植物多酚与风化煤腐植酸降解物的接枝物及接枝方法.pdf

本发明提供了一种植物多酚与风化煤腐植酸降解物的接枝物及接枝方法，试验证明，本发明的植物多酚与风化煤腐植酸降解物的接枝物，有改善心血管疾病的功效，具有改善胆固醇在血管内皮的沉淀，避免血管内皮细胞损伤，防治动脉硬化的作用方面，药理调节范围更宽，疗效更明显。结构式如式(1a)或式(1b)所示。

1.  植物多酚与风化煤腐植酸降解物的接枝物，其特征在于，为具有如式(1a)或式(1b)所示的化合物：

其中，R₁代表H或OH；R₂代表H或


2.  根据权利要求1所述的植物多酚与风化煤腐植酸降解物的接枝物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将风化煤腐植酸原料粉碎，然后与硝酸混合氧解；
(2)然后，在上述的氧解产物中加入硫酸进行反应，获得活化的风化煤腐植酸；
(3)然后，将所述的活化的风化煤腐植酸在催化量的季铵盐存在下，与甲醇和甲醇钠反应，获得风化煤腐植酸降解物；
(4)植物多酚与风化煤腐植酸降解物的接枝：
将植物多酚与步骤(3)获得的风化煤腐植酸降解物，置于微波反应器中，加入催化剂，反应，获得植物多酚与风化煤腐植酸降解物的接枝物；
所述催化剂为甲醇、氢氧化钾和环氧氯丙烷的混合物。

3.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，将风化煤腐植酸粉碎，然后与重量浓度为20-50％的硝酸混合，在50-105℃氧解风化煤腐植酸，氧解时间2-10小时，风化煤腐植酸∶硝酸＝100∶5～20，重量比。

4.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，在氧解产物中加入重量浓度为50-98％的硫酸进行反应，反应温度为70-125℃，时间0.5-5小时，风化煤腐植酸∶硫酸＝100∶1～5，重量比。

5.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的活化的风化煤腐植酸在催化量的季铵盐存在下，与甲醇和甲醇钠在30～65℃下反应0.5～3小时；
甲醇与甲醇钠的重量比为2～5：1，甲醇的加入重量为风化煤腐植酸的20～100％；
所述季铵盐选自十二烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵或者十八烷基三甲基氯化铵，加入的比例为活化的风化煤腐植酸重量的0.1～1％。

6，  .根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，微波频率915～2450MHz，微波功率300～500W下，15～50℃温度反应5～15min；
植物多酚与风化煤腐植酸降解物的摩尔比为0.9～1.1∶1；
甲醇、氢氧化钾和环氧氯丙烷的重量比为：甲醇∶氢氧化钾∶环氧氯丙烷＝28～35∶1.0∶60～70。

7.  根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)、(2)和(3)在频率为0.25-650KHz的超声波中进行。

8.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物多酚，为葡萄皮、葡萄籽或者是绿茶叶的提取物，其结构通式如(3)所示：

其中：R₁代表H或OH；R₂代表H或

n＝1～4的整数，当n为1时，为儿茶素类化合物，当n＝2～4时，为儿茶素低聚物。

植物多酚与风化煤腐植酸降解物的接枝物及接枝方法
技术领域
本发明涉及植物多酚与风化煤腐植酸降解物的接枝物及接枝方法。
背景技术
植物多酚是葡萄多酚、茶多酚等酚类物质的总称，主要由儿茶酚类、黄烷醇类和缩聚单宁等物质组成。葡萄多酚、茶多酚具有明显的抗血脂、预防心血管疾病、促进人体微循环等功能，与葡萄籽中原花菁素(procyanidolic oligomers，简称OPC，不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成。最简单的原花菁素是儿茶素的二聚体、三聚体、四聚体等)类多酚的功能分不开，也与葡萄多酚类物中，“泛醌”辅酶(泛醌∽半醌∽氢醌)结构的电子传递作用分不开。
风化煤是由高等植物演变的煤，接近或暴露于地表，长时期受阳光、雨雪、冰冻以及风沙等作用而形成的一类氧化煤。按照我国煤炭总量10025亿吨总储量的10％计，估计有风化煤储量约1000亿吨。新疆不计在“昌吉”等发现的新煤田，仅“哈密”地区的南湖煤田就有风化煤资源3.5亿吨。新疆南湖煤田的风化煤以风化褐煤、风化烟煤为主，其中腐植酸高达65-85％，并且灰分较低，一般在5∽12％的范围。
作为聚电解质的煤炭腐植酸用于心血管疾病的调理已有近20年的历史。如，北京同仁医院袁申元、朱良湘、倪惠兰，中国医学科学院病理、生理研究室薛全福、戴顺玲、吴云清等以中药乌金散的有效成分“黄腐植酸钠(Sodium Fulvate，简称SF)”作临床实验研究发现：SF能增加小鼠心肌营养性血流量，能降低家兔全血和血浆比粘度，能使高血压病患者伴有的甲皱微血管血流速度明显减慢等作用。袁申元等坚持了多年的研究，认为黄腐植酸钠无“致癌”、“致突变”等三致作用，对心肌营养有改善作用(中国微循环，2000，4(2)。李宝才在近年对云南普洱茶中的多酚类(儿茶素、茶黄素、茶红素、茶褐素)与腐植酸比较.提出了普洱茶中的茶色素与腐植酸.尤其是茶褐素和黄腐酸，在化学性质方面(结构和官能团)存在一定的相似性。然而，由于黄腐植酸组成多样性(如，经中科院化学研究所90年代初对某药用黄腐植酸的结构表征：含碳55.23％，氢2.32％，氮0.75％，氧38.35％，各种官能团的含量分别为羧基7.96mmol/g、酚羟基1.43mmol/g、醇羟基0.11mmol/g、甲氧基0.04mmol/g醌基2.4mmol/g，平均分子量1035。.摘自：郑平王兴滨等.黄腐植酸类物质在农业与医药中的应用.化学工业出版社，1993年)，造成生物活性的差异性，致使针对性强的药用研究进展极其缓慢。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物多酚与风化煤腐植酸降解物的接枝物及接枝方法，以克服现有技术存在的药用腐植酸于心血管疾病医治作用机理尚不明确，作用甚小，无法满足临床应用的缺陷。
本发明的植物多酚与风化煤腐植酸降解物的接枝物，为具有如式(1a)或式(1b)所示的化合物：


其中，R₁代表H或OH；R₂代表H或

式(1a)或式(1b)所示的植物多酚与风化煤腐植酸降解物的接枝物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将风化煤腐植酸原料粉碎至80-200目，然后与重量浓度为20-50％的硝酸混合，在50-105℃氧解风化煤腐植酸，氧解时间2-10小时，通过硝酸在氧化过程中生成的新生态氧，促使了原料腐植酸上的芳香结构先氧化成酚羟基，再经过醌基芳香环的破裂，氧解生成更多的羧基，风化煤腐植酸∶硝酸＝100∶5～20，重量比；
(2)然后，在上述的氧解产物中加入重量浓度为50-98％的硫酸，进行反应，反应温度为70-125℃，时间0.5-5小时，在腐植酸官能团中引入磺酸基(-SO₃H)，以提高其水溶性，获得活化的风化煤腐植酸(SNHA)，风化煤腐植酸∶硫酸＝100∶1～5，重量比；
(3)然后，将所述的活化的风化煤腐植酸在催化量的季铵盐存在下，与甲醇和甲醇钠在30～65℃下反应0.5～3小时，获得风化煤腐植酸降解物；
甲醇与甲醇钠的重量比为2～5：1，甲醇的加入重量为风化煤腐植酸的20～100％；
所述季铵盐选自十二烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵或者十八烷基三甲基氯化铵，加入的比例为活化的风化煤腐植酸的0.1～1％；
优选的，步骤(1)、(2)和(3)在频率为0.25-650KHz的超声波中进行；
获得的风化煤腐植酸降解物，采用HG/T 3289-1999标准分析，产率75.20％，纯度达到99.0％；经VPO测定分子量为274，经元素分析、EDS能谱分析表明：未检出有害无机物和放射性元素，采用毛细管电色谱等分析显示，该风化煤腐植酸降解物结构式如(2)所示：

(4)植物多酚与风化煤腐植酸降解物的接枝：
将植物多酚与步骤(3)获得的风化煤腐植酸降解物，置于微波反应器中，在微波频率915～2450MHz，微波功率300～500W下，加入催化剂，15～50℃温度反应5～15min，获得植物多酚与风化煤腐植酸降解物的接枝物；
植物多酚与风化煤腐植酸降解物的摩尔比为0.9～1.1∶1，最好为1∶1；
所述催化剂为甲醇、氢氧化钾和环氧氯丙烷的混合物，甲醇、氢氧化钾和环氧氯丙烷的重量比为：
甲醇∶氢氧化钾∶环氧氯丙烷＝28～35∶1.0∶60～70；
采用VPO渗透压方法进行分析，分子量在875～3280的范围。
所述的植物多酚，为葡萄皮、葡萄籽或者是绿茶叶的提取物，可采用汪成东、张振文等的“葡萄多酚物质提取方法的研究”.西北植物学报，2004，11；彭友元，叶建农，李国清的“毛细管电泳电化学检测法测定烟草中的多元酚”分析试验室2006，25(6)：92-96等文献报道的方法进行提取、分析，本发明不再赘述，其结构通式如(3)所示：

其中：R₁代表H或OH；R₂代表H或

n＝1～4的整数，当n为1时，为儿茶素类化合物，当n＝2～4时，为儿茶素低聚物。
试验证明，本发明的植物多酚与风化煤腐植酸降解物的接枝物，有改善心血管疾病的功效，具有改善胆固醇在血管内皮的沉淀，避免血管内皮细胞损伤，防治动脉硬化的作用方面，药理调节范围更宽，疗效更明显。
附图说明
图1为实施例1风化煤腐植酸降解物的毛细管电色谱图。
图2为实施例2茶多酚风化煤腐植酸降解物的接枝物的¹³C-NMR图。
图3为实施例4的接枝物的红外光谱(IR)分析图谱。
图4为儿茶素-风化煤腐植酸降解-接枝物的IC₅₀。
具体实施方式
实施例1 风化煤腐植酸降解物的制备
(1)将100g风化煤腐植酸原料粉碎至160目，于超声波200KHz下，与5g重量浓度为50％的硝酸混合，在50℃氧解风化煤腐植酸，氧解时间2小时；
(2)然后，在上述的氧解产物中加入2g重量浓度为90％的硫酸，反应温度为70℃，时间0.5小时，获得活化的风化煤腐植酸；
(3)将所述的活化的风化煤腐植酸在十二烷基三甲基氯化铵存在下，与甲醇和甲醇钠在65℃下反应1小时，获得风化煤腐植酸降解物，如式(2)所示；
甲醇与甲醇钠的重量比为5：1，甲醇的加入重量为风化煤腐植酸的20％；
十二烷基三甲基氯化铵加入的比例为风化煤腐植酸的1％；
经VPO测定分子量为274，经HG/T 3289-1999标准分析，风化煤腐植酸降解物产率75.20％，纯度达到99.0％；经元素分析、EDS能谱分析表明：未检出有害无机物和放射性元素。
实施例2，风化煤腐植酸降解物的制备
(1)将100g风化煤腐植酸原料粉碎至160目，于超声波200KHz下，与20g重量浓度为20％的硝酸混合，在105℃氧解风化煤腐植酸，氧解时间10小时；
(2)然后，在上述的氧解产物中加入5g重量浓度为50％的硫酸，反应温度为125℃，时间5小时，获得活化的风化煤腐植酸；
(3)将所述的活化的风化煤腐植酸在十六烷基三甲基氯化铵存在下，与甲醇和甲醇钠在30℃下反应3小时，获得风化煤腐植酸降解物，如式(2)所示；
甲醇与甲醇钠的重量比为2：1，甲醇的加入重量为风化煤腐植酸的100％；
十六烷基三甲基氯化铵加入的比例为风化煤腐植酸的0.1％；
经VPO测定分子量为274，经HG/T 3289-1999标准分析，风化煤腐植酸降解物产率75.50％，纯度达到99.1％；经元素分析、EDS能谱分析表明：未检出有害无机物和放射性元素。
实施例3 茶多酚与风化煤腐植酸降解物的接枝
将50摩尔植物多酚与50摩尔实施例1的风化煤腐植酸降解物，置于微波反应器中，在微波频率2450MHz，微波功率300W下，加入催化剂，50℃温度反应5min，获得植物多酚与风化煤腐植酸降解物的接枝物；
催化剂为甲醇、氢氧化钾和环氧氯丙烷的混合物，甲醇、氢氧化钾和环氧氯丙烷的重量比为：甲醇∶氢氧化钾∶环氧氯丙烷＝32∶1.0∶68；
采用VPO渗透压方法进行分析，分子量为875，结构式如下，

NMR的分析图谱见图2。
实施例4 儿茶素低聚物与风化煤腐植酸降解物的接枝
在微波频率915MHz，微波功率500W的微波反应器中先加入结构式如(2)的风化煤腐植酸降解物50摩尔，再加入50摩尔从葡萄籽/葡萄皮多酚中浸提的儿茶素低聚物，结构式如式(3)，n＝2的儿茶素低聚物，催化剂为甲醇、氢氧化钾和环氧氯丙烷的混合物，甲醇、氢氧化钾和环氧氯丙烷的重量比为：甲醇∶氢氧化钾∶环氧氯丙烷＝28∶1.0∶60；反应温度为35℃，反应时间为15min，获得植物多酚与风化煤腐植酸降解物的接枝物，分子量1476，红外光谱(IR)分析图谱如图3，结构式如下：

实施例5
将实施例3制得的茶多酚与风化煤腐植酸降解物的接枝物，加入二甲基亚砜(DMSO)，配成浓度为100mg/ml的母液，再用24孔培养板稀释为1000μg/ml，500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml的临床实验液。同时，将取自家兔主动脉内膜层培养的HeLa细胞用胰蛋白酶消化后，用含重量浓度为10％小牛血清的培养基配成单个细胞悬液；将细胞悬液接种在96孔板中，加入含不同浓度的实验液中，比较空白对照组，每组设三个平行孔，于37℃，体积浓度5％CO₂培养箱中培养24小时，然后按MTT(四氮唑)法，在酶标仪上测量其光密度值(OD值)，并按照，抑制率＝(1-实验组OD值)/对照组OD值*100％的计算式，观察茶多酚与风化煤腐植酸降解物的接枝物进对血管平滑肌细胞的抑制情况。结果见图4。
图4表明：儿茶素-风化煤腐植酸降解-接枝物在100ug/ml的浓度，抑制率达到了IC₅₀指标，对高胆固醇、血流变改变等引起的动脉硬化，有较好的抑制作用。