镍离子人工抗原螯合剂的合成及镍单克隆抗体的制备.pdf

一种镍离子人工抗原螯合剂的合成及镍单克隆抗体的制备。以4-硝基邻苯二胺为原料经过一系列反应化学合成了6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉，简称BATDQ，作为合成镍人工抗原的双功能螯合剂，利用BATDQ的四乙酸和溴乙酰氨基结构螯合镍离子及载体蛋白质，获得人工抗原。然后通过人工抗原免疫BALB/c小鼠，并运用细胞融合、细胞克隆等技术获得对应于镍的单克隆抗体，用于检测环境、食品中镍的残留。本发明具有快速、灵敏、成本低、特别适合大批量现场快速检测的特点，并且本发明中的镍人工抗原制备方法简单，成本低，而单克隆抗体的制备技术相对比较成熟，便于规模化生产，检测技术简单，易于推广。

1.  一种镍离子人工抗原螯合剂的合成方法，其特征包括下列步骤：
1)6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉的合成：
将2g 4-硝基邻苯二胺和1.13g丁二酮放入250mL单口烧瓶中，以50mL无水乙醇为溶剂，加热回流2h，冷却至室温后抽滤，加30mL无水乙醇结晶提纯，所得产物即为6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉；
2)6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的合成：
取0.5g第一步产物6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉、0.202g偶氮二异丁腈与1.14g N-溴代琥珀酰亚胺置于干燥的250mL单口圆底烧瓶中，再取40mL四氯化碳加入烧瓶中，装上回流冷凝管，抽真空并用氩气保护，将烧瓶置于事先加热到80℃的油浴中，强力搅拌，并用火焰枪辅助加热使之快速回流，待反应完毕后，将混合物冷却至室温再过滤，取滤液放入水浴锅中蒸馏、冷却，得6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉；
3)6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成：
在装有机械搅拌、回流冷凝管和恒压漏斗的三口烧瓶中，加入1.99mL亚氨基二乙酸二乙酯、10mL干燥的乙腈和2.63g无水碳酸钾粉末；搅拌下向反应混合液中滴加溶有1.805g 6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的10mL干燥乙腈，回流8-10h，冷却，滤去碳酸钾，滤液减压下旋转蒸发回收溶剂，得淡黄色油状液体；往上述油状液中加入含3.48g结晶氢氧化钡的饱和溶液，室温下充分搅拌至油状液体均转化为白色沉淀，抽滤钡盐并用蒸馏水充分浸泡、洗涤；
然后将此钡盐转移到15mL蒸馏水中，将混合物加热煮沸，加入硫酸至清液中不再出现混浊，过滤除去硫酸钡，再用沸水煮洗硫酸钡残渣3次，将滤液和洗涤液合并，冰箱中冷却8-10h，得到6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；
4)6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成：
将100mL乙醇和2.025g 6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉加入到250mL装有温度计、机械搅拌器的三口瓶中，加入1.2g钯碳催化剂和5.29g水合肼，不断搅拌，在80-85℃条件下反应4h后，趁热过滤，滤液经减压蒸去乙醇，冷却后所得固体用50mL苯重结晶，得到6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；
5)6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成：
取5.05g溴乙酰溴溶于30mL三氯化碳中，2.105g碳酸氢钠溶于100mL水中，冰浴中将碳酸氢钠溶液缓慢滴加到溴乙酰溴溶液中，取18.722g 6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉装入三口烧瓶中，温度保持在50-60℃，快速搅拌的同时把溴乙酰溴和碳酸氢钠混合液缓慢地滴入6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉中，并用氢氧化钠溶液控制反应体系的pH为12.0，滴加完毕，升温到90℃，搅拌，将溶剂全部蒸出，加入50mL浓盐酸，过滤分离出氯化钠，然后往盐酸提取液中加入150mL无水乙醇，产生白色沉淀，4℃存放8-10h，用50％的乙醇水溶液重结晶，得6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；

2.  用权利要求1所述的合成的螯合剂合成镍人工抗原的方法，其特征包括下列步骤：
1)重金属镍半抗原的合成：
取6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉0.8mg，用pH＝7.5，浓度为0.1mo l·L^-1的磷酸盐缓冲液定容至2mL，加入0.4mg的硝酸镍，搅拌使其混合均匀，反应30min；
2)重金属镍人工抗原的合成：
将5mg牛血清白蛋白用pH＝9.6的磷酸盐缓冲液定容至2mL，室温下，将其缓慢加入半抗原溶液中，并用氢氧化钾调节pH＝9.5，室温下搅拌反应20h，即得重金属镍人工抗原；
3)重金属镍包被抗原的合成：
将5mg人血清白蛋白用pH＝9.6的磷酸盐缓冲液定容至2mL，室温下，将其缓慢加入半抗原溶液中，并用氢氧化钾调节pH＝9.5，室温下搅拌反应20h，即得重金属镍包被抗原；

3.  用权利要求2所述的合成的镍人工抗原制备镍单克隆抗体的方法，其特征包括下列步骤：
1)小鼠免疫及抗血清制备：
选用6周龄雌性BALB/c小鼠8只，将人工抗原与佐剂按1∶1体积比混合，注射器双推法使其混合均匀，初次免疫将人工抗原与完全佐剂乳化，腹腔、皮下、颈部多点注射，每只小鼠注射0.2mL，第一次免疫3周后进行第二次免疫，剂量和途径同第一次，但从第二次免疫开始佐剂换用不完全佐剂，每隔两周分别进行第三次、第四次免疫，第四次免疫后采血清，检测效价，取效价高的继续加强免疫，加强免疫时抗原不加任何佐剂；
加强免疫3天后，摘眼球取小鼠血液于灭菌的康氏管内，室温放置1h，在超净工作台用无菌管把血块和管壁剥离，37℃恒温2h后，4℃冰箱中静置8-10h，使血清充分析出，收集血清，将血清1000rpm/min离心10min，收集上清，将血清分装，-20℃保存；
2)间接ELISA法检测抗血清效价：
包被：用pH＝9.6，浓度为0.05mo l·L^-1的碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释至2μg·mL^-1，100μL/孔，包被到酶标板上，4℃反应12h或37℃水浴3h；
洗涤：倾去板孔液，用pH＝7.4，浓度为0.15mo l·L^-1，含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤3次，5min/次，拍干；
封闭：加入10％小牛血清作为封闭液，200μL/孔，37℃孵育3h，同前洗涤，拍干；
加抗血清：抗血清按400、800、1600、3200、6400、12800、25600、51200倍稀释，100μL/孔，设置空白对照，并用正常小鼠血清作为阴性对照，37℃孵育1h，同前洗涤，拍干；
加酶标记抗体：加入按1∶5000稀释的用辣根过氧化物标记的羊抗小鼠，100μL/孔，37℃孵育1h，同前洗涤，拍干；
显色：加入使用前配制的邻苯二胺底物，100μL/孔，37℃显色15min；
终止：加2mo l·L^-1的硫酸，50μL/孔，终止反应5min；
读数：利用酶标仪测定492nm波段处的吸光值；
3)细胞融合：
在无菌条件下，制备饲养细胞，取效价高的BALB/c小鼠，最后加强免疫三天后，制备免疫脾细胞，并准备对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞；
取1.0×10⁸个脾细胞，2.0-5.0×10⁷个Sp2/0细胞，按1-10∶1的比例加入到50mL融合管中，轻轻摇匀，1000r/min离心10min，弃上清液；
将融合管置于掌心轻轻摩擦，以防止细胞沉淀，使细胞松散均匀成糊状；
将融合管置于37℃水浴中，吸取1mL 37℃预热的聚乙二醇4000，缓慢加入融合管中，边加边轻轻摇匀，60s内加完；
在90s内缓慢滴加无血清的DMEM培养基30-40mL，终止融合，37℃静止10min后，1000r/min，离心10min，弃上清液；
将融合管置于手掌，摩擦使之松散，加入60-80mL HAT培养基使细胞悬浮、混匀，分装于带有饲养细胞的96孔细胞培养板，100μL/孔，于37℃、5％CO₂培养箱中培养；
4)采用有限稀释法筛选阳性孔及克隆：
制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，细胞计数，用含12％血清的HT培养基稀释至每毫升含10、15和20个细胞3种不同的稀释度，分装于有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度分装32孔，100μL/孔；
于37℃、5％CO₂培养箱中培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即用间接ELISA法检测抗体效价，以样品孔的OD值大于阴性孔的2倍为阳性；
取抗体检测为阳性孔的细胞进行扩大培养并冻存；
5)腹水型单克隆抗体的制备：
腹腔注射液体石蜡，每只小鼠0.5mL；
7-10天后用无血清培养基稀释的杂交瘤细胞腹腔接种，每只小鼠注射5×10⁵个细胞；
间隔5天后，观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即用16号针头采集腹水，连续采2-3次，每只小鼠采5-10mL腹水；
将腹水在2000rmp/min条件下离心5min，除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-80℃冻存，或冻干保存；
6)腹水型单克隆抗体的纯化：
用微孔滤膜过滤腹水，除去较大的凝块及脂肪滴，在4℃，10000rmp/min的条件下离心15min，除去细胞残渣及小颗粒物质；
饱和硫酸铵法对腹水型单克隆抗体进行粗提取；
DEAE离子交换层析法对腹水型单克隆抗体进一步纯化；

4.  如权利要求3所述的镍单克隆抗体的应用，其特征是对含镍污水的检测按如下步骤进行：
1)包被：用pH＝9.6，浓度为0.05mol·L^-1的碳酸盐缓冲液稀释抗原至5μg/mL，100μL/孔，包被到酶标板上，4℃放置12h或37℃水浴3h；
2)洗涤：倾去板孔液，用pH＝7.4，浓度为0.15mol·L^-1，含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤3次，5min/次，拍干；
3)封闭：加入10％小牛血清作为封闭液，200μL/孔，37℃孵育3h，同前洗涤，拍干；
4)加样：将样品和最佳稀释浓度的抗血清按1∶1的体积充分混合，室温下反应30min，100μL/孔，37℃反应1h，洗涤3次，5min/次，拍干；
5)加酶标记抗体：加入按1∶5000稀释的辣根过氧化物标记的羊抗小鼠，100μL/孔，37℃孵育1h，同前洗涤，拍干；
6)显色：加入使用前配制的邻苯二胺底物，100μL/孔，37℃显色15min；
7)终止：加2mol·L^-1的硫酸，50μL/孔，终止反应5min；
8)读数：利用酶标仪测定492nm波段处的吸光值；
9)数据处理：根据抑制率计算公式和标准曲线求出相对应的样品浓度。

镍离子人工抗原螯合剂的合成及镍单克隆抗体的制备
技术领域
本发明涉及一种新的双功能螯合剂及该螯合剂在重金属镍离子人工抗原的合成及镍单克隆抗体制备中的应用。
背景技术
人工抗原的合成是重金属免疫分析技术中关键环节之一，它是利用双功能螯合剂先与重金属离子形成稳定的螯合物(半抗原分子)，再与载体蛋白质偶联形成重金属-螯合剂-载体蛋白质的螯合物(人工抗原)。目前双功能螯合剂的种类非常少，并且价格偏高，阻碍了重金属人工抗原合成的研究。本申请人曾在先申请了镉离子人工抗原螯合剂的合成方法，继而介绍了对应的镉离子人工抗原和单克隆抗体的合成，并将抗体应用于镉离子污染的检测，但对于重金属镍而言，目前国内并没有关于制备其人工抗原的相关报道，因此，寻找新型、价廉的双功能螯合剂，并进一步制备相应的人工抗原和单克隆抗体，对应用于重金属镍残留污染的快速检测具有十分重要的现实意义。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明的目的是研制出一种双功能的镍离子人工抗原螯合剂6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉(6-bromine acetamido-2，3-(N，N，N′，N′-tetraacethyl)dimethylamino-quinoxaline，BATDQ)合成对应于重金属镍的人工抗原，并公开基于此人工抗原的重金属镍单克隆抗体的制备方法，以及运用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)中的间接竞争法检测富含镍离子污染的样品。
本发明的目的通过如下措施实现：
1.镍离子人工抗原螯合剂的合成方法如下：
1)6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉的合成：
将2g 4-硝基邻苯二胺和1.13g丁二酮放入250mL单口烧瓶中，以50mL无水乙醇为溶剂，加热回流2h，冷却至室温后抽滤，加30mL无水乙醇结晶提纯，所得产物即为6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉；
2)6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的合成：
取0.5g第一步产物6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉、0.202g偶氮二异丁腈与1.14g N-溴代琥珀酰亚胺置于干燥的250mL单口圆底烧瓶中，再取40mL四氯化碳加入烧瓶中，装上回流冷凝管，抽真空并用氩气保护，将烧瓶置于事先加热到80℃的油浴中，强力搅拌，并用火焰枪辅助加热使之快速回流，待反应完毕后，将混合物冷却至室温再过滤，取滤液放入水浴锅中蒸馏、冷却，得6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉；
3)6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成：
在装有机械搅拌、回流冷凝管和恒压漏斗的三口烧瓶中，加入1.99mL亚氨基二乙酸二乙酯、10mL干燥的乙腈和2.63g无水碳酸钾粉末；搅拌下向反应混合液中滴加溶有1.805g 6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的10mL干燥乙腈，回流8-10h，冷却，滤去碳酸钾，滤液减压下旋转蒸发回收溶剂，得淡黄色油状液体；往上述油状液中加入含3.48g结晶氢氧化钡(Ba(OH)₂·8H₂O)的饱和溶液，室温下充分搅拌至油状液体均转化为白色沉淀，抽滤钡盐并用蒸馏水充分浸泡、洗涤；然后将此钡盐转移到15mL蒸馏水中，将混合物加热煮沸，加入硫酸至清液中不再出现混浊，过滤除去硫酸钡，再用沸水煮洗硫酸钡残渣3次，将滤液和洗涤液合并，冰箱中冷却8-10h，得到6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；
4)6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成：
将100mL乙醇和2.025g 6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉加入到250mL装有温度计、机械搅拌器的三口瓶中，加入1.2g钯碳催化剂和5.29g水合肼，不断搅拌，在80-85℃条件下反应4h后，趁热过滤，滤液经减压蒸去乙醇，冷却后所得固体用50mL苯重结晶，得到6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；
5)6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成：
取5.05g溴乙酰溴溶于30mL三氯化碳中，2.105g碳酸氢钠溶于100mL水中，冰浴中将碳酸氢钠溶液缓慢滴加到溴乙酰溴溶液中，取18.722g 6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉装入三口烧瓶中，温度保持在50-60℃，快速搅拌的同时把溴乙酰溴和碳酸氢钠混合液缓慢地滴入6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉中，并用氢氧化钠溶液控制反应体系的pH为12.0，滴加完毕，升温到90℃，搅拌，将溶剂全部蒸出，加入50mL浓盐酸，过滤分离出氯化钠，然后往盐酸提取液中加入150mL无水乙醇，产生白色沉淀，4℃存放8-10h，用50％的乙醇水溶液重结晶，得6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；
2.镍人工抗原的合成包括下列步骤：
1)重金属镍半抗原的合成：
取BATDQ 0.8mg，用pH＝7.5，浓度为0.1mol·L^-1的磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline，PBS)定容至2mL，加入0.4mg的硝酸镍，搅拌使其混合均匀，反应30min；
2)重金属镍人工抗原的合成：
将5mg牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)用pH＝9.6的PBS定容至2mL，室温下，将其缓慢加入半抗原溶液中，并用氢氧化钾调节pH＝9.5，室温下搅拌反应20h，即得重金属镍人工抗原；
3)重金属镍包被抗原的合成：
将5mg人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)用pH＝9.6的PBS定容至2mL，室温下，将其缓慢加入半抗原溶液中，并用氢氧化钾调节pH＝9.5，室温下搅拌反应20h，即得重金属镍包被抗原；
3.镍单克隆抗体制备包括下列步骤：
1)小鼠免疫及抗血清制备：
选用6周龄雌性BALB/c小鼠8只，将人工抗原与佐剂按1∶1体积比混合，注射器双推法使其混合均匀，初次免疫将人工抗原与完全佐剂乳化，腹腔、皮下、颈部多点注射，每只小鼠注射0.2mL，第一次免疫3周后进行第二次免疫，剂量和途径同第一次，但从第二次免疫开始佐剂换用不完全佐剂，每隔两周分别进行第三次、第四次免疫，第四次免疫后采血清，检测效价，取效价高的继续加强免疫，加强免疫时抗原不加任何佐剂；
加强免疫3天后，摘眼球取小鼠血液于灭菌的康氏管内，室温放置1h，在超净工作台用无菌管把血块和管壁剥离，37℃恒温2h后，4℃冰箱中静置8-10h，使血清充分析出，收集血清，将血清1000rpm/min离心10min，收集上清，将血清分装，-20℃保存；
2)间接ELISA法检测抗血清效价：
包被：用pH＝9.6，浓度为0.05mol·L^-1的碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释至2μg·mL^-1，100μL/孔，包被到酶标板上，4℃反应12h或37℃水浴3h；
洗涤：倾去板孔液，用pH＝7.4，浓度为0.15mol·L^-1，含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBS-T)洗涤3次，5min/次，拍干；
封闭：加入10％小牛血清作为封闭液，200μL/孔，37℃孵育3h，同前洗涤，拍干；
加抗血清：抗血清按400、800、1600、3200、6400、12800、25600、51200倍稀释，100μL/孔，设置空白对照，并用正常小鼠血清作为阴性对照，37℃孵育1h，同前洗涤，拍干；
加酶标记抗体：加入按1∶5000稀释的用辣根过氧化物标记的羊抗小鼠(IgG-HRP)，100μL/孔，37℃孵育1h，同前洗涤，拍干；
显色：加入使用前配制的邻苯二胺底物溶液(O-phenylenediamine，OPD)，100μL/孔，37℃显色15min；
终止：加2mol·L^-1的硫酸，50μL/孔，终止反应5min；
读数：利用酶标仪测定492nm波段处的吸光值，经间接ELISA法检测抗血清的效价达到1×10⁵；
3)细胞融合：
在无菌条件下，制备饲养细胞，取效价高的BALB/c小鼠，最后加强免疫三天后，制备免疫脾细胞，并准备对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞；
取1.0×10⁸个脾细胞，2.0-5.0×10⁷个Sp2/0细胞，按1-10∶1的比例加入到50mL融合管中，轻轻摇匀，1000r/min离心10min，弃上清液；
将融合管置于掌心轻轻摩擦，以防止细胞沉淀，使细胞松散均匀成糊状；
将融合管置于37℃水浴中，吸取1mL 37℃预热的聚乙二醇4000，缓慢加入融合管中，边加边轻轻摇匀，60s内加完；
在90s内缓慢滴加无血清的DMEM培养基30-40mL，终止融合，37℃静止10min后，1000r/min，离心10min，弃上清液；
将融合管置于手掌，摩擦使之松散，加入60-80mL HAT培养基使细胞悬浮，混匀，分装于带有饲养细胞的96孔细胞培养板，100μL/孔，于37℃、5％CO₂培养箱中培养；
4)采用有限稀释法筛选阳性孔及克隆：
制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，细胞计数，用含12％血清的HT培养基稀释至每毫升含10、15和20个细胞3种不同的稀释度，分装于有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度分装32孔，100μL/孔；
于37℃、5％CO₂培养箱中培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即用间接ELISA法检测抗体效价，以样品孔的OD值大于阴性孔的2倍为阳性；
取抗体检测为阳性孔的细胞进行扩大培养并冻存；
5)腹水型单克隆抗体的制备：
腹腔注射液体石蜡，每只小鼠0.5mL；
7-10天后用无血清培养基稀释的杂交瘤细胞腹腔接种，每只小鼠注射5×10⁵个细胞；
间隔5天后，观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即用16号针头采集腹水，连续采2-3次，每只小鼠采5-10mL腹水；
将腹水在2000rmp/min条件下离心5min，除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-80℃冻存，或冻干保存；
6)腹水型单克隆抗体的纯化：
用微孔滤膜过滤腹水，除去较大的凝块及脂肪滴，在4℃，10000rmp/min的条件下离心15min，除去细胞残渣及小颗粒物质；
饱和硫酸铵法对腹水型单克隆抗体进行粗提取；
DEAE离子交换层析法对腹水型单克隆抗体进一步纯化；
4.应用镍单克隆抗体检测含镍污水的方法按如下步骤进行：
1)包被：用pH＝9.6，浓度为0.05mol·L^-1的碳酸盐缓冲液稀释抗原至5μg/mL，100μL/孔，包被到酶标板上，4℃放置12h或37℃水浴3h；
2)洗涤：倾去板孔液，用pH＝7.4，浓度为0.15mol·L^-1，PBS-T洗涤3次，5min/次，拍干；
3)封闭：加入10％小牛血清作为封闭液，200μL/孔，37℃孵育3h，同前洗涤，拍干；
4)加样：将样品和最佳稀释浓度的抗血清按1∶1的体积充分混合，室温下反应30min，100μL/孔，37℃反应1h，洗涤3次，5min/次，拍干；
5)加酶标记抗体：加入按1∶5000稀释的IgG-HRP，100μL/孔，37℃孵育1h，同前洗涤，拍干；
6)显色：加入使用前配制的OPD溶液，100μL/孔，37℃显色15min；
7)终止：加2mol·L^-1的硫酸，50μL/孔，终止反应5min；
8)读数：利用酶标仪测定492nm波段处的吸光值；
9)数据处理：根据抑制率计算公式和标准曲线求出相对应的样品浓度。
本发明的有益效果是：
1)本单克隆抗体对镍残留污染的检测专一性强，且与其他金属的交叉反应弱；
2)原料便宜，总成本低，价格为30元/mg；
3)通过原子吸收分光光度法测定的Ni-BATDQ-BSA、Ni-BATDQ-HSA的偶联比为22∶1、28∶1，偶联比较高；
4)合成的人工抗原免疫原性强，稳定性好，以间接ELISA法测定的抗血清效价达到1×10⁵，获得的单克隆抗体检出限为1pbb。
具体实施方案
本发明的实验反应路线：

本发明是利用了BATDQ的四乙酸结构与重金属镍离子形成稳定的螯合物，另一方面又利用它的溴乙酰氨基结构与蛋白质上的巯基在弱碱性条件下发生缩合反应，从而实现了重金属镍人工抗原的合成，这为重金属镍的酶免疫分析技术奠定了基础。同时，本发明是对传统的重金属镍离子的检测技术进行的有益补充，其快速、高灵敏度、在线操作等特点成为重金属检测的新发展方向。
最佳实施例：
镍离子人工抗原螯合剂的合成方法如下：
1)6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉的合成：
将2g 4-硝基邻苯二胺和1.13g丁二酮放入250mL单口烧瓶中，以50mL无水乙醇为溶剂，加热回流2h，冷却至室温后抽滤，加30mL无水乙醇结晶提纯，所得产物即为6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉；
2)6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的合成：
取0.5g第一步产物6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉、0.202g偶氮二异丁腈与1.14g N-溴代琥珀酰亚胺置于干燥的250mL单口圆底烧瓶中，再取40mL四氯化碳加入烧瓶中，装上回流冷凝管，抽真空并用氩气保护，将烧瓶置于事先加热到80℃的油浴中，强力搅拌，并用火焰枪辅助加热使之快速回流，待反应完毕后，将混合物冷却至室温再过滤，取滤液放入水浴锅中蒸馏、冷却，得6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉；
3)6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成：
在装有机械搅拌、回流冷凝管和恒压漏斗的三口烧瓶中，加入1.99mL亚氨基二乙酸二乙酯、10mL干燥的乙腈和2.63g无水碳酸钾粉末；搅拌下向反应混合液中滴加溶有1.805g 6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的10mL干燥乙腈，回流8-10h，冷却，滤去碳酸钾，滤液减压下旋转蒸发回收溶剂，得淡黄色油状液体；往上述油状液中加入含3.48g Ba(OH)₂·8H₂O的饱和溶液，室温下充分搅拌至油状液体均转化为白色沉淀，抽滤钡盐并用蒸馏水充分浸泡、洗涤；然后将此钡盐转移到15mL蒸馏水中，将混合物加热煮沸，加入硫酸至清液中不再出现混浊，过滤除去硫酸钡，再用沸水煮洗硫酸钡残渣3次，将滤液和洗涤液合并，冰箱中冷却8-10h得到6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；
4)6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成：
将100mL乙醇和2.025g 6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉加入到250mL装有温度计、机械搅拌器的三口瓶中，加入1.2g钯碳催化剂和5.29g水合肼，不断搅拌，在80-85℃条件下反应4h后，趁热过滤，滤液经减压蒸去乙醇，冷却后所得固体用50mL苯重结晶，得到6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；
5)6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成：
取5.05g溴乙酰溴溶于30mL三氯化碳中，2.105g碳酸氢钠溶于100mL水中，冰浴中将碳酸氢钠溶液缓慢滴加到溴乙酰溴溶液中，取18.722g 6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉装入三口烧瓶中，温度保持在50-60℃，快速搅拌的同时把溴乙酰溴和碳酸氢钠混合液缓慢地滴入6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉中，并用氢氧化钠溶液控制反应体系的pH为12.0，滴加完毕，升温到90℃，搅拌，将溶剂全部蒸出，加入50mL浓盐酸，过滤分离出氯化钠，然后往盐酸提取液中加入150mL无水乙醇，产生白色沉淀，4℃存放8-10h，用50％的乙醇水溶液重结晶，得6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；
镍人工抗原的合成包括下列步骤：
1)重金属镍半抗原的合成：
取BATDQ 0.8mg，用pH＝7.5，0.1mol·L^-1的PBS定容至2mL，加入0.4mg的硝酸镍，搅拌使其混合均匀，反应30min；
2)重金属镍人工抗原的合成：
将5mg BSA用pH＝9.6的PBS定容至2mL，室温下，将其缓慢加入半抗原溶液中，并用氢氧化钾调节pH＝9.5，室温下搅拌反应20h，即得重金属镍人工抗原；
3)重金属镍包被抗原的合成：
将5mg HSA用pH＝9.6的PBS定容至2mL，室温下，将其缓慢加入半抗原溶液中，并用氢氧化钾调节pH＝9.5，室温下搅拌反应20h，即得重金属镍包被抗原；
4)原子吸收分光光度法鉴定偶联比：
分别配制镍标准液(0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0mg·L^-1)，制做标准曲线，将偶联产物取1mL稀释20倍，用原子吸收法检测重金属镍的含量。利用原子吸收分光光度法检测人工抗原Ni-BATDQ-BSA、包被抗原Ni-BATDQ-HSA，检测到重金属镍离子的含量分别为20.0mg·L^-1、25.0mg·L^-1，经计算两种人工抗原的偶联比分别为22∶1、28∶1，偶联比符合制备抗体要求。
5)SDS-PAGE法对偶联结果的鉴定：
采用SDS-PAGE不连续电泳，以Tris-HCl作为缓冲体系，10％分离胶，5％浓缩胶。样品在浓缩胶上电泳时以恒定电流(20mA)电泳，待其转入分离胶后恒定电流(30mA)，电泳至溴酚蓝距分离胶底边1cm左右停止。卸开电泳槽，取出胶板，固定液固定40min，敏化30min，水洗4次，银染，最后显色呈像。电泳结果显示，人工抗原Ni-BATDQ-BSA、包被抗原Ni-BATDQ-HSA在电泳中的泳动速度明显落后于其相应的载体蛋白，且偶联后的人工抗原与原载体蛋白相比增加的分子量在6000D左右。
镍单克隆抗体制备包括下列步骤：
1)小鼠免疫及抗血清制备：
选用6周龄雌性BALB/c小鼠8只，将人工抗原与佐剂按1∶1体积比混合，注射器双推法使其混合均匀，初次免疫将人工抗原与完全佐剂乳化，腹腔、皮下、颈部多点注射，每只小鼠注射0.2mL，第一次免疫3周后进行第二次免疫，剂量和途径同第一次，但从第二次免疫开始佐剂换用不完全佐剂，每隔两周分别进行第三次、第四次免疫，第四次免疫后采血清，检测效价，取效价高的继续加强免疫，加强免疫时抗原不加任何佐剂；
加强免疫3天后，摘眼球取小鼠血液于灭菌的康氏管内，室温放置1h，在超净工作台用无菌管把血块和管壁剥离，37℃恒温2h后，4℃冰箱中静置8-10h，使血清充分析出，收集血清，将血清1000rpm/min离心10min，收集上清，将血清分装，-20℃保存；
2)间接ELISA法检测抗血清效价：
包被：用pH＝9.6，浓度为0.05mol·L^-1的碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释至2μg·mL^-1，100μL/孔，包被到酶标板上，4℃反应12h或37℃水浴3h；
洗涤：倾去板孔液，用pH＝7.4，浓度为0.15mo l·L^-1的PBS-T洗涤3次，5min/次，拍干；
封闭：加入10％小牛血清作为封闭液，200μL/孔，37℃孵育3h，同前洗涤，拍干；
加抗血清：抗血清按400、800、1600、3200、6400、12800、25600、51200倍稀释，100μL/孔，设置空白对照，并用正常小鼠血清作为阴性对照，37℃孵育1h，同前洗涤，拍干；
加酶标记抗体：加入按1∶5000稀释的IgG-HRP，100μL/孔，37℃孵育1h，同前洗涤，拍干；
显色：加入使用前配制的OPD溶液，100μL/孔，37℃显色15min；
终止：加2mol·L^-1的硫酸，50μL/孔，终止反应5min；
读数：利用酶标仪测定492nm波段处的吸光值，经间接ELISA法检测抗血清的效价达到1×10⁵；
3)细胞融合：
在无菌条件下，制备饲养细胞，取效价高的BALB/c小鼠，最后加强免疫三天后，制备免疫脾细胞，并准备对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞；
取1.0×10⁸个脾细胞，2.0-5.0×10⁷个Sp2/0细胞，按1-10∶1的比例加入到50mL融合管中，轻轻摇匀，1000r/min离心10min，弃上清液；
将融合管置于掌心轻轻摩擦，以防止细胞沉淀，使细胞松散均匀成糊状；
将融合管置于37℃水浴中，吸取1mL 37℃预热的聚乙二醇4000，缓慢加入融合管中，边加边轻轻摇匀，60s内加完；
在90s内缓慢滴加无血清的DMEM培养基30-40mL，终止融合，37℃静止10min后，1000r/min，离心10min，弃上清液；
将融合管置于手掌，摩擦使之松散，加入60-80mL HAT培养基使细胞悬浮，混匀，分装于带有饲养细胞的96孔细胞培养板，100μL/孔，于37℃、5％CO₂培养箱中培养；
4)采用有限稀释法筛选阳性孔及克隆：
制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，细胞计数，用含12％血清的HT培养基稀释至每毫升含10、15和20个细胞3种不同的稀释度，分装于有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度分装32孔，100μL/孔；
于37℃、5％CO₂培养箱中培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即用间接ELISA法检测抗体效价，以样品孔的OD值大于阴性孔的2倍为阳性；
取抗体检测为阳性孔的细胞进行扩大培养并冻存；
5)腹水型单克隆抗体的制备：
腹腔注射液体石蜡，每只小鼠0.5mL；
7-10天后用无血清培养基稀释的杂交瘤细胞腹腔接种，每只小鼠注射5×10⁵个细胞；
间隔5天后，观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即用16号针头采集腹水，连续采2-3次，每只小鼠采5-10mL腹水；
将腹水在2000rmp/min条件下离心5min，除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-80℃冻存，或冻干保存；
6)腹水型单克隆抗体的纯化：
用微孔滤膜过滤腹水，除去较大的凝块及脂肪滴，在4℃，10000rmp/min的条件下离心15min，除去细胞残渣及小颗粒物质；
饱和硫酸铵法对腹水型单克隆抗体进行粗提取；
DEAE离子交换层析法对腹水型单克隆抗体进一步纯化。
至此，本发明对镍人工抗原螯合剂的合成方法及对应镍的人工抗原和镍单克隆抗体的制备，都作了完整而清楚的介绍，穿插介绍了人工抗原偶联结果的两种鉴定方法及抗血清效价的检测方法。
为更进一步说明本发明，下面再介绍重金属镍离子标准曲线的建立，并以水中重金属镍离子的含量为例介绍快速检测法，便于公众全面了解本发明。
为检测抗体的检测限，下面介绍重金属镍标准曲线的建立方法：
1)包被：用pH为9.6，浓度为0.05mol·L^-1的碳酸盐包被缓冲液稀释抗原至5μg/mL，100μL/孔，包被到酶标板上，4℃放置12h或37℃水浴3h；
2)洗涤：倾去包被液，用PBS-T洗涤3次，5min/次，拍干；
3)封闭：加入10％小牛血清作为封闭液，200μL/孔，37℃孵育3h，同前洗涤，拍干；
4)加样：取系列浓度(0、10、50、100、250、500、1000和5000ng·mL^-1)的镍标液加入适宜浓度的EDTA中，按1∶1的体积比加入最佳稀释浓度的抗血清，室温下反应30min，100μL/孔，37℃反应1h，同前洗涤，拍干；
5)加酶标记抗体：加入按1∶5000稀释的IgG-HRP，100μL/孔，37℃孵育1h，同前洗涤，拍干；
6)显色：加入使用前配制的OPD溶液，100μL/孔，37℃显色15min；
7)终止：加2mol·L^-1的硫酸，50μL/孔，终止反应5min；
8)读数：利用酶标仪测定492nm波段处的吸光值
9)抑制率的计算

然后以I％为纵坐标，以标样的自然对数浓度值为横坐标，做标准曲线。
下面以水体中重金属镍含量的快速检测为例加以说明：
水体样品的前处理：取含镍水样1000μL，用0.45μm的微孔滤膜过滤出去杂质。
1)包被：用pH＝9.6，浓度为0.05mo l·L^-1的碳酸盐缓冲液稀释抗原至5μg/mL，100μL/孔，包被到酶标板上，4℃放置12h或37℃水浴3h；
2)洗涤：倾去板孔液，用pH＝7.4，浓度为0.15mo l·L^-1，PBS-T洗涤3次，5min/次，拍干；
3)封闭：加入10％小牛血清作为封闭液，200μL/孔，37℃孵育3h，同前洗涤，拍干；
4)加样：将样品和最佳稀释浓度的抗血清按1∶1的体积充分混合，室温下反应30min，100μL/孔，37℃反应1h，同前洗涤，拍干；
5)加酶标记抗体：加入按1∶5000稀释的IgG-HRP，100μL/孔，37℃孵育1h，同前洗涤，拍干；
6)显色：加入使用前配制的OPD溶液，100μL/孔，37℃显色15min；
7)终止：加2mo l·L^-1的硫酸，50μL/孔，终止反应5min；
8)读数：利用酶标仪测定492nm波段处的吸光值；
9)数据处理：根据抑制率计算公式和标准曲线求出相对应样品的浓度。