl， 用剩下的 150μl 上清重悬沉淀后的混合物， 轻轻吹 匀， 玻璃珠涂布 LB( 加卡那霉素， Kan) 平板 ( 具体配方详见 《分子克隆实验指南》 ， 第三版， 科学出版社 )， 37℃倒置培养 16-24h。获得含有 pMD18-T+BGIos372 克隆载体的重组大肠杆 菌， 命名为 DH5α-BGIos372。 深圳华大基因科技有限公司对 pMD18-T+BGIos372 克隆载体中 的 BGIos372 进行测序， 测序结果与 SEQ ID NO ： 1 一致。表明获得的 pMD18-T+BGIos372 克 隆载体中 BGIos372 基因序列正确。
实施例 2p6 重组载体的构建
1) 玉米 Ubiquitin 启动子片段的 PCR 扩增和 pMD18-T+Ubi 重组载体的构建
Ubi 启动子 PCR 扩增
使用植物基因组 DNA 提取试剂盒 (TIANGEN 新型植物基因组 DNA 提取试剂盒， 目
录号 ： DP320-02) 提取玉米品种 B73(Zea mays mays cv.B73) 的基因组 DNA(http://www. maizegdb.org/)， 根据该启动子在玉米 B73gDNA 中的序列， 分别在首尾设计一对 PCR 特异性 扩增引物 ( 上游引物 F2 ： GGCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTCGT(SEQ ID NO ： 4)， 加限制性酶切位 点 Pst I 和保护碱基， 下游引物 R2 ： GGCTGCAGAAGTAACACCAAAC(SEQ ID NO ： 5)， 加限制性酶 切位点 Pst I 和保护碱基 )。 以上述提取的玉米 B73 的 gDNA 为模板， 高保真 Ex Taq(TaKaRa， DRR100B) 聚合酶进行 PCR 扩增。如表 2 所示。
表 2Ubi 启动子扩增的 PCR 体系
PCR 扩增程序为 ： 94℃预变性 5min， 然后以 94℃变性 45s， 55℃退火 50s， 72℃延伸 90s， 进行 35 个反应循环， 最后 72℃延伸 7min。
PCR 扩增产物经 1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后， 使用 TIANGEN 琼脂糖凝胶 DNA 回收 试剂盒 ( 目录号 ： DP209-03) 纯化回收。
pMD18-T+Ubi 重组载体的构建
将上述得到的 PCR 扩增产物进行 T/A 克隆 (pMD18-T 质粒， TaKaRa， D103A)， 转化大 肠杆菌， 挑取阳性克隆由深圳华大基因科技有限公司测序， 证明准确。
其中， T/A 克隆的连接条件如下 ：
T/A 连接体系 ： 10μl
pMD18-T 1μl
2×solution I 5μl
PCR 扩增产物 10-20ng， 根据其浓度定
ddH2O 补齐至 10μl
于 16 ℃ 在 节 能 型 智 能 恒 温 槽 ( 宁 波 新 芝， SDC-6) 中 连 接 8h 以 上， 得到 pMD18-T+Ubi 重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌 ：
从超低温冰箱中取出按照 《分子克隆实验指南》 ( 第三版， 科学出版社 ) 所示氯 化钙法制备的感受态细胞 100μl DH5α( 中国科学院昆明动物研究所董杨提供 ； 或者可从 例如 ： 上海生工购得 )， 冰上融化后， 加入 10μl 如上所得的连接产物， 即 pMD18-T+Ubi 重 组载体， 轻轻搅匀， 冰浴 30min， 42℃热激 60s， 冰浴 5min， 加入 600μl 4℃预冷的 SOC 培养 基 ( 具体配方详见 《分子克隆实验指南》 ， 第三版， 科学出版社 )， 37℃ 220rpm 复苏 45min， 8000rpm 离心 30s， 去上清， 留取 150μl， 用剩下的 150μl 上清重悬沉淀后的混合物， 轻轻 《分子克隆实验指南》 ， 第三版， 科学 吹匀， 玻璃珠涂布 LB( 卡那霉素 ) 平板 ( 具体配方详见 出版社 )， 37℃倒置培养 16-24h。获得含有 pMD18-T+Ubi 克隆载体的重组大肠杆菌， 命名为
DH5α-Ubi。
2)pCAMBIA-1301+Ubi 重组载体的构建
按照 TIANGEN 普通质粒小提试剂盒 ( 目录号 ： DP103-03) 的操作手册， 从步骤 1) 构 建的转化有启动子 Ubi 的大肠杆菌 DH5α-Ubi 中提取带有玉米 Ubi 启动子序列的克隆载体 pMD18-T+Ubi ； 纯化后用相应的限制性内切酶 Pst I(NEB) 进行酶切， 然后用 TIANGEN 琼脂糖 凝胶 DNA 回收试剂盒 ( 目录号 ： DP209-03) 回收相应的启动子片段。
同时用限制性内切酶 Pst I 酶切 pCAMBIA-1301 质粒 ( 中国科学院昆明动物研究 所董杨提供 ； 或者可从例如上海国瑞基因科技有限公司购得， 该公司的 pCAMBIA-1301 质粒 的原始来源是 The CAMBIA Bios(biological open source)Licensee， Australia) 并回收。
酶切体系 ： 50μl
ddH2O 34.9μl
10*buffer 35μl
Pst I 0.1μl(10U)
克隆载体 pMD18-T+Ubi 或 pCAMBIA-1301 质粒 10μl( ＜ 1000ng)
将回收的启动子片段 Ubi 与回收的载体片段根据 T4 连接酶 (TaKaRa， D2011A) 操 作说明， 按照如下条件进行连接 ： 连接体系 ： 10μl
10×T4buffer 1μl
回收的 pCAMBIA-1301 质粒 1μl(20ng)
回收的启动子 Ubi 插入片段 10-20ng， 根据其浓度定
ddH2O 补齐至 9.5μl
T4ligase(TaKaRa， D2011A)0.5μl
于 16℃节能型智能恒温槽 ( 宁波新芝， SDC-6) 中连接 8h 以上。
将 100μl 氯化钙法制得的感受态细胞 DH5α 从超低温冰箱取出， 冰上融化后， 加 入 10μl 上面的连接产物， 轻轻搅匀， 冰浴 30min， 42℃热激 60s， 冰浴 5min， 加 600μl 4℃ 预冷的 SOC， 37℃下 220rpm 复苏 45min， 8000rpm 离心 30s， 去上清， 留取 150μl， 轻轻吹匀， 玻璃珠涂布 LB(Kan)， 37℃倒置培养 16-24h。得到重组载体 pCAMBIA-1301+Ubi。
分别以 F2 和 R2 为引物对所得重组载体 pCAMBIA-1301+Ubi 进行 PCR 检测， 以确证 所得重组载体 pCAMBIA-1301+Ubi 中含有所需启动子 Ubi。
3)NOS 终止子的 PCR 扩增和 pMD18-T+NOS 重组载体的构建
根据 pCAMBIA-1301 质粒中 NOS 终止子的序列， 分别在首尾设计一对 PCR 特异性扩 增引物 ( 上游引物 F3 ： GGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAA(SEQ ID NO ： 6)， 加限制性酶切位 点 Sac I 和保护碱基， 下游引物 R3 ： GGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT(SEQ ID NO ： 7)， 加限 制性酶切位点 EcoR I 和保护碱基 )。以上述提取的 pCAMBIA-1301 质粒为模板， 高保真 Ex Taq(TaKaRa， DRR100B) 聚合酶进行 PCR 扩增。如表 3 所示。
表 3NOS 终止子扩增的 PCR 体系
将上述得到的 PCR 扩增产物进行 T/A 克隆 (pMD18-T 质粒， TaKaRa， D103A)， 转化大 肠杆菌， 获得含有 pMD18-T+NOS 克隆载体的重组大肠杆菌， 命名为 DH5α-NOS。挑取阳性克 隆由深圳华大基因科技有限公司测序， 证明准确。
4)pCAMBIA-1301+Ubi+NOS 即 p6 重组载体的构建
按照 TIANGEN 普通质粒小提试剂盒 ( 目录号 ： DP103-03) 的操作手册， 提取步骤 3) 构建的克隆载体 pMD18-T+NOS ； 纯化后用相应的限制性内切酶 Sac I(NEB) 和 EcoR I(NEB) 进行酶切， 然后用 TIANGEN 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒 ( 目录号 ： DP209-03) 回收相应的 NOS 终止子片段。同时用限制性内切酶 Sac I 和 EcoR I 酶切 pCAMBIA-1301+Ubi 质粒并回收。
酶切体系 ： 50μl
ddH2O 34.9μl
10*buffer 15μl
Sac I 0.1μl(10U)
EcoR I 0.1μl(10U)
载体 pMD18-T+NOS 或 pCAMBIA-1301+Ubi 质粒 10μl( ＜ 1000ng)
将回收的终止子片段 NOS 与回收的载体片段用 T4 连接酶进行连接， 转化感受态细 胞 DH5α 得到重组载体 pCAMBIA-1301+Ubi+NOS， 即 p6( 参见图 1)。
实施例 3p6+BGIos372 重组载体的构建
提 取 pMD18-T+BGIos372 质 粒， 并 用 限 制 性 内 切 酶 BamHI/Xba I 酶 切 后 回 收 BGIos372 基因片段， 同时提取 p6 质粒， 并用相应的限制性内切酶 BamHI/XbaI 酶切后回收大 片段， 将回收产物进行连接， 随后转化感受态细胞 DH5α 得到重组载体 p6+BGIos372。筛选 阳性克隆进行 PCR 检测后测序确定。
实施例 4 重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos372 细胞的制备
将如实施例 3 所述方法构建的 p6+BGIos372 重组载体质粒， 转化按照 《分子克隆 实验指南》 ( 第三版， 科学出版社 ) 中所述氯化钙方法制备的根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)EHA105( 已经于 2010 年 9 月 22 日在申请号为 200910238992.0， 发明名称为一 种启动子 BgIosP587、 其制备方法及用途的专利文献中公开， 保藏编号为 CCTCC M 209315) 感受态细胞， 具体方法如下 ：
将根癌农杆菌感受态细胞 EHA105 于超低温冰箱中取出， 至于冰上解冻。融化后， 加入 5μl 的 p6+BGIos372 重组载体， 轻轻混匀， 冰浴 10min， 放入液氮中冷冻 5min， 37℃解 冻 5min， 加入 800μl 常温的 LB 液体培养基， 28℃ 160rpm 复苏 3h， 8000rpm 离心 30s， 吸去
上清， 留下 200μl 吹匀， 涂布于加有 kan-rif( 卡那霉素 - 利福平 ) 双抗的 YM 培养基平板 上 (50mg/l Kan， 10mg/l Rif， 具体配方参见表 4)。28℃倒置培养 2-3 天。
以 F1 和 R1 为引物进行 PCR 检测和通过 BamHI/XbaI 酶切筛选转化子。PCR 扩增出 约 1570bp 左右条带和酶切出约 1570bp 左右条带的为重组载体 p6+BGIos372 的重组根癌农 杆菌。
本发明中， 按照如上述方法得到的带有重组载体 p6+BGIos372 的重组农杆菌， 命 名为重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos372 ； 同时设立带有空载体 p6 的重组根癌农杆菌， 即 EHA105-p6 作为本发明的阴性对照， 用于后续实验。
实施例 5 水稻愈伤组织的诱导和转化
按照如下步骤诱导水稻愈伤组织， 并分别用重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos372 转化所述愈伤组织。
1) 将水稻日本晴种子 ( 已经于 2010 年 9 月 22 日在申请号为 200910238992.0， 发 明名称为一种启动子 BgIosP587、 其制备方法及用途的专利文献中公开， 保藏编号为 CCTCC P200910) 去壳， 70％乙醇表面消毒 30s， 然后用有效氯 1.5％的次氯酸钠消毒 30min， 期间剧 烈摇动， 消毒后用灭菌水清洗 5 次 ； 将消毒后的种子置于 N6D 培养基 ( 具体配方参见表 4) 上， 用封口膜封口 ； 29.5℃光照培养 3-4 周 ；
2) 选取活跃生长的愈伤组织 ( 黄白色， 干燥， 直径 1-3mm)， 在新 N6D 培养基上 29.5℃光照培养 3 天 ；
3) 分别挑取如实施例 4 所构建的重组根癌农杆菌单菌落 ( 重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos372)， 于添加抗生素 (50mg/l Kan， 10mg/lRif) 的 YM 培养基 ( 具体配方参 见表 5、 表 6) 上划线培养 3 天， 培养温度 28℃ ； 分别刮取上述重组根癌农杆菌置于添加了 30μl 100mM 的 AS(Acetosyringone， 乙酰丁香酮 ) 的 30ml AAM 培养基 ( 具体配方参见表 7) 中， 温和重悬所述重组根癌农杆菌细胞 ( 重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos372) ；
4) 将继代培养的愈伤组织置于灭菌培养皿中 ； 将如步骤 3) 制备的重组根癌农杆 菌悬液倒入培养皿中， 将愈伤组织浸入其中 15min ；
5) 倒掉重组根癌农杆菌悬液， 将愈伤组织用灭菌吸水纸吸掉多余的液体 ； 于 N6-AS 培养基 ( 配方参见表 8) 上放一张灭菌滤纸， 加 1ml 如上述含 AS 的 AAM 培养基， 将愈 伤组织转移至滤纸上 ； 密封培养皿， 28℃暗培养 48-60h ；
6) 将受感染的愈伤组织置于 50ml 灭菌管中， 用灭菌水摇动清洗， 直至上清液变 澄清 ； 将愈伤组织浸泡于含 500mg/l 羧苄青霉素 (Carb) 的无菌水中以杀死重组根癌农杆 菌； 用灭菌吸水纸除去愈伤组织上多余的水分， 然后将其转移至含 1mg/l 潮霉素 B(HmB) 和 50mg/l Carb 的 N6-AS 培养基上 ； 用封口膜密封培养皿， 29.5℃光照培养 3-4 周。
实施例 6 水稻愈伤组织中的 GUS 的表达
为检测经过实施例 5 所述转化的水稻愈伤组织中目的基因 GUS 的表达情况， 按照 Chen S Y 等在 Journal of Integrative Plant Biology， 2008， 50(6) ： 742-751 所述的方 法， 对分别用重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos372 转化的水稻愈伤组织进行染色。
GUS 染色液的配方 (1ml) ： 610μl 0.2M Na2HPO4 溶液 (pH ＝ 7.0) ； 390μl 0.2M NaH2PO4 溶液和 10μl 0.1M X-gluc。
将用重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos372 转化的水稻愈伤组织浸泡在 GUS 染色液中， 37℃保温至出现蓝色， 拍照记录， 结果如图 2 所示， 含有 p6+BGIos372 重组载体的根癌 农杆菌介导转化的水稻愈伤组织 ( 图 2 右 ) 经染色后呈现蓝色， 阴性对照 ( 图 2 左 ) 经 GUS 染色后颜色未发生变化。结果显示， 本发明 p6+BGIos372 转入水稻愈伤组织。
实施例 7 ： 转基因水稻苗中 GUS 的表达
将实施例 5 中得到的愈伤组织转移至含 50mg/l 潮霉素 B(HmB) 的 MS-R 分化培养 基 ( 具体配方见表 9) 分化苗 ； 用封口膜密封培养皿， 29.5℃光照培养 3-4 周 ； 待幼苗长至 3-4cm 时转移到含 50mg/l 潮霉素 B(HmB) 的 1/2MS 生根培养基 ( 具体配方参见表 10) 进行 生根筛选。
转基因水稻苗的 GUS 染色过程同实施例 6 中愈伤组织的染色过程。结果显示经含 有 p6+BGIos372 重组载体的根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根和叶经染色后呈现蓝色， 阴 性对照的根和叶经 GUS 染色后颜色未发生变化。表明本发明 p6+BGIos372 转入水稻苗中。
实施例 8 ： 转基因水稻籽粒的性状观察
待实施例 7 的转基因水稻幼苗和对照幼苗在培养基中生长 20 天后， 平行条件移栽 入大田， 平行条件培养至收获籽粒。转基因水稻和对照分别观察了 52 株， 其中 48 株转基因 水稻的籽粒饱满， 且均比对照大 ( 参见图 3， 其中右侧为含有 BGIos372 基因的转基因水稻籽 粒， 左侧为阴性对照 )。
本发明实施例中所使用的相关培养基配方说明如下 ：
以下有关培养基中所称的 “常规灭菌” 是指如下条件的灭菌 ： 121 ℃下蒸气灭菌 20min。
表 4N6D 培养基
用 1N 氢氧化钾调节 pH 值到 5.8， 封口后按常规方法灭菌。
N6macro 母液 (20X) ： 硝酸钾 56.60g， 磷酸二氢钾 8.00g， 硫酸铵 9.26g， 硫酸镁 3.70g， 氯化钙 3.32g， 蒸馏水定容至 1L， 4℃保存备用。
N6micro 母液 (1000X) ： 碘化钾 0.80g， 硼酸 1.60g， 硫酸锰 3.33g， 硫酸锌 1.50g， 蒸 馏水定容至 1L， 4℃保存备用。
铁盐 (Fe2EDTA) 贮存液 (100X) ： 将 3.73g 乙二铵四乙酸二钠 (Na2EDTA·2H2O) 和
2.78g FeSO4.7H2O 分别溶解， 混合并用。用蒸馏水定容至 1000ml， 70 温浴 2h， 冷却后 4℃保 存不超过 1 个月。
N6 维生素贮存液 (1000X) ： 维生素 B10.10g， 维生素 B60.05g， 烟酸 0.05g， 甘氨酸 0.20g， 加蒸馏水定容至 100ml， 过滤除菌， 4℃保存不超过 1 周。
表 5YM 液体培养基 ( 含有 50mg/L Kan， 10mg/L Rif)
表 6YM 固体培养基 ( 含有 50mg/L Kan， 10mg/L Rif)
表 7AAM 培养基
1N 氢氧化钾调节 pH 值至 5.2， 常规灭菌。
AAM macro(10X) ： 2.5g 七水硫酸镁 (MgSO4· 7H2O)， 1.5g 二水氯化钙 (CaCl2· 2H2O)， 1.33g 二水磷酸二氢钠 (NaH2PO4.2H2O)， 蒸馏水定容至 1L， 4℃保存备用。
AAM micro(100X) ： 0.7g 单水硫酸锰 (MnSO4· H2O)， 0.2g 七水硫酸锌 (ZnSO4· 7H2O)， 0.075g 碘化钾 (KI)， 0.3g 硼酸 (H3BO3)， 25mg 二水钼酸钠 (Na2MoO4.2H2O)， 2.5mg 五水硫酸铜 (CuSO4.5H2O)， 2.5mg 六水氯化钴 (CoCl2.6H2O)， 蒸馏水定容至 1L， 4℃保存备用。
AAM 有机 (1000X) ： 0.75g 甘氨酸 (Glycine)， 0.1g 烟酸 (Nicotinic acid)， 0.1g VB6(Pyridoxine)， 1g VB1(Thiamine)， 蒸馏水定容至 100ml， 4℃保存备用。
铁盐 (Fe2EDTA) 贮存液 (100X) ： 见表 2。
表 8N6-AS 共培养基
调 pH 至 5.2。
N6macro 母液 (20X)， N6micro 母液 (1000X)， 铁盐 (Fe2EDTA) 贮存液 (100X)， N6 维 生素贮存液 (1000X) ： 均见表 2。
表 9MS-R 分化培养基
调 PH 值至 5.8， 常规方式灭菌。
MS macro(20X) ： 硝酸铵 33.0g， 硝酸钾 38.0g， 磷酸二氢钾 3.4g， 硫酸镁 7.4g， 氯化 钙 8.8g 逐一溶解， 然后室温下用蒸馏水定容至 1L， 4℃保存。
MS micro(1000X) ： 硫酸锰 16.90g， 硫酸锌 8.60g， 硼酸 6.20g， 碘化钾 0.83g， 钼酸 钠 0.25g， 硫酸铜 0.025g， 氯化钴 0.025g， 上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至 1L， 4℃ 保存。
MS 维生素贮存液 (1000X) ： 维生素 B10.010g， 维生素 B60.050g， 烟酸 0.050g， 甘氨 酸 0.200g， 加蒸馏水定容至 100ml， 过滤除菌， 4℃保存不超过 1 周。
铁盐 (Fe2EDTA) 贮存液 (100X) ： 见表 2。
表 101/2MS 生根培养基
调 PH 值至 5.8。 MS macro(20X) 见表 9。 MS micro(1000X)MS 维生素贮存液 (1000X) 见表 9。铁盐 (Fe2EDTA) 贮存液 (100X) ： 见表 4。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述， 本领域技术人员将会理解。根 据已经公开的所有教导， 可以对那些细节进行各种修改和替换， 这些改变均在本发明的保 护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。18102094017 A CN 102094023
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