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对与血小板源生长因子有关的疾病 如癌症的治疗    
    本发明涉及治疗细胞增生疾病的方法和组合物，该疾病是以血小板源生长因子受体(platelet derived growth factorreceptor)(PDGF—R)的不良活性为特征的。

    本申请是Hirth等人，名称为“TREATMENT OFPLATELET DERIVED GROWTH FACTOR RELATEDDISORDER SUCH AS CANCERS”，U.S.申请号08/179，590的继申请，它于1994年1月7日申请，其内容包括附图在此结合参考。

    血小板源生长因子受体(PDGF—R)是一种经膜受体酪氨酸激酶。配体与受体的结合导致的二受体的二聚作用常常引起各受体的分子内磷酸化，通常称之为自体磷酸化作用或磷酸根转移作用，以及引起受体复合物的活化。PDGF是PDGF—R的配体，是具有通过二硫键连接地两条多肽链的二聚蛋白质。每条多肽成为A链多肽，或为B链多肽。因此，PDGF或有两条A链，两条B链，或一条A链和一条B链。

    PDGF—R由两种异构体α和β组成。含α和β的受体均与有丝分裂原活性有关，而只有含β的受体与趋化性和肌动蛋白改组有关(Heldin，C—H，EMBO Journal 11：4251—4259，1992)。

    根据Plate等，Laboratory Investigation 4：529—534，1992：

    对于间质细胞和神经外胚层细胞而言，PDGF是潜在的生长因子。内皮细胞被认为对PDGF是非应答的，但最近的研究表明PDGF可能在胎盘生长过程中对血管生长起作用。此外，已证实PDGFR—b在发炎组织内皮细胞和神经胶质瘤中表达。这表明，PDGF在病理情况下对血管的功能起作用。[引用部分略]

    Heldin，supra，描述了PDGF及其受体的关系，并讨论了PDGF在癌症中的作用，强调某些癌症不产生PDGF而有中枢的坏死。Heldin指出：

    如上所述，PDGF在某些疾病中的副作用使得PDGF拮抗剂的需求大大增加。最近，我们和别的人采取了几种方法以发展这样的拮抗剂。PDGF抗体在抑制SSV一转移细胞中的自分泌刺激和小鼠颈动脉去内皮作用后出现的动脉粥样硬化过程方面是有用的。而且，已证实PDGF受体的可溶形式可连接和灭活PDGF，因此可能用于抑制体内PDGF作用。

    另一方法是设计或找到一种按拮抗方式是与PDGF竞争结合受体的制剂。为了确定干扰PDGF结合的肽，我们系统观察了由B—链序列派生的肽，发现了一种可抑制PDGF结合和α—及β—受体的自动磷酸化作用的肽。然而，这种肽也显示了细胞毒性，而在肽拮抗剂可用于体内研究之前还需进一步的发展。已发现了可干扰受体结合的低分子量化合物，例如苏拉明(suramin)。但是，苏拉明在临床用作PDGF拮抗剂时并不是有足够特异性。最近，我们发现了另一低分子量化合物新霉素，在高浓度时它可抑制PDGF—BB与α一受体的结合，但并不抑制与β—受体的结合。因此，这种化合物代表了可区分两种受体类型的拮抗剂；然而，这种化合物的低效力使其不适合用于体内。令人乐观的是，对于苏拉明和新霉素的经验可帮助我们在未来设计出更有效更特异的PDGF受体拮抗剂。对PDGF—受体复合物三维结构的说明有助于这类拮抗剂的设计。

    PDGF拮抗活性也可通过对PDGF诱导受体二聚作用的抑制来体现。我们假定单体的PDGF不能引起受体的二聚反应并因此是有拮抗活性。由于PDGF的还原可引起受体结合能力损失，我们试图找到链内二硫键以转化这些残基，并因此阻止配体的二聚作用。由于PDGF中半胱氨酸残基的高密度使得这一过程十分困难。最终成功的方法包括对PDGF分子的部分还原，采用的是仅只还原链间二硫键，而不影响链内键的一定浓度的二硫苏糖醇。通过这一方法，在PDGF内N—末端的第二和第四半胱氨酸残基形成了二个链内键。对于这两个半胱氨的残基已转化为丝氨酸残基的PDGF B—链变异体的分析表明在其中隐含着受体结合活性。它是受体拮抗剂吗？答案是否定的，事实上，单体PDGF可引起受体二聚作用，以及自体磷酸化作用。这个结果表明PDGF诱导的受体二聚作用不仅是在二受体分子间形成桥的问题：二聚作用也包含了增强了受体一受体间作用的，受体细胞外区域由配体诱导那里的构象变化。正如我们目前探讨的，实现拮抗作用的一可能的方式是使一条野生型(wild—type)PDGF链与一条不与PDGF受体结合但可有效防止受体二聚作用的变异链结合。[引用略]

    在Spada A.P.等，名称为“Bis Mono—and BicyclicAryl and Heteroaryl Compounds which Inhibit EGF and/ot PDGF Receptor Tyrosine Kinase，”PCT/US92/03736中，提及某些双单和二环芳基化合物的应用。根据Spada：

    根据本发明，它提供了对患有这种异常增生疾病病人的异常细胞增生的抑制方法，包括给病人施用具有蛋白质酪氨酸激酶抑制活性的抑制有效量的二单一和/或双环芳基和/或杂环化合物EGF和/或PDGF受体，其中的各芳基和/或杂芳基是含有0—4个杂原子的环系统，所述化合物可被任意取代或多取代。

    本发明涉及可抑制血小板源生长因子受体(PDGF—R)活性的化合物，优选地，这些化合物也可抑制PDGF—R超级家族成员的活性，并且对于PDGF—R超级家族成员是有选择性。PDGF—R超级家族包括PDGF—R和PDGF—R相关的激酶Flt和KDR。特征化合物对于细胞培养物中降低PDGF—R活性和优选的降低—或多种PDGF—R相关激酶活性是有效的。特征化合物的一个实例，A10(见图la)，及其体内抑制肿瘤细胞生长的能力如下所述。根据本发明的指示，其它可抑制PDGF—R的化合物，优选是Flt和/或KDR。这些化合物优选地用来治疗以不良PDGF—R活性为特征的细胞增生疾病患者。

    不良的细胞增生是在不同类型细胞包括癌细胞、癌细胞周围细胞(基质细胞)、内皮和平滑肌细胞中，由PDGF—R的不良活性引起的。例如，癌细胞周围内皮细胞PDGF—R活性的增加可增进肿瘤血管化，并因此有利于癌细胞的生长。所以，PDGF—R的不良活性以不同的方式与细胞增生疾病有关，例如通过增加生长因子的生成，通过造成细胞的异常生长，以及在固体肿瘤中增加了血管的形成和分布并因此帮助了肿瘤的生长。

    PDGF—R超级家族加了的其它成员也有助于肿瘤细胞的生长。PDGF超级家族的成员具有与α—或β—PDGF—R激酶区域至少45％序列相似性的激酶区域。血管内皮生长因子(VEGF)至少可激活酪氨酸激酶受体；Flk—1或其人体中相应物KDR。这些受体都在内皮细胞出现并且在血管生成中是重要的。Plate et al.，Nature 359：848，1992；Shweiki，et al.Nature 359：843—845，1992；Millauer etal.，cell 72：835—846，1993；Plate et al.，Cancer Res.，53：5822—5827，1993；Waltenberger et al.，Journal of Bi-ological Chemistry 43：26988—26995，1994。血管化对于固体肿瘤的生长是必须的，并且是被具有内皮细胞性和/或促有丝分裂作用的肿瘤细胞因子调节的。PDGF—R、KDR和Flt均与营养固体肿瘤的血管形成和分布有关。通过抑制PDGF—R以及一种或多种有关的酪氨酸激酶活性，可抑制细胞的异常生长和对于这种生长的营养。

    给出了属于特征组(见图2a—j)的多个化合物实例(见图1a—k)。本领域熟练技术人员可以本申请公开的内容为指导，得到抑制PDGF—R优选Flt和/或KDR的其它化合物，它们对于受体酪氨酸激酶具有同样的或更好的活性。例如，这里所述的评估可很容易地检测属于特征组(见图2a—j)的化合物的同等活性。通过标准试验，可以测定下述任一化合物的作用位点，并可测定在同一位点显示活性的其它化合物。

    通过改变PDGF—R活性，并且优选的也通过改变Flt和/或KDR活性，设计了抑制不良细胞增生的方法和组合物。不局限于任何理论，对不良细胞增生的抑制是通过改变PDGF—R活性进行的(例如通过抑制PDGF—R的酪氨酸磷酸化作用，通过抑制底物或应接蛋白质与受体的结合，或通过抑制其它下游区信号行为)，从而抑制PDGF—R的活性。但是，除非另有说明，所要求的方法和组合物的应用并不局限于这一特定的理论。

    因此，本发明第一方面涉及对以下不良PDGF—R活性为特征的细胞增生疾病患者的治疗方法。这个方法包括给病人施用治疗有效量的含说明如图2a—j所述化合物的组合物、或任意上述化合物生理条件下形成的活性产物(即上述前药的活性结构整体)，施用一特定的化合物就是给病人提供这一特定化合物或给病人提供在其体内可生成这一化合物的化合物前药。

    “细胞增生疾病”就是在多细胞有机体中一个或多个细胞亚组的不良的细胞增生，结果对多细胞有机体产生伤害(例如不适或减少寿命)。细胞增生疾病可在不同类型动物和在人中出现。细胞增生疾病包括癌、血管增生疾病和纤维变性疾病。

    “不良PDGF—R活性”就是1)通常不表达PDGF—R的细胞内PDGF—R的表达；2)通过通常不表达PDGF的细胞的PDGF表达；3)增加PDGF—R表达引起不良细胞增生；4)增加PDGF—R表达引起不良细胞增生；或5)变异引起PDGF—R持续活化。可根据本领域熟知的方法测知不良或异常PDGF和PDGF—R水平的存在。

    所述组合物可用于治疗细胞增生疾病，这是通过对病人(即患有细胞增生疾病的人或动物)用治疗有效量的组合物进行给药。组合物也可用于研究体内PDGF—R或PDGF本身作用的机理。

    “治疗有效量”在治疗癌症时是指足以产生下述一种或多种结果的用量：缩小肿瘤尺寸，抑制肿瘤代谢，抑制肿瘤生长，阻止肿瘤生长，减轻肿瘤引起不适，或延长癌症患者的生命。

    “治疗有效量”在治疗细胞增生疾病而非癌症时，是指足以产生下述一种或多种结果的用量：抑制引起疾病的细胞的生长，减轻疾病症状，或延长这种疾病患者的生命。

    受体酪氨酸激酶活性的“明显”抑制是指采用下述实例所述的一种或多种试验得到的IC50小于或等于75μm。优选的，IC50少于或等于50μm的化合物可抑制PDGF—R活性，更优选的是IC50少于或等于10μm的化合物，还要优选的是IC50少于或等于1μm的化合物。较低的IC50是优选的，因为IC50体现了体内化合物的有效性。本领域已知的其它因素，如化合物的半衰期、生物分布及毒性，在化合物用于治疗时也应考虑在内。这些因素使得具有较低IC50的化合物比具有较高IC50的化合物具备更大体内作用。

    对PDGF—R超级家族的选择抑制是通过对PDGF—R活性的明显的抑制而同时具有不明显的作用而体现的(即在EGR—R上酪氨酸磷酸化作用的IC50大于100μm)。优选的，至少一个PDGF—R超级家族的其它成员被明显抑制。

    优选的化合物为A10，A11，A12，A13，B10，B11，B12，B13，B14，B15，B16，B17，B18，B19，C10，C11，C13，D11，D12，D13，D14，D15，D16，D17，D18，D20，E10，E11，E12，E13，E14，E15，E16，F10，F11，F12，G10，G11，G12，G13，G14，G15，G16，G17，G18，G19，G20，G21，G22，G23，G24，G25，G27，G28，G29，G30，H12，I10，J11，P10，P12，P13，P14，P15，P16，P17，P18，P19，P20，P21，P22，P23，P24，P25。或这些化合物的活性药，或其药物上可接受的盐。化合物优选采用药物组合物的形式，通过使一种上述化合物与生理上可接受的载体混合而制备。

    生理上可接受的载体是可使加入的化合物溶解或者有助于化合物给药的一种制剂。生理上可接受的载体的实例包括水、盐水、生理缓冲盐水、环糊精和PBTE：D5W。憎水化合物如A10的施用优选采用载体如PBTE：D5W。选择生理上可接受的载体的重要因素是选择化合物在其中能保持活性的载体，或者载体和化合物的结合能够产生活性化合物的载体。化合物也可以连续形式采用缓释制剂或泵给药以保持患者体内恒定或变化的药物水平。

    本发明另一方面涉及采用A10，A12或B11，对以不良PDGF—R活性为特征的细胞增生疾病患者的治疗方法。该方法包括向患者给药治疗有效量的A10，A12或B11。

    本发明另一方面叙述了采用结合治疗法，对以不良PDGF—R活性为特征的癌症患者的治疗方法。结合治疗是采用一种或多种所述制剂以及标准抗癌剂进行的。该方法包括对癌症患者给药治疗有效量的含有可明显抑制PDGF—R活性的制剂和细胞毒性剂的组合物。优选的细胞毒性剂为VP—16或顺氯氨铂。更优选的，细胞毒性剂为顺氯氨铂，而癌症为肺癌。

    本发明的另一方面涉及采用变异的PDGF—R或核酸编码的变异的PDGF—R，对以不良PDGF—R活性为特征的细胞增生患者的治疗方法。“变异的”PDGF—R是指其中一个或多个氨基酸丢失或改变的PDGF—R。如下所述，无激酶区域的核酸编码的变异的(即截断的)PDGF—R可抑制体内肿瘤的生长。变异的PDGF—R可以蛋白质、或以给蛋白质编码和在细胞内表达蛋白质的重组核酸的形式给药。

    另一方面，本发明涉及新的含有一种所述特征化合物和PBTE：D5W载体的组合物，这里，特征化合物可溶解于PBTE：D5W中；而且新化合物为B10、B12、C10、C11、E10、E11、E12、E13、E14、E15、E16、F10、F11、F12、G21、G22、H11、H12、H13和H14。

    从下面对本发明优选实施方案的描述及权利要求中，可以看到本发明的其余特征和优点。

    图1.a—k表示优选化合物的化学结构。

    图2.a—j分别表示1—10组的一般化学结构。

    图3.按所述方法用A10处理过表达了人体PDGF—b(A)或人体EGF(B)的NIH3T3细胞。细胞周期中S期细胞所占百分数由血细胞计数流测定。

    图4.在两个独立试验中，将C6细胞(1×105细胞/4μl)植入BALB/C，nu/nu小鼠的大脑中。A10是在移植后某天，每天以给定的剂量、溶于100μl PBTE：D5W中腹膜内给药。V＝赋形剂对照。n＝每组8至12(Expt#1)，或5(Expt#2)只动物每组。*P＜0.00001；**P＜0.002；***P＜0.02，这是相对于赋形剂对照组而言的。

    图5.在两个独立的试验中，将C6细胞(5×104细胞/20μL(Expt#1)或5μl(Expt#2))移植入痴愚大鼠大脑中。A10是在移植后某天开始，每天以给定的剂量，溶于500μlPBTE中腹膜内给药。V＝赋形剂对照，n＝7至8只动物/组。*P＝0.00002；**P＝0.0003，这是相对于赋形剂对照组而言的。

    本发明涉及治疗以不良PDGF—R活性为特征的细胞增生疾病的方法和组合物。本申请证实了所述化合物明显抑制Flt—1和/或PDGF—R活性的能力，并提供了这些化合物用于治疗细胞增生疾病如癌症的实例。所述化合物能用于治疗与PDGF—R不良表达有关的其它的增生疾病，如以不良的PDGF—R活性为特征的增生和纤维变性疾病。以本申请公开的内容为指导，本领域技术人员能够很容易确定哪种化合物可用于治疗特定的增生疾病。

    本申请叙述了单独的、不良PDGF—R活性的存在的靶位点，它涉及现有技术中与许多固定靶有关的大量疾病，用所述化合物可抑制PDGF—R活性优选抑制Flt和/或KDR活性。优选地，PDGF—R活性和KDR和/或Flt活性可被一单独化合物如A10抑制。化合物或治疗类型的结合也可作用于与酪氨酸激酶有关的不同PDGF—R。上述结合的实例包括：采用PDGF—R活性抑制化合物和KDR抑制化合物，以及采用抑制PDGF—R生成的PDGF—R核酸和KDR抑制化合物。

    本发明所采用的化合物(这里也称之为“药物”)属于至少8个不同的组。通常能够显著抑制PDGF受体活性的、上述组以及还未定义的其它组中优选的化合物如图1a—k所示。因为给出了通式，本领域技术人员应认识到采用所述的筛选方法和现有技术中已知的方法可以确定本发明可用的化合物。

    动物体内A10，PDGF—R的截断型(truncated versi-nos)和其它化合物抑制肿瘤生长的能力说明了这些化合物的有效性和功效。这样的动物研究通过证实化合物对动物有效支持了化合物有效性，尽管这其中存在着内在的与采用化合物给动物治疗特定疾病有关的多种问题。这种内在的问题异种细胞数、各种药理情况如化合物的生物利用度、化合物半衰期、和化合物的消除率。这些内在问题常常会阻止化合物发挥生理作用。

    下述实例说明了各种化合物抑制PDGF—R磷酸化的能力。也提供了实例说明定义为A10(见图1a)的化合物体内抑制癌的能力。而且，以本申请公开的内容为指导，本领域熟练技术人员可采用所述的方法和组合物得到其它的抑制化合物，并使其作用于以不良PDGF—R活性为特征的其它细胞增生疾病。

    I.PDGF—R超级家族

    A.PDGF—R活性

    配体与PDGF—R的结合导致了可激活细胞内激酶区域的受体二聚体的形成和构象变化，并引起酪氨酸残基上的受体的磷酸根转移作用和/或自体磷酸化。受体的磷酸化刺激了被激受体与靶分子的物理联系。一些靶分子顺序磷酸化，这就给细胞质传递了信息。其它靶分子未被磷酸化，但作为对二级信号换能蛋白质的截短或应接分子而对信号传递起帮助作用。由激活受体产生的二级信号换能分子产生了可调节细胞功能如细胞分裂的信号串连(见Fry M.J.等，Pro-tein Science 2；1785—1797，1993)。

    因此，PDGF—R活性增加的特征在于是对于PDGF—R配体结合而言一种或多种活性的增加：(1)PDGF—R的磷酸化或自体磷酸化，(2)PDGF—R底物的磷酸化(例如PL—3激酶，RasGAP，PLCY、见Fry supra)，(3)应接分子的活化，以及(4)增加了细胞分裂。可采用下述的和本领域已知的技术测量上述活性。例如，如下述实施例所述，采用抗—磷酸酪氨酸抗体测定PDGF—R的自体磷酸化，并通过测量3H—胸苷向DNA的并入实现如下所述的细胞分裂增加。优选的，PDGF—R活性的增加是与磷酸化PDGF—R和DNA合成的增加量有关的。

    B.PDGF—R相关激酶

    .PDGF—R相关激酶Flt—1和KDR可被VEGF激活。VEGF是一种单二聚的糖蛋白，与PDGF结构相应。已分离出四种不同的VEGF拼接变体。Rosenthal等，GrowthFactors，4：53—59，1990；Conn等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，87：1323—1327，1990；Houck等，Mol.endocrinol，5：1806—1814，1991；其中二种是分泌型，二种保持与细胞有关。已证实VEGF不被缺氧调节并且特别作用于内皮细胞。Plate等，Nature 359：845—848，1992；Shweike等，Natrue359：843—845，1992。

    KDR活性的特征是指对于VEGF配体结合而言一种或多种活性的增加：(1)KDR的磷酸化或自体磷酸化；(2)KDR底物的磷酸化，(3)应接分子活化，和(4)细胞分裂增加。

    Flt—1活性的特征是指对于VEGF配体结合而言一种或多种活性的增加：(1)Flt—1的磷酸化或自体磷酸化，(2)Flt—1底物磷酸化，(3)应接分子的活化，和(4)细胞分裂增加。

    II.特征化合物

    1—11组化合物如图2a—k所示。

    A.第1组化合物

    第1组化合物的基本结构如下

    其中R1、R2、R′2、R″2和R2独立地选自由氢、卤素、三卤甲基和硝基组成的基团，优选的R1和R2独立地为CF3、NO2或氢，及R′2、R″2和R2为氢；及

    R3选自由氢羧基、烷氧基或烷酯基组成的基团。优选选自氢、羧基或甲基。

    第1组化合物的实例列于表I中，并如图1a所示。

                                                     表I

       化合物   R1   R2    R3    A10   CF3   H    H    A11    H  CF3    H    A12   CF3   H   羧基    A13   CF3   H   CH3

    这些化合物被认为是前药，并在体内开环产生活性代谢物。

    B.第2组化合物

    第2组化合物的基本结构如下：

    其中R4和R5独立地表示卤素、氢、三卤甲基或硝基；优选的R4表示CF3和R5表示H；R6为芳基、烷基、烯基或为炔基；

    R6表示烷基或表II中所列化合物的取代基之一。第2组化合物的实例列于表II中并如图1b所示。                                    表II

       化合物     R4   R5        R6    B10    NO2    H       CH3    B11    CF3    H       CH3    B12    CF3    H     4—氟苯基    B13    CF3    H      环己基    B14    CF3    H    2，2，3，3—    四甲基环丙基    B15    CF3    H      五氟苯基    B16    CF3    H  3—苯氧基—苯基    B17    CF3    H       苄基    B18    CF3    H    2—甲基丙基    B19    CF3    H     二苯基甲基C.第3组化合物第3组化合物的结构如下：

    其中R7、R′7和R8独立地表示卤素、OH、氢、烷氧基、SH、NH2或C(CH3)3，优选的R′7、R7和R8独立地选自H、OH和C(CH3)3；更优选的，R7和R8表示OH；R9表示芳基或氢原子，优选的表示氢原子或苯基。第3组化合物的实例列于表III中并如图1c所示。                             表III

     化合物   R′x   R7    R8    R9  C10    H   OH    OH   苯基  C11    H   OH    OH    H  C13 C(CH3)3   OH C(CH3)3    HD.第4组化合物第4组化合物的化学结构如下：

    其中R10表示＝S、＝O、SH、OH或NH2；及

    R11表示SH、OH、NH2、＝C(CN)2或芳基，优选表示NH2、＝C(CN)2或二羧基苯基；或R10和R11一起表示芳基，优选3—氨基—4—氰基—5—吡唑或1—苯基—3—氨基—4—氰基—5—吡唑；以及R12表示氢、芳基、烷基、烯基或炔基，优选表示氢—(CH2)2CN或—(CH2)2N(CH3)2。

    第4组化合物的实例列于表IV中并如图1d所示。                           表IV

       化合物   R10        R11       R12    D11   ＝S        NH2        H    D12   NH2     ＝C(CN)2        H    D13   ＝O        NH2        H    D14 3—氨基—4—氰基—5—吡唑基        H    D15 3—氨基—4—氰基—5—吡唑基—(CH2)2N(CH3)2    D16   ＝O 3，4—二羟基苯基—(CH2)2N(CH3)2    D17   ＝O 3，4—二羟基苯基—(CH2)2CN    D18 3—氨基—4—氰基—5—吡唑基—(CH2)2N(CH3)2    D20      1—苯基—3—氨基    —4—氰基—5—吡唑基       HE.第5组化合物第5组化合物的化学结构如下：

    其中R13、R14、R15、R16、R17和R18独立地表示氢、卤素、烷氧基、OH、氨基、烷基氨基或SH；优选的表示氢原子或OH。

    第5组化合物的实例列于表1中并如图le所示。

                               表V

     化合物 R13 R14 R15 R16 R17 R18  E10 OH OH H H H N(CH3)2  E11 OH OH H H OH H  E12 H H OH H OH H  E13 OH OH H OCH3 H H  E14 OH OH H OC2H5 H H  E15 OH OH H H NO2 H  E16 OH H H H ON2 H

    F.第6组化合物第6组化合物的化学结构如下：

    其中R19表示芳基、烷基、链烯基或炔基，优选表示2—(3，4—二羧基苯基)乙烯基；R20表示烷基，优选表示羟乙基(ethyenehydroxy)；或R19和R20一起表示芳基，优选表示具有＝CH—(单或双羧基—苯基)取代基的吗啉环。

    第6组化合物的实例列于表VI中并如图1f所示。

                            表VI

       化合物     R19        R20    F10   (CH2)2OH   CH＝CH—3，3—     二羟基苯基    F11 2—C＝CH—(3，4—二羟基苯基)吗啉代    F12 2—C＝CH—(3—羟基苯基)吗啉代G.第7组化合物第7组化合物的化学结构如下：

    其中b表示任意的pi键，

    Y和Z独立地表示碳或氮；

    R21和R22独立地表示氢、卤素、OH、SH、NH2、NO2、烷基、烯基、炔基、烷氧基、苯甲酰基、COOH、戊烷酯基，优选表示OH、NO2、CH3、甲氧基、苯甲酰基或COOH；或R21和R22一起形成芳环表示芳基，优选表示苯基；

    R23表示氢、卤素、＝O、OH、SH、NH2、烷氧基、COOH、芳基，优选表示取代或未取代的苯胺基、取代或未取代的苯基、氢、COOH、＝O、烷氧基或甲氧基，条件是如果R23表示＝O，b表示一键。

    R24表示H或芳基，优选表示取代或未取代的苯胺基、苯基或2—噻吩基；以及

    R25表示氢原子、卤素、＝S或＝O，这里若R25表示＝O或＝S，那么b为一键；条件是如果b不为一键，在相邻氮原子上可任意地带有选自氢、烷基、亚烷基氨基、亚烷基氨基烷基和亚烷基氰基的取代基。

    第7组化合物的实例列于表VII中并如图1g所示。                             表VII

      化合物    b  Y Z  R21    R22    R23    R24   R25   G10   键  N C  H    H    H   苯基    H   G11   键  C C OCH3   OCH3   OCH3   苯基   Cl   G12   键  C C OCH3   OCH3    H   苯基   Cl   G13   键  N C CH3   CH3    H   苯基    H   G14   键  N C OCH3   OCH3    H   苯基    H   G15   键  N C  H    H    H   2—  噻吩基    H   G16   键  N N  H    H    H   苯基    H   G17   键  N C OH   OCH3    H   苯基    H   G18 无价键  N C CH3   CH3   ＝O   苯基    H   G19   键  N C  H   CH3    H   苯基    H   G20   键  N C OH   OH    H   苯基    H   G21   键  N C  H 苯甲酰基    H   苯基    H   G22   键  N C      苯基    H   苯基    H   G23   键  N C  H   NO2    H   苯基    H   G24   键  N C CH3   CH3 3，4—二 羟基苯基   苯基    H   G25   键  N C CH3   CH3   COOH   苯基    H   G27   键  N C CH3   CH3    H   NO2    H   G28   键  N C CH3   CH3    H  3—溴 苯基氨基    H   G29   键  N C CH3   CH3   3—碘 苯基氨基    H    N   G30   键  N C CH3   CH3  4—碘代 苯基氨基    H    HH.第8组化合物

    第8组化合物的化学结构如下：其中R26和R28独立地表示烷基、芳基、烯基或炔基；及R27表示芳基。第8组化合物实例列于表VIII中并如图1h所示。                             表VIII

       化合物    R26    R27R28    H10    CH3    苄基3，4—二羟基苯基    H11    CH3    苄基2—羟基苯基    H12    CH3    苄基3—羟基苯基    H13    CH3    苄基4—羟基苯基    H14    CH3    苄基3，4，5—三羟基苯基I.第9组化合物第9组化合物的化学结构如下：

    其中R30表示烷基、烯基或炔基，优选表示CH3；R31表示芳基，优选苯基；及R32表示O或S。第8组化合物的一个实例即I10，如图1i所示。J.第10组化合物第10组化合物的化学结构如下：其中R33表示烷基或芳基；

    R34、R35和R36独立地表示卤素、OH、氢、烷氧基、SH、NH2或C(CH3)3，优选的R34、R35和R36独立地选自H、OH和C(CH3)3。

    第10组化合物的实例为J10和J11，如图1j所示。

    K.第11组化合物。

    第11组化合物的实例如图1k所示。第10组化合物通过“P.”识别。

    L.化学命名原则

    本申请提及的一些化学基团的定义如下所述。

    “烷基”是指饱和的脂族烃，包括直链、支链和环烷基。优选的烷基含1—12个碳原子，更优选的含3—9个碳原子。烷基可被取代或不被取代。当被取代时，取代基优选的为羧基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO2或N(CH3)2、氨基、SH或芳基。

    “烯基”是指含至少一个碳一碳双键的不饱和烃基，包括直链、支链或环状基团。优选的烯基含1—12个碳原子，更优选的含3—9个碳原子。烯基可被取代或不被取代。当被取代时，取代基优选的为羧基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO2或N(CH3)2、氨基、SH或芳基。

    “炔基”是指含至少一个碳—碳三键的不饱和烃基，包括直链、支链或环状炔基。优选的炔基含1—12个碳原子，更优选的含3—9个碳原子。炔基可被取代或不被取代。当被取代时，取代基优选的为羧基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO2或N(CH3)2、氨基、SH或芳基。

    “烷氧基”是指“—O—烷基”基团，其中“烷基”的定义如前所述。

    “芳基”是指具有至少一个共轭pi电子体系环的芳基，包括碳芳基、杂环芳基和双环基团，所有基团都可被任意取代。芳基的优选取代基为羧基、氰基、烷氧基、烷基、烯基、炔基、氨基和芳基。

    碳环芳基是指芳环的环原子是碳原子的基团，碳原子可被任意取代。碳环芳基包括单环碳环芳基以及被任意取代的萘基。

    杂环芳基是指在芳环中有1—3个杂原子作为环原子而其它环原子是碳原子的基团。合适的杂原子包括氧、硫和氮，并且包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N—低级烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基等，均可被任意地取代。

    “烷酯基”是指COOX基团，其中X表示低级烷基。

    术语“低级”在这里分别与有机基团或化合物相关的是指至多7个且包括7个碳原子，优选是指至多4个且包括4个碳原子，更优选的是指一或二个碳原子。这样的基团可为直链或支链的。

    II细胞增生疾病

    我们设计了上述组合物和方法通过抑制PDGF—R活性抑制细胞增生疾病。如上所述，细胞增生疾病在多细胞有机体中引起一或多个细胞亚组的不良细胞增生，并对有机体产生伤害。不良PDGF活性可刺激细胞增生疾病。不良的PDGF或PDGF—R活性可以两种方式刺激特定类型细胞的不良细胞增生，即通过直接刺激特定区域的血管化，这样的细胞包括例如肿瘤组织，并因此有利于组织的生长。

    应用本发明最好首先鉴别细胞增生疾病是不否是由PDGF—R引起的。一旦发现这种疾病，利用医生们熟知的手段通过对症状的分析可以确定这种疾病的患者。这样的患者可采用上述的方法治疗。

    要确定细胞增生疾病是否由PDGF—R引起首先要确定细胞内或身体特定部分的PDGF—R活性水平。例如，在有癌细胞情况下，使一或多种PDGF—R活性的水平与非PDGF—R引起癌症的情况(例如下述A431细胞)和PDGF—R引起癌症的情况(例如下述的恶性胶质瘤细胞)相比较。如果相对于非PDGF—R引起癌症的情况而言，癌细胞具有较高PDGF—R活性水平，优选是等于或高于PDGF—R引起癌症的情况，那么对它们可采用所述PDGF—R抑制剂治疗。

    在非癌细胞的不良增生引起的细胞增生疾病的情况下，使其PDGF—R活性水平与普通人群的活性水平相比较(例如除去患细胞增生疾病的人或动物的普通人或动物的平均水平)。如果不良细胞增生疾病的特征在于比普通人群具有更高的PDGF—R水平，那么该疾病可采用所述PDGF—R抑制剂治疗。

    细胞增生疾病包括癌症、血管增生疾病和纤维变性疾病。这些疾病并不一定是独立的。例如，纤维变性疾病可能与血管疾病有关，甚至与血管疾病叠加。例如动脉粥样硬化(这里是以血管疾病为特征的)可引起纤维组织的异常生长。

    癌细胞指各种恶性肿瘤，其中绝大多数侵犯周围组织，并向不同部位转移，这正如Stedman′s Medical Dictionary25th edition(Hensyl ed.1990)所述。可采用本发明治疗的癌症的实例包括轴内脑瘤、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、卡波济氏肉瘤和皮肤癌，它们都具有不良PDGF—R活性。癌症的类型可被进一步特征化。例如轴内脑瘤包括多形性恶性胶质瘤、退行发育的星形细胞瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、间胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑脊膜瘤、成血管细胞瘤和松果体薄壁组织。

    血管的形成和分布、或血管产生和血管生成分别在各种生理过程如胚胎发育中起重要的作用，并可治愈器官退化。这也在肿瘤的生长过程中起作用。血管增生疾病是指常常可引起血管异常增生的血管产生和血管发生疾病。这样的疾病的实例包括再狭窄、视网膜病和动脉粥样硬化。

    进一步的动脉粥样硬化损伤是由于对血管壁内皮细胞和平滑肌细胞损伤过分的发炎—增生反应引起的。(RossR.，Nature 362：801—809(1993))。看起来，部分反应是由PDGF—BB分泌和内皮细胞和平滑肌细胞中的PDGF—R的活化调节的。细胞转移和细胞增生二者都在动脉粥样硬化损伤的形成中起作用。

    纤维变性疾病是指细胞外基质的异常生成。纤维变性疾病的实例包括肝硬变和肾小球膜的细胞增生。

    肝细胞是以细胞外基质组分的增加为特征的并引起肝伤疤的生成。肝硬变可引起疾病如肝硬化。可产生肝伤疤的细胞外基质的增加也可由于病毒感染产生如肝炎。脂细胞似乎在肝硬变中起了主要的作用。不良的PDGF—R活性可刺激脂细胞增生。

    肾小球膜细胞增生疾病是指由肾小球膜细胞的异常增生引起的疾病。肾小球膜增生疾病包括各种人体肾病，如肾小球性肾炎、糖尿病肾病、恶性肾硬化、血栓形成的微血管病综合症、移植排斥和肾小球病。PDGF与肾小球膜细胞增生的维持有关。(Floege，J.et al.，Kidney International 43S：47—54(1993).)。

    如上所述，其它这样的增生疾病可通过标准技术和通过确定所述化合物作用的效率而确认。A.卵巢癌

    本发明的一个方面涉及卵巢癌的治疗。内皮卵巢癌大约占所有卵巢癌的90％并继续发展成极致命的恶性肿瘤。在美国每年大约新诊断出19,000例卵巢癌，其中12,000名妇女死于癌症(Bodriguez et al.，in Devita，Hellman，Roseu-berg(eds)Biologic Therapy of Cancer，JB Lippincott，1991)。

    对进一步恶化的卵巢癌的治疗通常包括细胞还原术，随后化疗和烷基化剂结合使用。烷基化剂例如顺氯氨铂和环磷酰胺。然而，恶化的卵巢癌患者的长期存活率是极低的，在10％—20％范围内，这主要是由于在整个腹腔内，以及某些情况下，在淋巴结内的肿瘤转移的高发生率。而且，采用化疗和顺氯氨铂可带来潜在的肾脏毒性和进行性神经病。

    本发明揭示了PDGF受体表达和内皮卵巢癌之间的病理关系，并且提供了抑制内皮卵巢癌细胞的不良PDGF—R活性以抑制增生疾病的组合物和方法。治疗卵巢癌的方法，包括向卵巢癌细胞、支持基质细胞(即肿瘤或转移的损伤生长的骨架)，和/或有关的血管内皮细胞中给药可抑制不良PDGF—R活性的组合物。

    对采用所述化合物的治疗敏感的卵巢癌包括内皮卵巢癌、卵巢肿瘤转移以及其它表达PDGF受体的卵巢细胞。如下所述，可抑制PDGF—R活性的组合物也可抑制体内卵巢癌细胞的增生和抑制体内卵巢肿瘤的生长。更具体地说，采用本发明的一个组合物A10几乎可以完全抑制用人体卵巢癌细胞异移植的小鼠肿瘤的生长，而没有明显的细胞毒性和死亡率，从而具有优异的治疗效果。

    因此，作为本发明方法的一个实例，A10是通过任何常规的给药途径和采用任何可使A10与PDGF受体—阳性(receptor—positive)卵巢癌细胞和/或周围基质细胞接触的合适的药物载体，向被确诊为卵巢癌的患者给药的。在卵巢癌在腹腔内定点扩散的情况下，特别是恶化的情形下，优选的给药方式就是通过静脉或腹腔内注射A10的无毒药物制剂。

    对于治疗卵巢癌治疗有效的组合物的制备和应用详述如下并通过实施例说明。除了在此特别公开的组合物之外，本发明还提供了对其它组合物的识别，这些组合物由于具有对PDGF—R活性的抑制作用而可被用于抑制卵巢新生物的增生。采用任何适当的试验，如体外自动磷酸化抑制ELISA和酪氨酸激酶抑制试验，通过它们抑制PDGF受体自体磷酸化的能力选择组合物。选定的组合物通过测试其抑制卵巢癌细胞生长的能力，以及理想情况下，通过测试其对体内异种移植肿瘤的抑制，评估治疗效率。下面实例中所述的方法或类似的方法可在这样的试验中采用。    B.神经胶质瘤

    本发明另一方面涉及神经胶质瘤家族中原发轴内脑瘤的治疗，包括但不局限于星形细胞瘤和恶性胶质瘤。在成人中，多形性恶性胶质瘤是源于星形细胞瘤的最常见和最恶性的肿瘤，并在所有原发性脑瘤中占了大半(参见，例如CecilTextbook of Medicine，Wyngaarden，Smith，Bennett(eds)WB Saunders，1993，p.2220)。

    神经胶质瘤具有直接进攻进入脑组织的一般性质，它基本上是恶性的并总是致命的。即使逐步采用手术、化疗和放疗结合治疗，恶性胶质瘤患者也只具有少于1年的中等存活期。不幸的是，鉴于确定神经胶质瘤在正常脑组织中微观界限的困难和不可能性，成功的手术切除是极罕见的。类似的，用烷基化剂化疗也很少成功，少于10％神经胶质瘤患者有明显反应。放疗在控制神经胶质瘤生长方面有一定作用，但常常引起很大的神经损伤。用干扰素—β与放疗和化疗结合使用有一些成功(Devita，Hellman，Rosenberg(eds)Bio-logic Therapy of Cancer，JB Lippincott，1991)。

    本发明揭示了PDGF受体表达和神经胶质瘤之间的病理关系，并且提供了抑制神经胶质瘤细胞内PDGF活性以抑制增生疾病的组合物和方法。治疗神经胶质瘤的方法包括给药在神经胶质瘤细胞和/或近血管内皮细胞中表达的抑制PDGF—R活性的组合物。特别的，这里特别公开的绝大多数组合物在体外抑制人体神经胶质瘤方面具有很高的活性。一些这样的组合物可抑制培养的神经胶质瘤移出培养物的生长。而且，A10强烈抑制向小鼠中异移植的神经胶质瘤的生长。在一些动物中，相对于未接受治疗的对照组而言对肿瘤生长抑制超过95％。

    因此，作为本申请方法的一个实例，可通过任何给药途径和采用任何合适的可使A10与PDGF受体—阳性神经胶质瘤细胞和近血管内皮细胞(它常常使神经胶质瘤大规模增生)接触的药物载体，向神经胶质瘤患者给药A10。静脉和动脉注射是优选的给药途径。而且，最近发展起来的微导管技术对于将本发明组合物直接运送到神经胶质瘤所在位置是特别有效的，因此可以实现与癌和近内皮细胞的立即的定点的接触，从而有可能减低与更远程脉内运送有关的潜在的毒性。

    对于治疗神经胶质瘤治疗有效的组合物的制备和应用详述如下并通过实施例说明。除了在此特别公开的组合物外，本发明还提供了对其它组合物的识别，这些组合物由于具有对PDGF受体活性的抑制作用而可被用于抑制各种轴内肿瘤的增生。采用任何适当的试验，如体外自体磷酸化抑制ELISA和酪氨酸激酶抑制试验。通过其抑制PDGF受体活性的能力选择组合物。通过测试其对神经胶质瘤的抑制，以及理想情况下，通过测试其对体内异种移植肿癌的抑制，来评估选定组合物的治疗效率。III.A10

    本发明描述几种可用于抑制PDGF—R活性因而抑制细胞增生疾病的组合物。尽管几种药理考虑被预料会妨碍组合物发挥其效力，用A10在动物中抑制肿瘤生长证明这些组合物在体内发挥了功能。这类体内抑制在后面所述的实施例中举例说明。

    A10也已知为leflunomide，HWA486，和5—甲基异恶唑—4—羧酸—(4—三氟甲基)苯胺化物。几种公开物曾讨论过A10不同的可能用途。根据Kommerer F—J等人US—4284786(1981)和Kommerer F—J等人US—4351841(1982)的摘要，A10“具有抗风湿，消炎，退热和止痛作用，并可用于治疗多发性硬化。”根据Talmadge J.E.，和Twar—dzik D.R.Agent and Actions 35S：135—141(1991)。“leflunomide活性的机理可能是抑制细胞活素特别是磷酸根转移酶的假设被提出。”与5—甲基异恶唑—4—羧酸有关的Robertson S.M.和Lang L.S.，EP—0413329A2(1991公开)围绕leflunomide宣称：

    本发明指通过用5—甲基异恶唑—4—羧酸苯胺化物和羧基亚乙基氰基乙酸苯胺优物衍生物治疗与免疫病原学有关的眼病的方法。另外，化合物可用于治疗与免疫病原学有关的全身病相关联的视觉现象。化合物显示免疫抑制，抗炎，和中等抗过敏活性，并可用于治疗眼病如眼色素层炎(包括炎风湿性小结)、视网膜炎，过敏(春季角膜结膜炎和过敏性或巨型乳头结膜炎)和干眼(Sjogren综合症)。另外，化合物对角膜或其它眼组织的移植存活有用，并可作为异位或免疫减少患者的外科附属物。

    Barlett R.R等人，标题为“异恶唑—4—甲酰胺和羧基亚烷基—氰基乙酰胺，含有这些化合物的药物的用途”的PCT/EP90/01800的摘要宣称：

    异恶唑—4—甲酰胺衍生物和羧基亚烷基氰基乙酰胺衍生物适宜于治疗癌症。这些化合物可通过现有技术方法制备。另外，它们中有些是新的并适于治疗风湿病。

    Barlett R.R.等人，Agents and Actions 32：10—21(1991)，宣称：leflunomide已显示对预防和治愈几种自身免疫动物疾病特别有效。Barlett也宣称：可以显示RR—SRC肽底物的酪氨酸化和表皮生长因子(EGF)受体的自身磷酸化，依赖于剂量，被leflunomide抑制。

    Matter等人，FEBS 334：161—164(1993年11月)(不认为是先有技术)描述了使用leflunomide的活性代谢物来抑制EGF—依赖的细胞生长，包括A431细胞。Matter也宣称：

    血小板—衍生的生长因子—依赖的酪氨酸磷酸化也在未受损细胞中以类似于附图3(数据未示出)所述的EGF—依赖的磷酸化浓度被A771726抑制。

    研究本发明的一种组合物，A10，通过后面实施例更充分地描述，确定了其抗以不良的PDGF—R活性而不是EGF活性为特征的脑、肺、前列腺，卵巢，皮肤，和结肠癌细胞的效力。如后面所述实施例说明的，A10抑制PDGF—R活性，但对EGF—受体或HER2磷酸化几乎没有作用。此外，当A10抑制PDGF—R活性为特征的肿瘤生长时，A10并不明显地抑制表达EGF受体的异物移植细胞的生长(A431表皮样细胞)。这一数据以由Bartlett等人，前述A-gents and Actions所述结果的观点是令人惊奇的，文献中leflunomide被显示抑制EGF诱导的EGF受体自身磷酸化和细胞增生，和前面Matter等人的结果，其中leflunomide的活性代谢物抑制A431细胞的生长。

    本申请证实了A10抑制不适宜的PDGF—R活性和不良的体内细胞增生能力，如发生在以不良的PDGF—R活性为特征的癌中的。如后面所述实施例举例说明的，A10可用于选择性地抑制不良的PDGF—R活性。

    如果其抑制受体磷酸化的能力(例如如后所述的IC50)低于其细胞毒性作用(例如，如后所述的LD50)，则化合物被判定为有磷酸化效果。不同受体如PDGF—R，EGF—R或HER—2受体的磷酸化的抑制依赖于诸如药物浓度的条件。“选择性抑制”意指化合物可在特定的浓度用于抑制PDGF—R的磷酸化，且在同样浓度如果对EGF—R和/或HER—2受体的磷酸化有任何作用，也是很小的。

    优选的，象A10这样的化合物可抑制PDGF—R，同时，如果对EGF—R和/或HER—2磷酸有任何作用也很小。对EGF—R，或HER—2活性“如果有任何作用也很小”意指受体活性对一特定受体效果不大于35％，更优选地不大于20％，最优选地不大于10％。

    酪氨酸激酶对许多生物过程包括细胞生长，变异，聚集，趋化性，细胞活素释放，和肌肉收缩等很重要。很多这类事件是通过不同的酪氨酸激酶受体介导的。另外，不同的酪氨酸激酶受体对不同细胞类型的特定生物功能是重要的。通过发展PDGF—R的选择性抑制剂，化合物可能的毒性作用被降低。

    这里所描述的化合物在它们选择性地抑制PDGF—R方面是变化的。例如，D14，G12，G13和G14抑制PDGF—R磷酸化但对EGF或Her—2磷酸化没有效果，而C10对EGFR，PDGF—R，和Her—2磷酸化起作用。IV.变异的PDGF—R

    以不良的PDGF—R活性为特征的细胞增生疾病也可用变异的PDGF—R抑制。Ueno H.，等人，Science 252：844—252(1991)，描述了核酸编码截短的PDGF—R体内抑制PDGF—R磷酸化。根据Ueno：

    当截短的受体与野生型受体相比过表达时，被PDGF受体自身磷酸化刺激，将磷脂酰肌醇-3激酶与受体关联，钙流动被阻断。

    Ueno没有由变异的蛋白质可抑制不良的细胞增生证明PDGF—R活性的抑制。

    这类体内的不良的细胞增生抑制在后面所述的实施例中说明，用核酸编码PDGF—R，刚好在第一个酪氨酸激酶区域结构有一个终止密码子。核酸被用于将截短的蛋白质引入细胞。例如，编码一个截短的PDGF—R的核酸被用标准重组DNA技术放入逆病毒载体中。该载体然后侵染一个细胞，在其中其核酸最终转译入蛋白质产生一个截短的PDGF—R。其它将变异的蛋白质引入细胞的手段包括在体外制备变异的蛋白质并用载体如脂质体将蛋白质引入细胞内。

    突变体PDGF—R将被建造以干扰发生在二聚的受体间的分子间磷酸化。这一点可通过各种手段实现，例如1)PDGF—R的截短，优选地消除一个酪氨酸激酶区域结构，最优选地消除所有两个酪氨酸激酶区域结构；2)抑制PDGF—R催化区域催化能力的变异作用，如赖氨酸602变异为精氨酸防止ATP的联接。这些方法中，酪氨酸残基的变异是优选的，而受体的截短是最优选的。

    用核酸编码截短的PDGF—R以抑制动物的肿瘤生长证明了这类截短的受体在体内发挥功能的能力，尽管各种药理考虑被预料会妨碍组合物发挥其功效。这样，本申请证明用核酸编码截短的PDGF受体并不限于在细胞培养中抑制PDGF—R。更确切地，核酸编码PDGF—R可被用于在动物细胞中抑制不良的PDGF—R活性、因而抑制动物细胞的肿瘤生长，并可应用于其它PDGF—R相关的疾病。

    V.特征化合物的给药

    本发明化合物可以对病人单独给药，或以含有活性化合物的一种载体或赋形剂的药物组合物形式给药。化合物可被制成药学上可接受的盐(即，不防碍化合物发挥作用的无毒盐)。

    药学上可接受的盐可以是酸加成盐，如盐酸盐，硫酸盐，磷酸盐，氨基磺酸盐，乙酸盐，柠檬酸盐，乳酸盐，酒石酸盐，丙二酸盐，甲基磺酸盐，乙基磺酸盐，苯磺酸盐，对—甲苯磺酸盐，环己基氨基磺酸盐和奎尼酸盐。(参见，在前申请PCT/US92/03736)。这些盐可以通过使用盐酸，硫酸，磷酸，氨基磺酸，乙酸，柠檬酸，乳酸，酒石酸，丙二酸，甲基磺酸，乙基磺酸，苯磺酸，对—甲苯磺酸，环己基氨基磺酸和奎尼酸衍生获得。

    药学上可接受的盐可通过标准技术制备。例如先将游离碱形式的化合物溶于含有合适酸的水或水—醇溶液，然后蒸发溶液分离出盐。再例如，在有机溶剂中使游离碱和酸反应制备盐。

    载体或赋形剂可以促进化合物的吸收，例如增加化合物的溶解性。载体和赋形剂的例子包括碳酸钙，磷酸钙，不同的糖或不同类型的淀粉，纤维素衍生物，明胶，植物油，聚乙二醇和生理上相容的溶剂。组合物或药物组合物可通过不同途径给药，包括，静脉内的，腹膜内的，皮下的，肌内的，口服，体表给药或转化粘液质式给药。

    许多特征化合物，如A10和B11，是疏水性的，因此在水中不易溶。有效量的A10可通过使A10与PBTE：D5W结合获得。PBTE由3％W/V苄醇，8％W/V多乙氧基醚和含65％W/V聚乙二醇(MW＝300道尔顿)的绝对乙醇溶液组成。PBTE∶D5W由PBTE以l∶1的5％右旋糖水溶液稀释组成。A10在PBTE：D5W中的溶解性为5mg/ml。这里所描述的其它化合物的溶解性可通过标准技术获得。另外，活性药物本身(如B11)可通过口服制剂给药。

    其它的克服疏水性问题的方法包括以每天少量多次给药代替大量少次给药。例如，组合物以较短的时间间隔给药。最好使用一个泵控制间隔时间给药或连续给药。合适的泵商业可获得、(比如，AL2a公司卖的ALZET泵，如BardMedSystems卖的BARD非卧床PCA泵)

    可选择的、也可使用前药增加溶解性。前药在生理条件下可降解成活性药物。例如，Patterson等人，J.Med.Chem.35：507—510(1992)描述A12(3—羧酸—5—甲基—N—[4(三氟甲基)苯基]—4—异恶唑甲酰氨)与A10相似，可作为B11的前药。

    合适的剂量取决于不同的因素，如所治疗疾病的类型，所用的特定的组合物，病人的大小和病人的生理条件。治疗癌症所期望的A10的每天的剂量为1到2000mg/天，优选1到250mg/天，特别优选10到150mg/天。只要药物活性部分的血浆水平能达到足以维持治疗有效，给药不需太频繁。

    影响药物用量的一个因素是体重。给药量范围应在0.02～25mg/kg/天，优选0.02～15mg/kg/天，特别优选0.2～15mg/kg/天。另外，给药量可按0.5～1200mg/m2/天，优选0.5～150mg/m2/天。平均血浆水平应为50～500mg/ml，优选50～100mg/ml，特别优选100到500mg/ml。如果在所关注的位点上达到了药物药学上的有效浓度，则血浆水平可能降低。VI.变异PDGF—R的给药

    PDGF—R突变体可使用如下所述的标准技术以核酸表达蛋白质的形式给药。传送赋形剂包括脂质体和其它药物组合物。核酸编码变异的PDGF—R同样可应用标准技术如逆转录和离子成对分子引入到细胞中。同样地此技术可应用于体外活细胞而应用于病人。使用如上所述的载体或赋形剂可促进蛋白质的给药。

    所选药物的特定释放途径依赖于所使用的药剂(特征化合物的给药也要考虑此点)。一般的，药剂的特定释放方案主要考虑药剂摄取时细胞内的定位，并接着进行药效证明。另外，可继续进行动物实验，将药物释放到动物的器官或组织的同样细胞内。摄取研究包括摄测定到评估，例如，不考虑传递赋形剂或方案，细胞核酸或蛋白质的摄取。这种测定同时确定了药剂摄取后细胞定位，最终确定了维持含有靶序列的细胞室内的稳态浓度所需的必要条件。(细胞核和/或细胞质)。然后测定效果和细胞毒性。毒性不仅包括细胞活性还包括细胞功能。一般地，突变蛋白和核酸的用量如前述特征化合物用量。

    药物传递赋形剂对系统和局部给药同样有效。他们可被设计为缓慢释放的药物贮库，或将其内含物直接释放到靶细胞。使用直接释药赋形剂的优点在于每次摄取可释放许多分子。这种赋形剂能延长药物循环的半衰期，不使用赋形剂时它们将被血液很快清除。此范围内的特定释药赋形剂的一些实例有脂质体，水凝胶，环糊精，生物可降解的微囊，生物粘附微球。泵也可用于此目的。

    此范围内的释放系统，优选脂质体，脂质体能增加分子内稳定性，增加有效摄取和生物活性。脂质体是空球形泡囊，它同脂类组成，这些脂类的排列与组成细胞膜的脂类排列相似。它们含有中间水空间可以容纳水溶性化合物。其大小范围在直径0.05到几微米。抗体可连接在脂质体上以定位于特定细胞。

    PDGF—R突变体和特征化合物的局部给药较为有利，因为它将浓度集中于具有最小系统吸收的给药点。这样简化了药剂在病变点的释放方法，也减小了毒理特征范围。而且，这种给药途径所用的药物剂量的其它给药途径所需的量小得多。有效的释放需要核酸进入细胞膜或细胞质，以不良的PDGF—R活性和表达蛋白质为特征。

    药物还可系统给药。内吸吸收是指药物先累积在血流中然后再分布于全身。导致全身吸收的给药途径包括：静脉内的，皮下的，腹膜内的，鼻内的，鞘内的和眼的。每个给药途径都是将药暴露于易达到的病变组织。皮下给药药物经淋巴网进入循环，集中于淋巴结。进入循环的比例显示为细胞重量或大小的函数。

    VII.实施例

    下述实施例举例说明了本发明的不同方面，并更具体体现了本发明。这些例子不以任何方式限制所公开的发明。而且，所用论述方法是那些已公开了分子式的药物能通过常规方法很容易的证明他们具有所期望的活性。这样，能在本发明要求保护的化合物形式中筛选以决定那些具有最适合活性的化合物优先的用于动物或人。采用本发明的方法也可以对其它化合物进行筛选以决定他们的适用性。

    用在下列实施例中的某些过程的描述在下列附录中被描述。在不同的过程中提及使用Al0，但是，非A10的化合物可通过代替A10作为试验化合物通过这些过程被测试。

                         附录11.细胞系

    细胞系以ATCC购买除非另外指定。U1240和U1242细胞从Dr.Joseph Schlessinger(New York UniversHg)获得，SF763和SF767细胞从Dr.Michael Berens(BarrowNeurological Institute)获得。

    SF767T，SF763T，U118T，和SKOV37分别是SF767，SF763，U118和SKOV3细胞的亚型(sublines)，它们通过将亲代细胞SC植入BALB/c，nu/nu小鼠而衍生获得。显示相当的生长特征的肿瘤可在无菌平皿中被切除或很好地控制(minced)。向血浆中加入2到5ml适当的培养基，肿瘤部分被进一步机械挑开。所得悬浮液放入组织培养瓶，用附加有100单位/ml青霉素G钠和100μg/ml链霉素硫酸盐(Gibco，Grand Island，NY)的适当培养基喂养。培养基每两到三天换一次，三到五代后，撤除附加的抗生素，将细胞保存在无抗生素的介质中。

    使用递转录病毒的载体设计NIH3T3小鼠成纤维细胞过度表达(overexpressing)EGF受体，FLK—1，IGF—1受体或PDGF—b受体。在MCF7环境中，使用逆转录病毒构件体过度表达HER2基因得到MCF7/HER2细胞。2.细胞培养

    所有细胞培养基，谷氨酰胺和胎牛血清除非另外指定均从Gibco Life Technologies(Grand Island，NY)购买。所有细胞都在90～95％空气和5—10％CO2的湿润气体环境和37℃条件下生长。所有细胞系按常规方法每周传代两次，并用Mycotect方法鉴定为支原体阴性。

    C6细胞保存在附加了5％胎牛血清(FBS)和2mM谷氨酰胺(GLN)的Ham′s F10。T98G细胞在含有10％FBS，2mMGLN，1mM丙酮酸钠(NaPyr)和非—必需氨基酸(NEAA)的MEM中培养。SKOV 3T细胞在DMEM，10％FBS和2mMGLN中培养。

    NIH3T3小鼠成纤维细胞被设定过度表达F1K—EGF受体并保存在含有10％小牛血清(CS)和2mM GLN的DMEM中。NIH3T3被设定过度表达IGF—1或胰岛素受体并保存在含有10％FBS和2mMGLN的DMEM中。HL60细胞保存在含有10％FBS和2mMGLN的RP-MI1640中。T47D和BT474细胞保存在含有10％FBS，GMS—G和2mMGLN的RPMI1640中。

    DU145细胞在含有10％FBS和2mMGLN的DMEMF12中生长。A172，A431，U118MG和RAG细胞在含有10％FBS和2mMGLN的DMEM中生长。L1210细胞在含有10％马血清和2mMGLN的PMEM中生长。C1300细胞在含有10％加热灭活的FBS，2mM GLN和50mMβ—巯基乙醇的DMEM中生长。T98G，U138MG，U87MG，U373MG，U1240，U1242，Calu—3，Calu—6，SF767，SF767T，SF763，SF763T，SK—N—MC和SK—U—SH细胞在含有10％FBS，NEAA，1mMNaPyr和2mMGLN的MEM中生长。MDA MB361和MDA MB468细胞在含有10％FBS和2mMGLN的HAM′s F12中生长。ZAR75—30细胞在含有10％FBS，2mMGLN和1mMNaPyr的RP-MI1640中生长。MCF7，MCF7/HER2，A375，BT549，9L，C81—61，ZR75—1和K562细胞在含有10％FBS和2mMGLN的RPMI1640中生长。Ovcar3细胞在含有20％FBS和2mMGLN和10mg/mL胰岛素的RPMI1640中生长。D1B和T27A细胞在含10％加热灭活的FBS，2m-MGLN和50mMβ—巯基乙醇的RPMI1640中生长；7TD1细胞在附加50单位/ml鼠IL—6重组体的同样培养基中生长。Colo 320DM，WEHI—164.13，和HBL100细胞在含10％加热灭活的FBS和2mMGLN的RPMIl640中生长。SKBR3细胞在含有15％FBS和2mMGLN的McCoy′s 5A中生长。PA—1细胞在含有10％加热灭活的FBS，2m-MGLN和NEAA的MEM中生长。Neuro 2A细胞在含有加热灭活的FBS，2mMGLN，NEAA，NaPyr和50mMβ—巯基乙醇的MEM中生长。

                        附录2

    1.受体磷酸化

    通过使用western印迹和ELISA方法进行使用A10抑制受体酪氨酸激酶活性的研究。在western印迹实验中，将细胞悬浮于2mL培养基中并涂布在6—孔盘上。(每孔含细胞500,000个)，贴附过夜。用附加1％FBS的2mLMCDBl05(UCSF Cell Culture Facility)替换培养基。将板在CO2环境下，37℃培养过夜。测试化合物对配体媒介的受体自动磷酸化的作用，在配体刺激受体酪氨酸激酶活性之前将细胞在A10或DMSO中，37℃条件下暴露1小时。与配体在室温保温7分钟后，将板放在冰上，用1ml冰冷却的PBS加上1mM原钒酸盐洗涤3次。将细胞用移液管移至含有50mM(Tris)缓血酸胺，PH7.4，10％甘油，1％NP—40，2mMEDTA，1mM钒酸钠，10mM焦磷酸盐，1mMPMSF，10mg/ml抑肽酶，10mg/ml亮肽素的0.5ml缓冲液中，使细胞溶解。将每份300μl的细胞溶解物立即加入到100μL4×LaemmLi标准缓冲液(0.2mM缓血酸胺，PH6.9，20％甘油，7％SDS，5mMEDTA，5％β—巯基乙醇)含有磷酸酶抑制剂，2mMNa3VO4和10mM焦磷酸。样品沸腾5分钟，在干燥冰—乙醇中冰冻，在-80℃保存。将蛋白质溶于SDS—PAGE(Bio—Rad MiniproteanII)，在含有25mMTris，PH8.3，20％甲醇，0.2M甘氨酸，0.1％SDS的缓冲液中，120伏特，室温条件下，用1小时将蛋白转移到硝化纤维素膜上。蛋白质到膜的转移是否完全用1％丽春红(ponceau)S在5％乙醇中染色5分钟测定。用几次蒸馏的水冲洗脱色后，将膜在含有5％牛奶Tris—缓冲盐水，0.05％Tween20的抑制缓冲液中浸泡过液。磷酸酪氨酸通过将膜和抗—磷酸酪氨酸抗血清保温(室温1小时)检测，所用的抗血清在抑制缓冲液中以1∶3000稀释。对于C6细胞，细胞溶解物中所含有PDGF—b受体是通过应用western印迹试验使用PDGF—b受体的特异性抗体在双位置样品泳道中被证实。抗体通过使用Amersham的ECL试剂在Fuji RX底片上曝光显象。

    对ELISA测定来说，细胞在培养基中长到80—90％汇合后接种于含有0.5％血清的96—孔组织培养板上，每孔含细胞25,000到30,000。在0.5％含血清培养基中保温过夜，将细胞培养基换为无血清培养基，并用试验化合物在5％CO2，37℃保温条件下处理2小时。细胞用配体刺激5—10分钟，接着用HNTG(20mMHepes，15mMNaCl，10％甘油，5mMEDTA，5mmNa3VO4，0.2％Triton X—100，2mMNaPyr)溶解。细胞溶解物(0.5mg/孔，在PBS中)转移到预先用受体特异性抗体包被的并用含5％牛奶的TBST(50mM Tris-HCl，pH7.2，150mM Nacl和0.1％Triton X—100)在室温封闭30分钟的ELISA板上。细胞溶解物在室温保温1小时并振荡。板用TBST洗涤4次，与多克隆抗磷酸酪氨酸抗体在室温保温30分钟。用TBST漂洗4次除去过量的抗磷酸酪氨酸抗体。向ELISA板中加入山羊抗兔IgG抗体并在室温保存30分钟，用TBST漂洗四次以上。ABTS(100mμ柠檬酸，250mMNa2HPO4和0.5mg/mL2，2′—偶氮—双(3—乙基苯噻唑啉—6—磺酸)加上H2O2(1.2mL30％H2O2加到10ml ABTs)加到ELISA板上使颜色改变。加入ABTS15到30分钟后以630nm为参照波长，测定410nm的吸光度。在ELISA测定中使用的细胞系有U1242(PDGF—b受体)，HL—60细胞(GMCSF受体/JAK—2)，或过度表达EGF受体，Flk—1，IGF—1受体或胰岛素受体的NIH3T3细胞。IC50值通过比较药物在有无适合配体存在时对酪氨酸磷酸化的阻碍作用测定的。2.DNA合成

    A10对PDGF—依赖的DNA合成的作用是通过将3H—胸腺嘧啶脱氧核苷插入细胞DNA测定的。测定物条件基本上在Pollack，等人，J.Neurosurg.，73：106—112，1990中描述，但有些改变。将对数生长期的T98G细胞移至96—孔盘中。每200μL含血清培养基中含20,000个细胞。经过过夜贴附期，用200μLMCDB105培养基洗涤单层细胞两次，将细胞在200μL无血清MCDB105培养基中培养24小时。孔中培养基只用新鲜培养基代替(MCDB105加5μg/ml胰岛素)，培养基只含PDGF—BB，或培养基含有PDGF—BB与不同浓度的A10的结合物。将板在37℃，CO2环境中保温约18小时，向每孔中加入3H—胸腺嘧啶脱氧核苷(Amer-sham，5Ci/mmol)使最终浓度达到5μCi/mL，将板放回到37℃孵箱中，4小时后移去培养基，将板放在冰上，用冰—冷却的PBs将每孔洗涤两次。使用100μL冰冷却的TCA在冰上沉淀10分钟，可将插入放射性的DNA从未插入3H—胸腺嘧啶脱氧核苷的DNA分离出来。用冰冷却的TCA洗涤两次，将沉淀物溶解(含1％SDS的100mL10mM Tris碱)，并转移到液体闪烁计数小瓶中。加入6ml合剂(Ready Safe，Beckman)在Beckman LS6000SC型液体闪烁计数器中定量测量放射性。3.细胞周期分析

    将过度表达人PDGF—b受体的NIH3T3小鼠成纤维细胞接种于附加了10％CS和2mMGLN的PMEN上。细胞长到约80％汇合后用无血清培养基(DMEM，2mMGLN，2mMNEAA，2mMNaPyc和2mMHEPEs)处理过夜。将细胞与100ng/mL PDGF—BB和不同浓度的A10(0.1，1，10，25或100mM)一起保温20小时。收集细胞，染色，用流式细胞光度术分析DNA含量。4.生长测定

    Skehan等人在J.Natl.Cancer Inst.82：1107—1112，1990中描述了应用比色鉴定法测试A10对于不依赖锚基肿瘤细胞生长的抑制作用。使用平衡离子结合的硫氰酸胺B(SRB，Sigma)染料测量酸固定(acid—fixed)细胞中蛋白质含量。将A10溶解于DMSO(Sigma，细胞培养级)，并用适当的培养基稀释，使浓度为最后所需最终试验浓度的两倍。在测定中使用C6细胞，向含有粘接着单层细胞的96孔板中加入A10(100μL)(2000细胞/孔在100μL中)。对于其它细胞系，在药液调制好后立即将细胞(2000细胞/孔在100μL中)引入到孔中。4天后(37℃，5％CO2)，单层细胞用PBS洗涤3次，用200μL冰冷却的10％TCA(Fisher Scientific)固定，在4C保存60分钟。移去TCA，固定的单层细胞用自来水洗涤5次，在室温用吸水纸干燥，用溶于1％乙酸的100μL0.4％SRB对细胞蛋白染色10分钟。用自来水洗涤5次，将染料溶解于10mMTris碱(100μL每孔)，应用MR5000型Dy-natech板读数器在570nm读取吸光度。生长抑制数据是以只用0.4％DMSO处理的孔所测得的吸光度百分比表示的。PMSO控制与细胞在正常培养基中生长没有区别，IC50的值由对应函数的4参数曲线测定。

    在不依赖于锚基肿瘤细胞生长鉴定中，细胞(3000到5000每盘)悬浮于0.4％琼脂糖在鉴定培养基(DMEM含10％FCS)中有或无A10情况下放入35mm盘，此盘用固化琼脂碱层包被过(0.8％琼脂糖)，在37℃保温2—3周，用Ommicon3800肿瘤菌落叶数器定量得到菌落大于50μm。

                       附录31.肿瘤细胞系生长鉴定

    对于大多数肿瘤细胞系，如附录2中描述的使用SRS评定A10对细胞生长的抑制作用。对于K562，D1B，L1210，7TD1，T27A，和Colo320DM细胞，使用MTT测定法评估细胞生长。(Hansen等人，J.Immunol.Methods，119：203—210，1989)简单地说，向96孔板的每孔加入50mL含有不同浓度A10的培养基和50mL细胞悬浮液(2,000细胞)。将细胞在的7％CO2环境下，37℃温育4天，最后，向每孔加入15mLmTT(5mg/mL在PBS中Sigma)将板在37℃温育4小时，再向每孔加入溶解性溶液(含20％W/V的SDS的50％N，N—二甲基甲酰胺，PH4.7)。在一封闭容器内湿润环境下将板温育过夜。使用ELISA板读数器以630nm为参照波长，测定波长为570nm的吸光度。2.原发性肿瘤生长测定

    Oncotech，Inc.(Irvine，CA)已经测定了A10对原发性肿瘤生长的作用。在相关机构做完外科手术立即由病理学家将活肿瘤装入培养基，连夜运送到Oncotech。一收到肿瘤立即将一部分在福尔马林中固定以便切片，剩余部分切除坏死的，结缔组织和脂肪组织。对肿瘤的所有处理均在无菌条件下操作。将剩余肿瘤放入含有5mL培养基(RPMIl640附加了10％FBS，100Iu/mL青霉素，100mg/mL链霉素和L一谷氨酰胺)的Petri盘中，使用剪刀机械解聚成2mm或更小的块。所得浆状物与含有0.003％DNA酶(DNase)(2650Kunitz units/mL)和0.14％I型胶原酶(酶来自Sig-ma Chemical co.，st.LouisMo)的培养基混合，放入50mLo烧瓶中搅拌，并在的5％CO2环境中37℃温育90分钟。一部分细胞悬浮液用于cytospin玻片的制备，并经医学病理学家使用苏木精和曙红染色后检测以确诊，并测定肿瘤细胞数和活性。

    经过酶促分散至几乎单细胞悬浮液后，肿瘤细胞用尼龙筛过滤，在培养基中洗涤，悬浮于软琼脂糖并以大约20,000细胞每孔的比例加入到含有琼脂糖底层的24孔板中，细胞在存在或不存在A10的情况下在标准培养条件下保温5天，在细胞培养期最后48小时加入3H—胸苷，(Amersham，5mci每孔)。经过合适的标注期，组织培养板在60℃加热使琼脂糖熔化，细胞用微量采集器采集到玻璃纤维滤器上，并测定放射性。抑制百分比(PCI)应用公式：PCT＝1－(CPM处理组πCPM对照组)测定。对照组的增殖按回倍进行，而处理组的增殖按三倍量测定。

                          附录41.动物

    雌性无胸腺小鼠(BALB/c，nu/nu)，BALB/c小鼠，Wistar大鼠和Fisher344大鼠从Simonsen试验室(Gilroy，CA)获得。雌性A/J小鼠从Jackson试验室(Bar Harbor，ME)获得。DA大鼠从B&K Universal，Inc.(Fremont，CA)获得。无胸腺的R/Nu大鼠，DBA/2N小鼠和BALB/c鼠从Harlan Sprague Dawley(Indianapolis，IN)获得。雌性C57BL/6小鼠从Taconic(Germantown，NY)获得。所有动物在有α—dri床的分隔开的细小干净环境的小笼中，动物用无菌的磨碎食物和任意水喂养。2.皮下异种移植模型

    细胞系在适当的培养基中生长(参见附录1)使用0.05％胰蛋白—EDTA收集长满或近乎长满的细胞，并在450×g离心10分钟，将沉淀重新悬浮于无菌PBS或培养基(无FBS)中并达到特定浓度，将细胞植入小鼠的背侧(hind-flank)。经过3—6周用Venier测径器测量肿瘤生长。肿瘤的体积除非另外指定使用长×宽×高的积计算。P值使用Students′t—试验计算。将A10溶于50—100μl赋形剂(DM-SO，PBTE，PBTE6C：D5W，或PBTE：D5W)以不同浓度腹膜注射给药。3.大脑内异种移植模型

    对于小鼠IC模型，采集大鼠C6神经胶质瘤细胞并悬浮于无菌PBS中，浓度为2.5×107细胞/ml，将其放在冰上。按下述方法将细胞植入BALB/c，nn/nu小鼠：用动物剪毛器将小鼠额顶的头皮刮净，如果必要先用70％乙醇擦拭。将动物用异荧烷麻醉并将针通过头颅骨插入到大脑左半球。使用30gaugel/2英寸针配有只允许3mm穿透量(penetra-tion)套筒的Hamilton气密注射器将细胞注入(dispensed)。重复分配细胞使用精确的4μl细胞悬浮液给药。每天监测动物看它们是健康还是牺牲了。牺牲指它们失去约40％体重和/或显示出精神病症状。

    对于大鼠IC模型，将大鼠(Wistar，Sprague Dawley，Fisher344，或无胸腺R/Nu；约200g)用腹腔注射100mg/kg Ketaslt(酮胺(ketamine)盐酸化物：Aveco，Fort Dodge，Iowa)和5mg/kg Rompun(xylazine，2％溶液；Bayer，Ger-many)麻醉。在开始麻醉后，将头皮刮光，并将动物定位于定向性仪器上(Stoelting，Wood Dale，IL)。在头皮切口位置交替使用70％乙醇和10％聚乙烯吡咯烷酮—碘棉球擦拭。使用手术用无菌刀片在头皮上切—1.0～1.5cm中等长度的切口。将表皮轻轻分开并拨离到旁边使颅骨表面骨缝暴露。使用牙钻(Stoelting.Wood Dale，IL)在头颅骨约在前卤前叶1mm旁边2mm处钻一间洞(直径1—2mm)。将细胞悬浮液插吸到配有23或25ga标准斜面针头的50μL Hamilton注射器中，将注射器蛛网膜水平定位在洞中，降低到针尖深入脑结构3mm为止，将细胞悬浮液缓缓注入。细胞注射完毕，将针头留在钻洞中1—2分钟，使细胞注入完全。然后清洁颅骨2—3针将表皮缝合。观察从手术和麻醉状态恢复的动物。在整个实验过程中，每天至少观察两次与大脑内的肿瘤进展相关的症状的变化。动物显示晚期症状(倾斜，失去平衡，脱水，丧失食欲，丧失协调力，停止整理毛发，和/或明显的体重减轻)被人道地处死并切除所关注的组织和器官。4.腹膜内的模型

    如附录1描述，细胞系在适当的培养基中生长。采集细胞并在无菌PBS或无FBS培养基中洗涤，重新悬浮至适当浓度，注射入适当种的小鼠的腹膜腔中。优先植入7TD1细胞，C57BL/6小鼠通过腹腔注射0.5mL姥鲛烷接触抗原。将SKOV3T细胞植入无胸腺的且无姥鲛烷作为引发抗原的小鼠中。每天观察小鼠形成腹水的情况。当显示出重量达到40％或随腹腔肿瘤开始引起过度的压力和疼痛时，个别动物会死亡。5.免疫组织化学

    通过免疫组织化学方法使用高效特异的受体抗体，对丙酮—固定的，5μm冰冻组织切片，衍生于人，大鼠或鼠的肿瘤细胞的未处理的异种移植肿瘤，进行分析。简单地说，在使用初始抗体之前，先用10％一般山羊血清封闭非特异性结合位置。应用合适的抗体浓度以达到理想的灵敏度和特异性(兔抗人PDGF—b受体，1∶400和兔抗鼠F1k—1，5.5μg/ml)。将已知含有所研究蛋白质的组织切片作为阳性对照。合适的阴性对照是使用相同蛋白浓度和异型正常兔IgG和小鼠抗鸡IgG作为初始抗体使用。检测方法使用三步间接方法包括将初始抗体与生物素—标记的二级抗体(山羊抗兔IgG 1∶500)结合接着使用配合有辣根过氧化物酶的链霉素和霉。

    Chromagen/底物使用0.05％二氨基联苯胺/0.03％H2O2。组织切片用苏木精对染，使用升级乙醇脱水，用二甲苯代替品清洗，使用Permount进行盖片以便用显微镜观察测定。所有结果的强度用＋到＋＋＋系统表示。＋＝低，＋＋＝中等，＋＋＋＝高强度。特异染色反应可在(T)肿瘤细胞或(V)血管内皮细胞，或者两种细胞上观察到。

                       附录51.体外免疫测定

    在指定的时间，将动物处死，在无菌条件下取出脾脏并放入无菌培养基中，使用研磨方法在无菌冷冻的玻璃显微镜载玻片上将脾脏处理成为单细胞悬浮液。用一次洗涤除去组织碎片后，将脾细胞重新悬浮于低渗的氯化铵缓冲液中，以便使红细胞溶解。将淋巴细胞洗涤并重新悬浮于合适浓度的完全培养基中，培养基含有加了10％热灭活的FBS的RP-MI，2mM谷氨酰氨，50μm P—巯基乙醇，和青霉素—链霉素。按照下述可使用的方法进行鉴定淋巴细胞的反应。(Current Protocols in Immunology.Clign，J.E，Kruis-beek，A.M.，Margulies，D.H.，Shevach，E.M.，Strober，W.(eds.)John Wiley and Sons，Inc.，1992)。

    1.a.促丝裂素应答

    将T—细胞促丝裂素，ConA，和与T—细胞独立的B—细胞促丝裂素按指定浓度加入到96—孔圆底孔中。向孔中加入从正常动物，给赋形剂动物，给药动物得来的淋巴细胞达到终浓度为2.5×105/孔。培养通常按三倍量或四倍量进行。将板在37℃，湿润的含5％CO2环境下，按指定时间培养。从孔中小心移出上清液(约100μL)并在-80℃保存用于淋巴因子和免疫球蛋白的分析。为了测量淋巴细胞增生情况，向每孔中加入1μCi3H—胸苷，将板保温6小时。将培养物采集到玻璃纤维滤器上，使用液体闪烁计数器(Betaplat-e，Wallac)定量测量插入的(incorporated)放射性。

    1.b.混合淋巴细胞应答

    将从正常动物，给赋形剂动物，给药动物得来的淋巴细胞以2.5×105/孔的浓度涂布于圆底96—孔板中。加入相同浓度的刺激细胞，刺激细胞由测定前经50μg/ml自力霉素C处理30分钟的同系或同种淋巴细胞组成。将板培养3到4天，在此期间收集上清液并向其中加入用于促丝裂素测定的培养物。

    1.c.淋巴因子测定

    测定从促丝裂素和MLR培养物得来的上清液，使它们与含有IL—2和2L—6的物质反应，测定它们支持因子依赖的细胞系生长的能力。将HT—2细胞(104/孔，IL—2—依赖的)和7TD1细胞(2×103/孔，IL—6—依赖的)涂布于96—孔平底板，50μL/孔。加入上清液，50μL/孔，然后培养过夜(HT—2)或4天(7TD1)。细胞的增生使用在MTT中比色测定。(附录3.1)。

    1.d.免疫球蛋白ELISA

    平底96—孔EIA板用山羊抗鼠Ig抗体(SouthernBiotechonlogy)在4℃包被过夜。加入PBS＋1％BSA将板封闭。用PBS洗涤后，加入从鼠促丝裂素和MLR培养物得来的上清液，室温培养1小时。将板用PBS洗涤，然后加入HRP—标记的山羊抗小鼠Ig抗体，在室温培养1小时。将板洗涤并加入底物(ABTS)进行试验。

                          附录61.HPLC测定

    在用A10处理小鼠或大鼠一定时间后，用末端强心穿刺的方法将血收集到肝素化的试管中。制备血浆并在液氮中冷冻。切除组织和器官并立即用液氮冷冻。加入内标物后，将血浆样品用HCl酸化并用乙腈提取，乙腈层在真空离心机中加热蒸发至干，然后重新溶于甲醇。组织和器官样品按重量比1∶5(W∶V)在50mM Tris—HCl，pH7.4，使用组织匀浆器(Brinkmann Polytron Model PT3000)以20,000转/分进行匀化。加入内标后，匀浆用HCl酸化并用乙腈提取。乙腈层再用等量乙醚萃取。将乙醚层在真空离心机中加热蒸发至干，然后重新溶于甲醇。

    将用于HPLC分析的样品注入Hewlett Packard Hy-persil 5μm C18筒形柱(100×4.6mm)。以含有4mM三乙胺的甲醇∶35mM KH2PO4(pH4.5)55∶45作为流动相。流速为1.2ml/min.化合物使用Hewlett—Packard diode—array检测器(HP Model1090)在254nm监测吸收值。血浆和组织浓度由使用峰面积定量的标准曲线决定。血浆和组织匀浆来自无药大鼠，和加了已知量的A10和B11的大鼠，分别作它们的标准曲线。结果以内标的回收率校正。内标物使用5—甲基—吡唑—4—羧酸—(4—三氟甲基)—酰苯胺。

                               附录71.A10对于体重的影响

    无胸腺小鼠(BALB/c，nu/nu，雌性，4—5周大小)每天用A10腹腔给药。A10(20mg/kg/天)溶于100μL PBTE：D5W(1∶1V∶V)，共给药101天。赋形剂对照组动物每天腹腔给药100μL PBTE∶D5W(1∶1V∶V)，共给药101天，未处理对照组不接受任何处理，每组有8只动物。体重从第0天开始测量，(给药的前一天)并且两次/周直到实验结束。体重变化百分比按每次测量的平均重量与第0天的平均重量比值计算。2.LD50的测定

    一组含有5—10只无胸腺小鼠(BHLB/c，nu/nu，雌性)或BALB/c(雄性或雌性)小鼠，用A10的50μL PBTE，100μL PBTE，或50μL DMSO腹腔给药。在一次试验中，在单独使用A10腹腔给药前，先对一组5只BALB/c雌性小鼠每天使用DecadronR(注射用地塞米松磷酸钠，1.5mg/kg)腹腔给药，共7天。在另一附加实验中，在单独使用A10给药前，先对一组5只BALB/c雌性小鼠每天腹腔注射Di-lantinR(注射用苯妥英钠，20mg/kg)，共7天。所有动物在最后给药后观察7—14天。LD50从死亡百分率对相应剂量(logM)的曲线中计算出。

    实施例1：使用A10抑制PDGF—R自体磷酸化

    此实施例举例说明了A10在大鼠C6神经胶质瘤细胞中对PDGF—R的抑制能力。将大鼠C6神经胶质瘤细胞(5×105)悬浮于含5％FCS的MCDB105培养基中，并涂布于6—孔板，在37℃培养24小时。然后将细胞放入含1％FCS的培养基中再培养24小时。用50,100，或200mM的A10在37℃处理细胞1小时。细胞再用20mg/ml PDGF—BB在37℃处理10分钟。将细胞溶解于50mM Tris—HCl(pH7.4)含有2mM EDTA，10％甘油，1％NP—40，1mM原钒酸盐钠，10mM焦磷酸1mM PMSF，10mg/mL抑肽酶和10mg/ml亮肽素。

    使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白质。通过Western印迹试验使用抗磷酸酪氨酸抗体证明蛋白中含有磷酸化了的酪氨酸。酪氨酸磷酸化的水平通过是量结合抗—磷酸酪氨酸的量来测定。使用分子动态计算光密度计(300S型)和Image Quant V3.0软件(分子动态学的)得出峰面积积分计算定量。数据以相对峰强度表示。(磷酸化受体除以磷酸化了的酪氨酸总量)。

    PDGF—BB刺激PDGF R的自体磷酸化，而A10抑制这种刺激。增加A10的浓度能导致PDGF刺激的受体磷酸化的减小。当A10的浓度达到200mM时，PDGF—R磷酸化的程度可减少到低于无PDGF—BB刺激的水平。

    实施例2：使用A10对PDGF—R自体磷酸化的选择性抑制

    A10抑制人体T98G成胶质细胞瘤细胞中PDGF—R培养自体磷酸化，而对EGF受体的自体磷酸化几乎无影响，将T 98G细胞植入含有2％FBS的MCDB105培养基中37℃24小时，将培养基吸出用MCDB105代替，细胞用200，500或100mM A10处理1小时。细胞在有无配体存在下以不同浓度A10处理。(0,200,500和1000mM)。细胞再用配体处理10分钟(20ng/ml，PDGF—BB或50ng/ml EGF)。将细胞溶解，受体磷酸化水平按实施例1描述的定量测定。A10能抑制通过PDGF的PDGF—R自体磷酸化，但对于EGF刺激的EGF—R自体磷酸化能力几乎没有任何影响。

    实施例3：使用不同化合物对PDGF—R的抑制作用

    这个实施例举例说明了不同化合物抑制PDGF—刺激的受体磷酸化的能力。将U1242MG细胞接种到96—孔板中，浓度为5×106细胞/孔，所用培养基为含0.5％FBS培养基。将细胞培养24小时。细胞用特定化合物处理2小时，接着加入100ng/ml PDGF—BB并培养10分钟。

    在0.2M Hepes，0.15M NaCl，10％V/V甘油，0.04％Triton X—100，5mM EDTA，5mM钒酸钠，和2mM焦磷酸钠中将细胞裂解。将细胞裂解物加入到被抗—PDGF受体抗体(Genzyme)包被的ELISA板中。在加入细胞裂解物之前先将ELISA板使0.5mg抗体/孔在150ml PBS中，4℃包被18小时。

    细胞裂解物在包被的板中培养1小时，然后在TBST(35mM Tris—HCl pH7.0，0.15M NaCl，0.1％Triton X—100)中洗涤4次。加入抗—磷酸酪氨酸抗体(100ml在PBS中)，将混合物在室温培养30分钟。将孔在TBST中洗涤4次，向每孔中加入接合到POD(TAGO)的次级抗体，将孔在室温培养30分钟，将孔再在TBST中洗涤4次，向每孔加入ABTS/H2O2溶液并将其培养2分钟。在410nm测定吸收度。

    每种药的毒性也被测定。将细胞装板如上所述，接着与药物一起培养，使用如Mossman J.Immunol.Methods 65：55—63(1983)中描述的MTT测定法测定细胞存活数；或者测定LDH的释放量。(Korzeniewski and Callewaert，J.Im-munol.Methods 64：313(1983)；Decker and Lohmann—Matthes，J.Immunol.Methods 115：61(1988)。

    结果如表IX所示。IC50值，(即，达到50％抑制时所需的浓度)应用ELISA筛选测定法来测定。LD50值(即，导致50％中毒的剂量)应用MTT或LDH评估测定。

    在U1242细胞中，抑制PDGF—刺激的受体磷酸化IC50值范围为0.4～＞500mM。如表IX中所列大多数化合物测试了抑制PDGF—刺激的受体磷酸化作用。如较高的ID50所示，抑制受体磷酸化不是因为对细胞活性的非特异性作用造成的，因此，这些药是很好的候选药，因为化合物能通过抑制PDGF—受体的活性来治疗细胞增生性疾病。G13和G14的IC50值最低，但他们的LD50小于A10。一般的，优选的化合物是那些具有较高治疗指数(LD50/IC50)，的化合物，治疗指数用于表示安全系数。

                                                     表IX

     化合物    ELISA        细胞毒性 P—TYR U1242   IC50(mM)LDH U1242 LD50(mM)MTT U1242 LD50(mM) A10    65    ＞500   700 B10    180 B12    100    ＞500   ＞1351 B13    180 B14    180 B15    120   200 B16    35   50 B17    125    ＞1000   ＞500 B18    160 B19    100 C10    25   ＞500 C11    70    ＞500   ＞500 D11    8    ＞441   90 D12    60    ＞386   ＞390 D13    30    ＞500   ＞500 D14    20    ＞100   ＞500 D15    20    400   80 D16    50    ＞168   ＞167 D17    ＞100 E10    45 E11    90 E12    180化合物    ELISA    细胞毒性 P—TYR U1242   IC50(mM)LDH U1242 LD50(mM)MTT U1242 LD50(mM) E13    ＞100 E14    100 E15    5   ＞100 E16    125 F10    45 F11    100 F12    70 G10    10    ＞485   ＞490 G11    15    90   145 G12    10    ＞333   ＞333 G13    0.4    ＞100   100 G14    0.8    ＞100   ＞500 G15    100 G16    35   ＞100 G17    100 G18    10    ＞100 G19    90 G20    ＞100 G21    6    ＞100 G22    1    ＞100 H12    30 I10    90    ＞317   ＞320

    实施例4：A10抑制PDGF—刺激的DNA合成和细胞周期过程    

    这个实施例举例说明了A10抑制PDGF—BB刺激的NDA合成和细胞周期过程。A10在T98G细胞中对DNA合成的影响在有无PDGF—BB存在时通过测量插入DNA的3H—胸苷来测定。在细胞周期中中期细胞的百分数通过下述细胞计量术测定。

    细胞如上述附录中描述的培养。测定条件基本上描述于Pollack等人，J.Neurosurg.73：106—112(1990)，并有些改进。细胞(大鼠C6或人T89G)在对数生长期移入96—孔板，浓度为2×104在含有2％FBS的200ml MCDB105培养基中。经过过夜贴附期后，将培养基换为无血浆测定培养基(MCDB105和5mg/ml胰岛素)并将细胞培养18—24小时。

    DNA合成的研究从只加入50ng/ml的PDGF—BB或与不同浓度A10培养开始。基础3H—胸苷插入的影响在无PDGF时测定。将板在37℃培养约18小时。将3H—胸苷(Amersham，5ci/mmol)加入到每孔以达到最后浓度为5mci/ml，将板重新放回37℃培育箱，4小时后除去培养基，并将板放在冰上。每孔用冰冷却的PBS洗涤两次。用100ml冰冷却的TCA沉淀10分钟，将插入放射性物质的DNA与未插入3H—胸苷的DNA分开。用冰冷却的TCA洗涤两次，将沉淀溶解(1％SDS的100ml 20mM Tris—base)并移入液体闪光计数器。加入6ml合剂(Ready safe，Beckman)并在LS6000 SC型Beckman液体闪光计数器进行放射性定量。

    在两种细胞中A10都能减少PDGF—剌激的DNA合成，但在人T89G成胶质细胞瘤细胞中比大鼠C6神经胶质瘤细胞中影响大。为了证实结果，检测A10对PDGF—剌激的进入细胞周期S期的影响，NIH3T3细胞设定过度表达人PDGF—b受体被抑制生长(血浆—饥饿)，接着在有或无A10存在下用PDGF配体处理。用下述细胞计量法分析细胞DNA含量。分析结果总结于图3中。PDGF处理导致细胞在S期的停留显著增加(62％)相对于未用PDGF处理的细胞(11％)。但是，用A10处理的细胞显示出剂量—依赖的由PDGF引起的进入细胞周期S期的细胞数的减少。显示出A10能阻碍PDGF—刺激的有丝分裂。

    在相似的实验中，在过表达人EGF受体的NIH3T 3细胞中，A10的浓度为100mM时不能抑制EGF—刺激的有丝分裂。与前述实验结果相比，这个结果证明A10对PDGF—传递的信号有选择性。

    实施例5：抑制不同受体激酶的活性

    对不同化合物对抑制不同受体酪氨酸激酶的能力进行了试验。试验结果列在表X中。                                         表X

      化合物    PDGFR IC50(μM)    EGFR IC50(μM)    HER2 IC50(μM)   FLK—1 IC50(μM)    G14    0.8(W)     NT     NT   ＞30(W)    G25     0.9    ＞50    ＞50    ＞50    J10    1(W)    ＞100    ＞100     NT    P13     1.1    ＞50    ＞50    ＞50    G13     1.5     NT    ＞50    ＞10(W)    P10    3(W)     31    ＞100     NT    J11      3    ＞100    ＞50    ＞25    F10    5(W)     NT     NT    ＞50    G24      5    ＞100    ＞50     9.3    D11    8(W)     NT     NT    ＞50    G10    10(W)     NT     NT    ＞50    G12    10(W)     NT     NT    ＞50    G18    10(W)    550(W)     NT     NT    E14    10(W)     NT     NT    ＞50    G22     14    ＞100    ＞50     4.4    D20     14    ＞50    ＞50    ＞50    C13     16     16     29     3.3    D15    19(W)     NT     NT    ＞50    G11    20(W)     NT     NT     NT    G29    23    ＜0.8     34     10    C10    25(W)     NT     NT     NT    G23    25(W)    ＞100    ＞100    325.2    H10    25(W)     NT     NT    ＞50    H12    25(W)     NT     NT     NT    P12    25(W)     NT    ＜50    ＞50    P14     26    ＞50     10    ＞200    D13    30(W)     NT     NT    ＞50    P25    30(W)    ＞100    ＞100    ＞500    G30     32    ＞100     34     10    D18     34    ＞50    ＞50    ＞50    P15     46    ＞100    ＞50    ＞50    D14     47    ＞100    ＞50    ＞50    G27     48    ＞100    ＞50    ＞50

    实施例6：体外效果

    A10作为直接生长抑制剂对于肿瘤细胞系，和病人身上分离出的原发性肿瘤的效果被测定。经过附录3中描述的过程4天后，定量细胞密度并将细胞暴露于一定范围的药物浓中测定A10对于肿瘤细胞系的作用。表XI提供了对不同细胞系的测试结果。

    表XI A10对不同肿瘤类型的生长的效应

        肿瘤类型     细胞系    IC50(μM)    神经胶质瘤     SF763T       0.8     SF767T        3     U1242        19     A172        32     T98G        62     U87MG        78     SF767        87     SF763       110    U373MG       115    U118MG       150     U1240       250    U138MG     ＞400    卵巢瘤     SKOV3T       40     PA—1       40     SKOV3     ＞100    Ovcar3     ＞100     乳腺     BT474     ＞100   MCF7/HER2       116   MDA MB 468       150      T47D       195   MDA MB 361       200      MCF7       288    ZR75—30       300    ZR75—1       355     HBL100     ＞400     BT549     ＞400     SKBR3     ＞400       肺    CALu—6       70      A549       118    Calu—3     ＞400    尿道旁腺      PC3       46     DU145     ＞100    黑素瘤      A375       25    C81—61       40     结肠   Colo 320 DM       34   表皮样瘤      A431       34    白血病      K562       26

    A10的IC50值范围从0.8μM到＞400μM。

    A10在体外对于原发性肿瘤的作用通过从六个病人身上得到的多形性恶性胶质瘤(GBM)和六个卵巢癌病人进行测试。样本从新诊断的事先未经治疗的病人身上得到，如实施例13附录3描述的进行评估。

    在两种类型的细胞中都进行了用A10抑制肿瘤生长和PDGF—R表达的正向关系的测定。增加A10的浓度(从0到40mM)，两种类型的肿瘤生长都下降。在两种类型的和不同的肿瘤细胞中，生长抑制都是剂量—依赖性的。对GBM肿瘤IC50值范围为35μM～198μM，而对卵巢肿瘤的IC50值范围为20mM～140mM。实施例7    A10与B11的体内药效研究

    本实施例概括了几个说明A10在体内对不同肿瘤生长的抑制力的实验。第一系列实验的目的是观察不同制剂和给药方式的结果。第二系列实验的目的是观察A10对不同肿瘤的各种不同效果。不同制剂和给药方式

    如前“细胞生长”所述，C6细胞和SKOV—3(T)细胞在培养基中生长，并在实验的当天，将100mlPBS中含的3×106个细胞(用于C6实验)或1×107个细胞(用于SKOV—3实验)植入雌性Balb/c nu/nu小鼠的后肋中。将U87MG、U118MG、U373MG人恶性胶质瘤细胞(从ATCC获得)也植入无胸腺小鼠中。若无其它说明，植入了肿瘤的小鼠与未移植的小鼠在开始的第一天通过腹腔注射入剂量为用50ml的DMSO，100mlPBTE：D5W或100mlPBTE配制的A10或B11液。肿瘤用Venier测径器测量，肿瘤的体积通过其长、宽、高的积来计算。

    在一组实验中，小鼠被植入A431。大鼠C6神经胶质瘤细胞，SKOV—3(T)卵巢癌细胞，并以每天每公斤体重15毫克(15mg/kg/day)A10(DMSO)处理。在未给药及DMSO对照组中，肿瘤是按对数规律生长的。相反，在A10给药组，移植了大鼠C6神经胶质瘤细胞或SKOV—3(T)卵巢癌细胞的小鼠体内的肿瘤生长则极微弱(即在给药20天后，相对于对照组、肿瘤生长抑制率＞90％)。但A10对A431肿瘤的生长几乎无影响(即＜25％)。用15mg/kg/日的B11(DMSO)和15mg/kg/日的A10(DMSO)给药，两者对移植了大鼠C6神经胶质瘤细胞的小鼠肿瘤生长的抑制程度是相同的。

    在另一组实验中，用A10对移植C6神经胶质瘤细胞的小鼠给药，表XII概括了在不同给药方式下A10对无胸腺小鼠中大鼠C6神经胶质瘤细胞的抑制能力。抑制百分率指的是用A10给药动物的肿瘤体积除以赋形剂对照组动物的肿瘤体积。不同给药方式所得的抑制率从51％到大于95％。                              表XI

                      A10给药方式研究         剂量    方式    ％抑制数  20mg/kg(PBTE：D5W)    每日    ＞95％  20mg/kg(PBTE：D5W)    每2日     77％     20mg/kg(DMSO)    每4日     60％     30mg/kg(DMSO)    每2日     91％     30mg/kg(DMSO)    每3日     87％     40mg/kg(PBTE)    每2日    ＞95％     60mg/kg(PBTE)    每周     51％    100mg/kg(PBTE)    每周     63％

    在另一组实验中，在C6神经胶质瘤细胞上测定A10的不同给药方式的影响。从移植后的第一天开始，A10是用不同剂量不同给药方式通过腹腔注射给药的。A10对动物的总给药量用于抑制百分率的比较。这些研究表明：在总剂量相等的情况下，高剂量低频率的给药方式与低剂量每日给药所产生的抗肿瘤药效相等。例如，将A10用20mg/kg每日，40mg/kg每二日或80mg/kg每四日的方式给药，均可获得95％的肿瘤生长抑制率，实验用鼠是在后肋被皮下(SC)植入C6细胞(3×106个细胞)的BALB/c，nu/nu鼠。

    另一组实验测定了不同剂量的A10对恶性胶质瘤的作用。表XIII的数据说明A10在体内对恶性胶质瘤细胞的抑制能力。生长抑制率是指给药动物的肿瘤体积与未给药动物的肿瘤体积之比。                           表XIII

         细胞系    剂量(mg/kg)   ％抑制率      U87         5      52        10      58        15      66        20      92     U118        15      57     U373        15      54    SF763T        20      89    SF767T        20      70

    表XIV比较了不同A10制剂的体内(植入C6细胞的小鼠)药效。PBTE、PBTE：D5W和DMSO制剂具有相等的体内肿瘤生长抑制率。

                                                       表XIV

                       对制剂的效力       剂量    制剂    抑制率％    15mg/kg/日    DMSO    90％    20mg/kg/日    DMSO    95％    15mg/kg/日    PBTE    92％    20mg/kg/日    PBTE   ＞95％    40mg/kg/2日    PBTE   ＞95％    20mg/kg/日  PBTE：D5W   ＞95％

    表XV(实验用小鼠植入了C6细胞)是A10用DMSOPBTE或PBTE：D5W制剂对动物死亡率的影响，可以看出PBTE：D5W制剂与DMSO和PBTE制剂相比，具有非常显著的低死亡率。                                  表XV

                              A10对死亡率的影响           剂量    给药   死亡率    n    20mg/kg/日(DMSO)    21    54％  20mg/kg/日(PBTE：D5M)  27—100    80％  25mg/kg/日(PBTE：D5M)    67     0％    8  20mg/kg/日(PBTE：D5M)  20—48     8％    12    30mg/kg/日(PBTE)    48    50％    4    40mg/kg/日(PBTE)    48    75％    4

    A10对不同类型肿瘤的抑制

    该组实验比较了A10对不同类型肿瘤的生长抑制力。在其中的一组实验中，用附录中所述的方法测定了A10对用SC异种移植建立的卵巢癌、黑素瘤、前列腺癌、肺癌、和乳腺癌细胞系的抑制能力。第二组实验也用前面附录中描述的方法测定了A10对人工模型(synthetic model)中鼠白血病细胞系生长的影响。

    表XVI概括了用SC异种移植的研究结果。在12到20mg/kg/天的剂量范围内，A10能有效地抑制神经胶质瘤、SKOV3T(人卵巢)、PA—1(人卵巢)、A375(人黑素瘤)、PC—3(人前列腺)、Calu—6(人肺)、和D1B及L1210(鼠白血病)细胞的生长。然而，A10却不能有效地抑制异种移植的A549(人肺)、MCF7(人乳腺)和A431(人表皮)异种移植细胞的生长。

                                                      表XVI                                               A10对肿瘤生长的影响

      肿瘤类型  细胞系    种    剂量  mg/kg/日  抑制率％   (天)**      P＜      *** 神经胶质瘤    C6*    nu/nu     20  ＞95(21)    0.00001    C6*    nu/nu     20   84(18)    0.00001    9L*    nu/nu     20   83(20)    0.00001   U87MG    nu/nu     15   75(28)    0.0092   U118T    nu/nu     15   57(47)    0.0027  U373Mg    nu/nu     15   54(37)    0.0477  SF763T    nu/nu     20   85(22)    0.00001  SF767T    nu/nu     20   70(22)    0.00001   卵巢癌  SKOV3T    nu/nu     15   94(21)    0.0014  PA—1    nu/nu     20   53(36)     0.04   黑素瘤   A375    nu/nu     20   53(31)     0.03   A375    SCID     15   35(31)    0.002  前列腺癌  PC—3    nu/nu     20   71(45)     0.01  PC—3    SCID￡     12   47(36)    0.001    肺癌  Calu—6    nu/nu     20   64(28)    0.0001   A549    SCIDπ     15   19(48)      NS   白血病   DLB*    DBA/2     20   95(22)    0.00001  L1210*    DBA/2     20   75(18)     0.04  表皮样瘤   A431    nu/nu     15   40(15)      NS   乳腺癌   MCF7    SCID     15    8(27)      NS

    表XVI.肿瘤细胞是SC移植入指定种的小鼠体内。从移植后的第一天开始每日给赋形剂或A10，但有以下例外：＋＝第4天，＝第9天，￡＝第15天，π＝第29天、∫＝第8天。*D1B和L1210是鼠肿瘤细胞系，C6和9L是大鼠(rat)肿瘤细胞系；其它的均是人肿瘤细胞系。**肿瘤生长抑制率数据是在指定的那一天与赋形剂对照组比较而得的；除D1B和L1210每组小鼠的数量为4(n＝4)外，其余n＝8到10小鼠/组。***P值是用T实验计算的。NS＝不显著。

    在第二组实验中发现，A10可以显著地提高腹腔注射异种移植了SKOV3T的动物及同系植了7DT1的小鼠的存活率。在一个实验中，将SKOV37细胞(2×106个细胞)通过腹腔注射移入BALB/c，nu/nu小鼠体内。从移植后第一天开始将A10溶于50μL DMSO以15mg/kg/日的剂量给药21天并监测小鼠的存活率(每给药组与对照组的动物数均为8)。所有对照组动物均在27天后死亡，而给A10组的动物则在28天后仅一只死亡且32天后的有40％的给药组动物存活。

    在另一实验中，以15mg/kg/日的A10对腹腔注射移入37TD1(B—细胞杂交)细胞的同源免疫活性C57BL/6小鼠给药30天(每给药组与对照组动物数均为8)，在移植后的第一天，将15mg/kg/日的A10制成的50μlDMSO溶液给药30天。第30天停药，存活的小鼠再观察50天。对照组的所有动物在第9天便全部死亡，而给药组中8个动物中有3只活过了80天。实施例8：具有不良血小板源生长因子受体活性特征的靶向癌

    本实施例说明A10对具有不良血小板源生长因子受体活性特征的靶向癌的抑制能力。而A10对无血小板源生长因子受体活性特征的癌有微弱作用或无作用。PDGF(血小板源生长因子)受体的表达用Westen印迹法定性地测定。用SRB测定法评定细胞的生长，即用硫氰酸胺—B(sul-forhodamine—B)测定总细胞蛋白质(Skehan，T et al.，J.Natl.Cancer Inst.82：1107—1112(1990))。软琼脂测定法(SAA)是通过在琼脂碱基层上的半固体琼脂培养基上的菌落群上接种细胞，2到3周后，用自动Omincon 38007M肿瘤菌落计数器定量地测定菌落的大小和数量。SRB和SAA值用IC50值表示，单位为mM。测定异种移植的无胸腺小鼠的体内抑制率，结果见表XVII。

                                               表XVII

                             受体表达与生长抑制的关系    细胞系 PDGF—受体    表达    SRB    SAA    体内      C6    ＋＋   0.3    0.4   95％     SF767     -   100    ND   18％    SF767T    ＋＋    3  0.5—2   70％     SF763     -  ＞100    ND   35％    SF763T    ＋＋    ND    ND   89％    SKOV—3     -  ＞100    6.3    ND   SKOV—3T    ＋＋    50    0.3   95％

    从表XVII可看出，在PDGF—R高水平表达时，对细胞的生长抑制率最高，说明该受体活性与肿瘤细胞的增生有明显的关系。实施例9：A10对移植后的体内抑制

    本实施例描述了A10对小鼠移植肿瘤细胞多天以后再给药时的作用。在一个实验中，SCID鼠在移植入PC—3前列腺细胞系15天后再用A10给药。每周的给药方式为：5天以12mg/kg/日用A10(PBTE：D5W)给药，2天不给药。对小鼠给药3周。在另一实验中，移植了375黑素瘤细胞的实验鼠除在移植后第9天开始以15mg/kg/日的用A10给药外，还用同样方法移植了PC—3。

    上述两种肿瘤的生长均受到了A10的抑制。PC—3肿瘤的生长在3周后有50％被抑制，A375在3周后则有40％被抑制。因此，该实施例通过A10对治疗前生长在宿主体内的肿瘤的抑制能力进一步说明A10对肿瘤生长抑制的有效性(参见实施例7，在移植后的第一天开始给药)实施例10：A10对大脑中肿瘤生长的作用

    通过一系列的实验测定了A10对脑肿瘤模型中肿瘤的生长的作用。

    在两个分别实验中将经A10给药后的无胸腺小鼠再IC(intracerebral)移植C6细胞，用A10给药的动物的平均存活时间显著地高于对照组。实验结果见图4。

    在另一实施中，无胸腺小鼠在经A10给药后，接着脑内移植(IC)U87MG细胞，给药组动物的平均存活时间为65天，而对照组为60天，增长并不显著(P＝0.15)    

    A10的药效也用无胞腺鼠的IC模型进行测定，如图5所示，A10对IC脑移植C6癌细胞的无胸腺小鼠的存活有很弱而非显著的正影响。实施例11：免疫学研究

    测定了A10对几个正常免疫功能参数的影响，这些参数包括淋巴细胞的增生、细胞毒效应器细胞的增生、淋巴因子产物、免疫球蛋白的分泌。这些研究包括大鼠和小鼠的A10体内给药，接着进行体外免疫功能分析。免疫学研究所用的方法在附录5中有详细的描述。A10对正常小鼠免疫功能的体内作用

    对首次用来作试验的BALB/c鼠以15mg/kg/日的剂量用A10或赋形剂(PBTE：D5W)给药7天和21天。如附录5描述的那样，将动物处死并将其脾细胞离体测其对ConA(一种T细胞有丝分裂原)，LPS(一种非依赖B细胞的T细胞有丝分裂原)，LPS(一种非依赖B细胞的T细胞有丝分裂原)和同源抗原(C3H/HeJ脾细胞)的反应。48小时(有丝分裂原)或72小时(同种抗源)后测定IL—2，IL—6，Ig的含量和细胞的增生。实验结果概括在表XVIII中。

                           表XVIIIA10对初次作试验小鼠正常免疫功能的影响

       刺激物   IL—2产物  IL—6产物Ig产物    9H—  胸苷的摄入  d7  d21  d7  d21  d7  d21  d7  d21    ConA   0   0  ＋＋   0   0   0   0   0    LPS   0   0   0   0  ＋ ＋/－   0   0    Allo   0   0   0   0   0   0   0   0

    表XVIII。雌性BALB/c小鼠用A10给药7或21天。将脾细胞离体并用丝分裂原及同种抗原进行刺激。测定细胞的增生、细胞因子产物、Ig产物，该方法已在附录5中描述。上述结果是将药处理动物与赋形剂(PBTE：D5W)处理动物比较而得的。0＝无变化；＋/－＝在某些动物中有微弱增加；+＝在所有动物中有中等强度的增加；＋＋＝在所有动物中有明显增加。

    由A10影响产生的两个参数：ConA诱导的IL—6产物在第7天，用A10给药组高于对照组，而在第21天，这种差别并不明显。LPS诱导的Ig产物在第7天，用A10给药组略高于对照组，而在第21天，这种差异在4分之3的给药组动物中并不明显。这些数据表明：A10对脾细胞IL—6产物和Ig产物的影响甚至在用A10连续给药时也只是短时的。A10在体内对小鼠初次免疫接种期免疫功能的影响

    测定A10对动物对活初次免疫接种的反应的影响。BAIB/c小鼠SC免疫接种50μg完全悬浮于弗氏佐剂中的(CFA)钥孔戚血兰素(KLH)；对照组小鼠模型免疫接种(mock—immunized)PBS缓冲液与CFA制成的乳剂。在开始的第一天，将小鼠分成三组：未给药、仅给赋形剂(PBTE：D5W)及20mg/kg/日的A10。第14天将所有小鼠处死，测定其脾细胞。此外，还要用附录5所述的方法测定其对KLH和破伤风类素的免疫反应。

    正如表XIX概括的那样，脾细胞激活因子产物(IL—2和IL—6)受单独的赋形剂或药物的影响并不显著。而且，A10对体外再次用免疫抗原(KLM)刺激的脾细胞的增生的抑制也是极微弱的(表XIX)。A10对用LPS或同种(异体)细胞刺激的脾细胞的作用也与上述作用相似(表XIX)。

                                 表XIX               A10对小鼠正常免疫功能对初级免疫的反应的影响

       刺激物IL—2产物  IL—6产物 Ig产物    9H— 胸苷的摄入    KLH    0      0    0     -    ConA    0      0    0     0    LPS    0      0    0     -    Allo    0      0    0     -

    表XIX。BALB/c小鼠免疫接种KLH，然后分成三个处理组；接种后的第1天开始给药，一直到免疫后第14天。空白组、赋形剂对照组或A10给药组与无免疫对照(正常)鼠的脾细胞均用指定的细胞有丝分裂剂或同种抗原培养。用附录5描述的方法测定细胞的增生、细胞因子产物和免疫球蛋白产物。所示结果为给药组动物与赋形剂对照组(PBTE：D5W)反应的比较。0＝无变化；－＝在所有动物中有微弱下降。A10在给药体内对带肿瘤鼠免疫功能的影响

    BALB/c小鼠在第0天SC接种同源WEHI—164.13纤维肉瘤细胞。在第1天，将鼠分成3个处理组：未给药组，每日仅给赋形剂(PBTE：D5W)，或每日给20mg/kg/日的A10。第17天，将动物处死并分离出脾细胞。体外测定脾细胞对同种抗原和细胞有丝分裂剂的反应。A10并不影响用同种抗原和细胞有丝分裂剂刺激的脾细胞的增生、细胞因子的分泌或Ig的分泌，结果概括于表XX。

    还测定脾细胞中在混合淋巴癌细胞培养(MCTC)中的WEHI—164.13特异细胞毒T淋巴细胞(CTL)的生成。未给药的带肿瘤动物的脾细胞具有强烈的CTL应答(44％特异分解为E∶T＝50∶1)，这种应答在仅给赋形剂处理的动物中几乎完全受到抑制(13％特异分解)。赋形剂中含～15％的乙醇。而乙醇是公知的能对CTL的增生和活性产生影响的。(Walia，et al.，Proc.Soc.EXp.Biol.Med.，192：177—200，1989)

    相对于赋形剂处理组而言，A10处理增强了CTL应答(78％特异分解)；A10给药鼠的脾细胞CTL应答同样高于空白对照组。因此，很明显在免疫活性鼠模型上，A10克服了赋形剂在CTL产生中的抑制作用。

                                表XX             A10对具原发肿瘤小鼠的正常免疫功能的影响

        刺激物IL—2产物IL—6产物Ig产物CTL活性    Tumor    0    0    0    ++    ConA    0    0    0    NT    LPS    0    0    0    NT    Allo    0    0    0    NT表XX。带肿瘤鼠在移植后分别以赋形剂、A10给药或不给药17天。处死鼠并用指定的细胞有丝分裂剂、同种抗原培养或用丝裂霉素C处理WEHI—164.13肿瘤细胞。用附录5所述方法测定细胞的增生、细胞激活因子产物、免疫球蛋白产物和CTL活性。所示结果是给药组动物与赋形剂对照组(PBTE：D5W)反应的比较。0＝无变化；＋＋＝在所有动物中有显著增长；NT＝未测定。A10给药在体内对大鼠免疫功能的作用

    Wistar大鼠在第0天SC接种C6细胞。在开始的第1天并以后每日，经IP以8.4mg/kg/日的赋形剂(PBTE：D5W)或A10(相当于给小鼠20mg/kg/日的A10)给药。对照组在肿瘤移植后不给药。第21天处死动物并分离出脾细胞做体外分析。与鼠(murine)的研究一样，脾细胞用ConA、LPS、及同种抗原(DA大鼠脾细胞)刺激。

    在所测定的参数中，A10处理似乎仅影响同源混合淋巴细胞应答(MLC)的细胞增生，结果概括于表XXI中。未给药组、赋形剂处理组或带肿瘤动物的同源MLR远高于无肿瘤动物。这种增生应答在4个经A10处理的带肿瘤动物之一中减少到与无肿瘤对照组相似。同种抗原应答并不减弱。

    同时也测定Wistar大鼠脾细胞中MLTC的特异性C6CTC的产生，结果概括在表XXI中。带肿瘤、未处理的动物的脾细胞产生一个强烈的CTL应答(35％特异分解，E∶7＝100∶1)，而无肿瘤对照大鼠的脾细胞则产生微弱的反应(13％特异分解E∶T＝100∶1)。与BALB/c小鼠的研究相似，在7天的培养中，赋形剂抑制CTL的产生。而与鼠(murine)研究相反，A10并不克服赋形剂对免疫活性大鼠的抑制作用。

                                      表XXI          A10对具原发肿瘤的大鼠正常免疫功能的影响

        刺激物IL—2产物IL—6产物 3H胸苷摄入CTL活性    Tumor    0    0     0    0    ConA    0    0     0    NT    LPS    0    0     0    NT    Syn    0    0   ＋/－    NT    Allo    0    0     0    NT表XXI。Wistar大鼠SC接种C6细胞，然后每日以赋形剂或A10给药；研究包括带肿瘤未给药动物和正常无肿瘤动物。在第21天，处死动物并用指定的细胞有丝分裂剂(ConA，LPS)，同源(Syn)或同种抗原(AllO)刺激脾细胞；或用丝裂霉素C处理治疗C6肿瘤细胞。用附录5的方法测定细胞的增生、细胞因子产物和CTC活性。所示结果是给药组动物与赋形剂(PBTE：D5W)对照组动物的比较。0＝无变化；＋/－＝给药组动物与正常(无肿瘤、未给药)动物的检测水平相比有所降低；NT＝未检测。

    这些免疫学研究结果表明：A10在体内或体外对免疫活性或免疫缺损的啮齿动物的正常免疫应答并不产生相反的作用。而且，A10在抗同源免疫活性宿主中鼠肿瘤细胞系的试验中的药效表明A10并不削弱抗肿瘤免疫力。实施例12：A10的药理学研究

    研究了A10在小鼠和大鼠中的几个药理学特性，包括在血浆和脑组织中的代谢和半衰期。A10药理学研究中所用方法的详细描述见附录6。此外，还用大鼠和猴子研究了与正常细胞毒研究相关的A10的药物动力学参数。A10的代谢

    A10异恶唑环经一个分子内重排形成2—氰基—3—羟基—N—[4—(三氟甲基)苯基]—2—丁烯酰胺(B11)。在人或大鼠离体鲜肝素化血浆中观察A10到B11的代谢。A10到B11的转化用附录6中描述的反相HPLC监测。25℃(室温)时，A10在人血浆中经21小时完全转化成B11。在37℃培养，用鼠血浆做类似的试验，经2小时培养，A10就全部转化成B11。在人或大鼠热无活性血浆(60℃，15mim)中，A10并不转为B11。此外，用鲜人血浆同时培养B11与A10，并监测其浓度。21小时后测试，仅有B11而无A10。

    代谢产物B11在体外生长测定与对PDGF—刺激的DNA合成与PDGF刺激的细胞周期进程的抑制均等效于A10。B11在体内对C6肿瘤细胞生长的抑制力也等于A10。这些数据提示B11是A10的活性代谢产物。使用A10治疗细胞增生失调优于B11，因其更适宜制成静脉注射用溶液。A10与B11的体内药动学

    在给大、小鼠腹腔注射A10后观察A10与其代谢产物(B11的体内药动学。无胸腺鼠(BALB/c，nu/nu，雌性)以A10(120mg/m2，40mg/kg)给药，3小时后转化为B11，此时，全身内吸循环母体化合物的浓度低于检测极限。48小时后在血浆中检测B11，且t1/2为16小时TmaX为3小时。B11的浓度时间曲线(AUC)下的面积计算值为2773μg.h/mL.清除率(CL)为0.29mL/hr，假设生物利用度为100％，平均给药时间为0。计算的分布容积(VD)为6.7mL。在鼠脑中，B11的t1/2为14hr，Tmax为3hr。

                                    表XXI            A10与B11在小鼠和大鼠腹腔注射给药后的药物动力学

                   无胸腺小鼠    小鼠    大鼠  40mg/kg 120mg/m2    单剂  75mg/kg  225mg/m2     单剂   75mg/kg  225mg/m2  1/周×4   40mg/kg  120mg/m2    单剂   80mg/kg  560mg/m2    单剂     血浆    t1/2(hr)  B11     16    15.5    16.9    14.9      6  A10   ＜1.5    ＜1    ＜1     ND     ＜2   Tmax(hr)  B11     3     3     3     3      6  A10   ＜0.5     ND     ND     ND     ＜2      Cmax  B11   111±14  249±26   190+12   208±34     260  A10     ND     ND     ND     ND     5.0      AUC (μg.hr/mL)    2773    5660    5012    4444    6417   CL(mL/hr)    0.29    0.27    0.30    0.18    0.26    VD(mL)     6.7    6.4    8.2    3.1     5.3    Brain    t1/2(hr)  B11     14     NT     NT     2      6  A10   ＜1.5     NT     NT    ＜1     20    Tmax(hr)  B11     3     NT     NT     1      6  A10    1.0     NT     NT    1.0      7表XXII。如所述，给雌性无胸腺小鼠(BALB/c，nu/nu，每组4个)腹腔注射A10。BALB/c鼠雌性，每组4个)腹腔注射120mg/m2(40mg/kg)的A10。Wistar大鼠(雌性，每取样点1个)腹腔注射560mg/m2(80mg/kg)A10。制备好血浆与脑样并用附录6描述的HPLC法分析。所有结果用内标法计算。NT＝未试验。ND＝未检测。

    测定给予A10制剂的无胸腺鼠的药动参数，计算值为LD10。腹腔注射225mg/m2(75mg/kg)的A10并在48小时最后取样时间后检测B11，t1/2为15.5小时。Tmax为3小时(表XXII)。AU C计算值为5660μg.hr/mL。CL计算值为0.27mL/hr，假设生物利用度为100％，平均给药时间为0。VD的计算值为6.4mL。

    对4个每日1次IP给药7天后的鼠中的A10药动参数LD10(75mg/kg)也进行了研究。在最后一次给药48小时后检测血浆中的B11其t1/2为16.9hr，Tmax为3hrs(表XXII)。B11的AUC计算为5012μg.hr/mL。CL计算为0.3mL/hr，假设生物利用度为100％，平均给药时间为0。VD计算值为8.2mL。

    检测A10在BALB/c小鼠中的药动参数。给BALB/c鼠IP一个剂量的A10(120mg/m2，40mg/kg)。给药1小时后，A10因全部转化为B11而不再能检测到。48小时(最后分析时间)后检测血浆中的B11，且t1/2为14.9hr，Tmax为3hr，如表XXII所示。AUC的计算值为4444μg.hr/mL。CL计算值为0.18mL/hr。假设生物利用度为100％，平均给药时间为0。VD计算值为3.1mL。在鼠脑中，B11的t1/2为2hr，Tmax为1hr(表XXII)。

    当给大鼠(Wistar，雌性)经IP一个剂量的A10(560mg/m2，80mg/kg)，2小时后转化成B11，此时为第1分析时间点。且A10在给药8小时后仍可检测到。如表XXII所示，A10的t1/2小于2hr，Tmax小于2hr。服药24小时后检测B11。其t1/2为6hr。Tmax为6hr。AUC计算值6417μg.hr/mL。CL计算值为0.26mL/hr。假设生物利用度为100％，平均给药时间为0。VD计算值为5.3mL。在鼠脑中，B11的t1/2为6hr，Tmax为6 hr而A10的t1/2为20hr，Tmax为7hr(见表XXII)体内血浆水平

    检测B11在单剂量或多次每日给A10无胸腺鼠中体内血浆水平，结果概括于表XXIII中。单剂量给A10(20mg/kg)后3小时，检测到的B11浓度为51.2±7.3μg/mL(范围38.8～55.2μg/mL)，而A10未检测到。在多次给A10(20mg/kg/日)的无胸腺鼠中检测B11的血浆稳态水平，测量间隔为24小时(给药8次)。B11的最大血浆稳态水平为79.7±11.2μg/mL(范围65.2—94.6μg/mL)，稳定状态最小值或谷水平值为33.6±7.3μg/mL(范围23.4～45.8μg/mL)。B11在达稳态(最大稳态水平)后的血浆水平值为64％，大于单剂量给药(表XXIII)。                              表XXIII                            B11的血浆浓度

                      B11浓度(μg/mL)    A10剂量     单次    多次给药   ％增长率    20mg/kg    51.2±7.3    79.7±11.2      64    40mg/kg   110.9±15.3    161.1±27.8      69表XXIII。测定B11在单剂量或多次每日给A1020到40mg/kg/日的无胸腺鼠中的血浆水平。所有数据均为4个动物的平均值。

    同样测定B11在单剂量40mg/kg的A10给药后，Tmax时的血浆浓度。B11的浓度为110.9±15.3μg/mL(范围93.5～131.3μg/mL)，而未检测到A10。还测定B11在多次给A10(40mg/μg)无胸腺鼠中的血浆稳态水平，检测间隔为24小时。B11的最大血浆稳态水平为161.1±27.8μg/mL(范围119.9—204.1μg/mL)，稳态最小值或谷水平值为38.2±21.7μg/mL(范围13.5—66.9μg/mL)。在达稳态后的B11血浆水平为69％，大于单剂量给药(表XXIII)。这些数据说明B11在每日多次给A10时有积累作用。

    除血浆水平外，还测定A10与B11在给A10后的大、小鼠脑组织中的浓度。结果见表XXIV。两种和两族动物的B11和A10脑水平存在差异。无胸腺鼠中，B11在脑中含量最高、其次为BALB/c鼠、最低为Wistar大鼠。在B11给药后2hr和4hr，B11在无胸腺鼠脑中的含量比在Wistar大鼠脑中分别高11和6.5倍。在给药后2小时，无胸腺鼠脑中的A10比在Wistar大鼠多2倍。在给药4小时后，在无胸腺鼠脑中检测到的A10与在Wistar鼠中检测到的大致相等。

                                表XXIV                  脑组织中B11和A10浓度的比较

                             B11和A10在脑组织中的浓度(ng/mg)          无胸腺小鼠             BALB/c小鼠        Wistar大鼠  时间     B11     A10     B11     A10    B11    A10  2hr  21.9±12.7  19.9±13.5   3.5±2.8*  9.1±13.5*  1.9±1.5   8.9±4.8  4hr  21.3±19.3   1.8±1.6   10.7±3.7   3.8±2.9   3.3±1.5   2.1±3.2表XXIV。用附录6所述的方法检测到的脑组织中的B11和A10含量。*给药后2.5小时检测。n＝4(动物)。

    上述药理学研究说明：A10在大和小鼠中均代谢成B11。此外，A10与B11在两种鼠的血浆和脑组织中均可检测。然而，两种实验动物的血浆和脑组织中的A10和B11的药动和分布是明显不同的。实施例13：A10的初级毒理学研究

    A10的初级毒理学研究包括A10对血细胞、体重、LD50的影响的测定试验。为测定潜在的辅料对A10的LD50的影响，还做了其它相关的实验。该方法的详细描述见附录7。药理学和毒理学研究表明：如果有任何相对的影响存在，尤其是用PBTE：D5W制剂，则A10的给药几乎是无条件的。在本申请的指导下，本领域普通技术人员可以制得适宜的A10的制剂。

    A10对血细胞的影响

    实际上很多癌症治疗方法具有细胞毒性且对血细胞产生较深的影响而导致血细胞减少症。实验测定A10对红细胞和白细胞数量的影响以及淋巴细胞与多形核白细胞的百分比的影响。

    在用A10在DMSO、PBTE或PBTE∶D5W(1∶1)中以15mg/kg/日的剂量给药，在21天中，血细胞没有明显变化。用PBTE：D5W以20或25mg/kg/日给药时，不影响RBCs和WBCs数及淋巴细胞与中性粒细胞的百分比。然而，仅用PBTE制剂以30mg/kg/日给药时，在给药2—3周后，WBCs有少量降低。仅用PBTE的A10以40mg/kg/日给药几周后可见有贫血和白细胞减少症。用A10的PBTE：D5W制剂给药100天后，未见对血细胞影响。A10对体重的影响

    每天以A10(20mg/kg/日)给药100天，检测体重的影响。与对照组相比，A10在开始使体重有所增加。然而，几周后，用药组动物的体重增加速度与未给药组或赋形剂对照组相似。在给药期间，无动物死亡。此外，A10对血细胞变化及对主要病理组织，包括心脏、肝脏、肺、肾、脾、长骨胃、肠系粘膜淋巴结、大、小肠及胰腺均无影响。LD50的检测

    用不同剂量方式测定了A10在无胸腺小鼠(BALB/c，nu/nu，雌性)和BALB/c小鼠(雄性和雌性)中的半数致死量(LD50)。见表XXV，A10的LD50范围从83—145mg/kg。

    还测定了抗惊厥药Dilantin(苯妥英钠注射液)和抗炎药Decadron(地塞米松钠磷酸盐注射液)对A10的LD50的影响(表XIV)。动物在用Decadron或Dilantin给药之后的A10的LD50分别为94和144mg/kg。

                                          表XXV                      A10在小鼠中LD50(半数致死量)的测定

            剂量/方式      种，性别 LD50(mg/kg)          单剂     无胸腺，f    145        每4天×4     无胸腺，f    75        每7天×4     无胸腺，f    100          单剂     BALB/c，f    83          单剂     BALB/c，m    107   用Decadron○后，单剂     BALB/c，f    94   用Decadron○后，单剂     BALB/c，f    144表XXV。Decadron在单剂量给A10之前以1.5mg/kg/日给药7天。Dilantin同法以20mg/kg/日给药7天。LD50是通过用四参数计算方程得到的死亡率与剂量之比计算的。f＝雌性，m＝雄性，n＝每组5个动物。实施例14：在体内通过变异PDGF—R受体对肿瘤的抑制

    该实施例说明核酸编码的PDGF—b受体片断在体内对肿瘤生长的抑制。用携带人PDGF—b受体突变基因的逆转录病毒感染C6大鼠神经胶质瘤细胞。七种选择性G418克隆通过用能够识别人受体细胞外功能区而又不与野生大鼠受体起交叉反应的抗体的Westerm印迹来筛选受体片断的表达。两种克隆HiMut.1和HiMut.2表达受体缺乏大多数细胞内功能区而具有预期分子量的蛋白质的高水平。几种克隆表达受体片断的低水平；选择LoMut.1做进一步实验。Himut.1表达的PDGF—R比LoMut—1高8.3倍。Himut.2比LoMut.1高9.4倍。含变异受体的菌落的分离和特征如下面所述。

    细胞培养。所有培养基、牛胎儿血清(FBS)和化学药品均购自Gibco BRL。C6大鼠神经胶质瘤细胞在Ham′s/F—10培养基中培养，培养基还加入5％牛胎儿血清和2mm的谷氨酰胺。COS细胞在含10％牛胎L血清和2mM谷氨酰胺的Dulbecco′s Modified Eagle′s培养基(DMEM)中培养。

    变异PDGF—b受体的表达。通过直接定位诱变将一个密码子引入从第一酪氨酰激酶功能区直接逆流而得的人PDGF—b受体基因。将变异基因克隆入一个鼠肉瘤病毒长末端重复控制的介质中。(Muller，A.J.，et a1.，Mol.Cell.Biol.11：1785—1792，1991)。每个介质4mg并将一个含需逆转录病毒包附的基因(Muller，supra)的介质用磷酸钙沉淀法转染入COS细胞(2×105个/60mm盘)(Chen，C.A.andH.Okayama，BioTech.6：632—638，1988)。细胞用PBS洗涤，然后使其生长一天并集中在转染后的4—6天调节培养基。C6细胞(105个细胞/60mm盘)用调节好的含6mg/ml聚凝胺(Sigma)的培养基稀释剂感染。两天后，用800mg/ml的G418(Gibco)来选择细胞选出可识别的菌落。介质对照细胞同法制得但使用LTR下缺乏基因的介质。

    野生型(动物)和受体片断的协同免疫沉淀反应。介质对照细胞和变异PDGF—b受体高水平表达的细胞(HiMut.1)，在6孔盘上分别接种3×105个细胞/孔。接下来的一天，用0.5m13％的含100mC1/ml的35S标记的(ICN)—cys，—met DMEM(ICN)调节培养基。细胞在37℃培养16hrs。用组合缓冲液(0.1％BSA，10mg/ml CaCl2·2H2O，10mg/ml MgSO4·7H2O，10mg/ml抑肽酶和0.2mMPMSF的PSB)洗涤两次，然后在每个孔中加入0.5ml混合缓冲液或0.5ml 20ng/ml PDGF—BB(Collaborative ResearchInc.)的混合缓冲液。细胞在4℃恒温4hrs，用PBS洗涤两次并用0.5ml 1％Triton—100的HNTG(20mklHEPES，(PH7.5)，150mMNaCl，Triton X—100，100％甘油、各10mg/ml的抑制酶、亮肽素和抑胃酶素及0.2mMPMSF)溶液溶解。PDGF—BB在有PDGF的细胞的溶解缓冲液中。溶解产物在4℃，100000xg离心30分钟。将上清液转入干净试管中并用蛋白A—琼脂糖(vector Laboratories)进行前期清除。向2个PDGF处理的样品中加入SDS使每一个细胞系的最后浓度为0.1％。重复样品用能识别野生大鼠受体(VBI抗PDGF—b受体)C—端的抗体或能识别人变异受体(Genxyme抗—PDGF—b受体)的抗体进行免疫沉淀。用于Genzyme抗—受体培养的样品的第二种抗体是兔抗—鼠IgG。复合体用蛋白A—琼脂糖沉淀并用0.1％Triton X—100的HNTG液洗涤5次。蛋白质用7.5％还原的SDS—聚丙酰胺凝胶电泳进行分离。凝胶用Amplify(Amersham)处理并曝露于X—射线胶片下3天而凝固。

    Western印迹法。每个细胞系被置于5×105细胞/孔的六孔盘的多孔中。接着供给1％FBS的MCDB105(UCSF细胞培养设备)并于无CO2的环境中培养24hrs。在每一克隆的一个孔中加入PDGF—AA或BB(collaborative ReserchInc.)达到所需的最终浓度。室温下培养7分钟后，细胞用PBS洗涤并分解在50mM Tris—HCl(PH7.4)，1％nonidetP—40，10％甘油，2mMEDTA，10mM焦磷酸钠，各10mg/ml的抑肽酶和亮肽素，1mM PMSF和1mM原钒酸钠中。每一等体积的分解产物继续用大量7.5％SDS聚丙酰胺凝胶处理，然后转移到硝纤维素上(Schleicher &schuell)。用含5％配好的脱酯牛奶的Tris—缓冲盐/0.05％Tween—20(TBST—T)阻断细胞膜。二重膜在含多克隆含抗磷酸酪氨酸1∶3000或者抗PDGF—b受体(UBI)1∶1000的阻断缓冲液中培养。二级抗体(secondary antibody)是辣根螫合过氧化酶山羊抗兔IgG(Slgma)1∶1000。用抗1∶500稀释的抗人PDGF—b受体细胞外功能区的单克隆抗体测定受体片断(Genzyme)。所用二级抗体(Secondary an-tibody)是螯合过氧化酶兔抗鼠IgG(ICN)1∶1000。所用印迹法均为ECL(Amersham)检测。相关区面积用MolecularDevices Computing Densitometer测定。每一点均减去基础磷酸化水平。

    细胞系的依附生长。为了测定生长密度，每一个细胞系均以104细胞/孔接种在5个24—孔盘上，该盘在1％或5％的FBS Ham′s/F—10培养基上有三倍量的样品。培养基每3天一换。每2天，一个盘上的细胞用胰蛋白酶作用并用Coulter计数器计数。为了检测克隆的效果，将每个细胞系中的100个细胞置于3个10c在1％或5％FBS的Ham′s/F—10培养基中的托盘上。培养基每3天一换大约12天。克隆被固定，用美兰染色并计数。

    不依赖于锚基的细胞系生长(软琼脂测定)。在35mm托盘中用0.8％Seaplaque琼脂糖(FMC Bioproduts)，1％FBS 2m/M谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、10mMHFPES和非必需氨基酸制成一个碱基层。细胞悬浮在0.4％含其它上列成分的琼脂糖及所需浓度的PDGF—BB(Collaborative Re-search Labs)的溶液中。将悬浮液置于3000细胞/盘的碱基层中。然后在含5％CO2的加湿器中培养2周。用目视法或自动Ominon3800IM肿瘤克隆计数器对克隆计数。

    裸鼠中细胞系的生长。细胞在滚动瓶中膨胀，受胰蛋白酶作用并悬浮PBS中。计数并将其量调节为3×107细胞/ml。对于每一细胞系，对4至8个无胸腺小鼠(SimonsenLab)皮下注射100ml(3×106个细胞)。肿瘤量用测径器测量。每周测2次到18至21天。

    肿瘤切片的免疫组织化学染色。将肿瘤从小鼠中切除并冻在OCT(Miles Lab)中。切成5mm厚的切片固定于丙酮中。切片用先保存于20mg/ml生物素标记抗人PDGF—b受体中的10％正常山羊血清阻断(Genzyme抗体，用分子探针生物表标记)，用螯合过氧化酶抗生蛋白链菌素(caltag)1∶100和二胺基联苯胺(Sigma)的双氧水液检测。做为阴性对照，用一个生物素标记的单克隆抗体与同样蛋白质浓度的不相关蛋白做为抗—PDGF—b受体。用Harris苏木素(Anatech)染色计菌株数。

    用前面描述的逆转录病的表达系统，将PDGF—b受体片断引入大鼠C6神经胶质瘤细胞中。在抗G418克隆表达变异受体时，野生动物的PDGF—BB诱导的酪氨酸的磷酸化明显降低。而且，与母C6细胞相比，这些细胞生长的密度低并生成较小的菌落。

    细胞表达的受体片断在裸鼠中的生长能力明显减弱。21天后，HiMut.1和HiMut.2中的肿瘤量仅是母细胞肿瘤量的12—16％。C6母细胞和介质对照细胞衍生的肿瘤基本上相同，这说明介质对照细胞的G418选择并不影响其在裸鼠体内的生长能力。从HiMut.1衍生的肿瘤至少有10％的细胞有非常暗的免疫染色。HiMut.2衍生的肿瘤有45—85％的细胞着色。

    用溶解肿瘤切片的Western印迹法确定了PDGF—b受体片断的存在。这样，PDGF—b受体在体内表达21天后至少有10％的细胞受到抑制。这些研究说明PDGF—R的明显性负变异株抑制体内具异常PDGF—R活性的肿瘤的生长的效用。实施例15：其它化合物的细胞培养及体外作用

    本实施例说明除A10与B11之外的特征化合物对细胞培养的或体内肿瘤生长的影响。PDGF—R活性、C6 SRB及体内效力用前面附录所述方法测定。结果见表XXVI和XXVII。这些结果为原始数据。本领域普通技术人员可用本领域的已知方法如不同给药方式改进不同化合物的效能。

                                                         表XXVI

     化合物    U1242激酶    IC50(μM)   C6 SRB IC50(μM)     LD10    (mg/kg) C6体内药效  IC50(μM)   P值注释   P10      3.0(W)     12  J10       1(W)      ＞50     12     171  73％在40在第18天100％死亡  G13       1.5    ＞50   未试验  12％在15死亡率0％  G14     0.8(W)    ＞50   未试验  36％在15  0.285在第14天死亡率0％  G21     6.0(W)     ＞50    ＞12    ＞12   ＞200无    死亡 无效应在40死亡率0％  G22     0.9(W)      14    ＞6    ＞6     25 在20无效应死亡率0％由于溶解问题仅做一次MTO剂量试验  P16      0.8     ＞50     17   ＞400无    试验 在60无效应死亡率0％  F10     45(W)   ＞12.5  G24      0.6       5     1    2.2   ＞200无    死亡 在20无效应死亡率0％第15天死亡率12.5％第10天死亡率100％  G25      1.0     50  P13      1.2   ＞100  P17    0.8/3.0     ＞50     12   ＞100无    死亡由于溶解性问题仅做一次MTD剂量试验  H10     25(W)     ＞50     13     75  52％在30  0.006第17天，14.3％死亡率 化合物 U1242激酶 IC50(μM)   C6 SRB  IC50(μM)LD10(mg/kg)C6体内药效IC50(μM)P值注释   H12 ＞250(W)   25(W)     19   H13   ＞50   ＞50     20    10.5＞400无死亡  0％在40 41％在100  0.12死亡率0％死亡率0％   E15  5.0(W)   10(W)   ＞50    4.4＞400无死亡  66％在15  58％在50  0％在100  0.019  0.1死亡率0％第15天死亡率12.5％第8天死亡率100％   P19    ＞50   P21    ＞25   F11    3.1     14   P21    93    ＞25W＝在Western试验中所作                                表XXVII

     化合物   U1242激酶   IC50(μM)   C6 SRB   IC50(μM)    LD10   (mg/kg)         注释  A13    ＞＞25＞200无死亡 25μM时的～30％抑制率  P22    ＞＞25 25μM时的～10％抑制率  P23      18  P24      14  G28     16.4    (8cndry)      4.5  G29     23.2    ＞13 在12.5μM时 杀死所有细胞  G30     32.5       2

    W＝在Western试验中所作

    实施例16：联合治疗

    该研究的目的在于观察PDGF—R抑制剂与已知的通常用于肿瘤治疗的细胞毒药物联合用药时对肿瘤生长的影响。给裸鼠皮下移植CALU—6细胞和MCF—7/Her2细胞分别实验。在其一的实验中，小鼠单独用A10给药、仅用顺氯氨铂给药或同时用顺氯氨铂和A10给药。A10以5mg/kg每周两次腹腔给药。顺氯氨铂在第2天以5mg/kg腹腔给药一剂。

    在移植MCF—7/Her2细胞的小鼠中，A10与顺氯氨铂联合给药对肿瘤生长的抑制比单独用顺氯氨铂或未给药好，但并不强于单独用A10给药。然而，在移植CALU—6细胞的小鼠中，A10与顺氯氨铂联合给药对肿瘤生长的抑制明显强于A10单独给药、顺氯氨铂单独给药和未给药组。

    在第2个用CALU—6细胞的实验中，小鼠分别用A10、顺氯氨铂或UP—6(10mg/kg在第4、7、10天)单独给药或顺氯氨铂和VP—16；A10、顺氯氨铂和VP—16联合给药。A10、顺氯氨铂和VP—16联合给药对肿瘤生长的抑制作用明强于单独给药或顺氯氨铂与VP—16联合给药。实施例17：化学合成

    本发明的一些化合物可以通过从已知化合物或已制得的中间体开始，以文献中已知的过程制备。喹喔啉化合物可通过或者1)1，2芳香二胺与a—酮醛或a—二酮反应，或者2)在酸催化剂存在下a—双硫化半卡巴腙和1，2—二胺的交换反应而制备。在下面的制备中，芳香二胺可以从市面买到或如实施例中所述制备。在实施例中反应溶剂不是指定的，反应在乙醇—乙酸中进行。根据元素分析，一些用此溶剂合成的喹喔啉被分离为与一分子乙酸的酸加成复合物。在单独的乙醇中反应，接着溶剂蒸发并重结晶，得到更为洁净的产物和较高产率。

                      第1组化合物

    A10

    A10可如EP—0013376A2中制备。另外A10可如下制备：

    步骤1：乙酰乙酸—(4—三氟甲基)苯胺的制备

    将4—三氟甲基苯胺(16.1g，0.1mol)，2，2，6—三甲基—4H—1，3—二氧杂环己烯—4—酮(纯度95％；14.97g，0.1mol)，和二甲苯(20ml)的混合物在预热至150℃的热浴中加热回流30分钟。产生的深色溶液冷却至室温使产物结晶。将晶体过滤收集。从母液(初始结晶和过滤之后保留的溶液)得到更多物质。粗苯胺化物的产量为17.75g(72％)，苯胺化物的熔点为153—154℃。

    步骤2：2—乙氧基亚甲基乙酰乙酰基—(4—三氟甲基)苯胺

    乙酰乙酰基—(4—三氟甲基)苯胺(14.11g，57.6mmol)，三乙氧基甲烷(9.43g，63.4mmol)，和乙酐(16.30ml，173mmol)混合在一起并加热回流90分钟。将产生的深色溶液蒸发至干。将残渣再悬浮于苯/异辛烷中，产物结晶。从母液得到更多物质。纯产物的产量为11.93g(72％)，mp.120—122℃。

    步骤3：A10的制备

    将乙醇(6ml)中的2—乙氧基亚甲基乙酰乙酰基—(4—三氟甲基)苯胺(3.01g，10.4mmol)慢慢加入冰冷的盐酸羟胺(0.77g，11.0mmol)于2M NaOH(5.5ml)的溶液中。将混合物加热至回流1小时，冷至室温并蒸发至干。将残余物再悬浮并分配在乙酸乙酯和水中。分出有机层，用水提取，硫酸钠干燥并蒸发溶剂。残余物再悬浮于甲苯中并结晶产生熔点为166—167℃的A10固体残渣(2.4g，87％)。A11

    5—甲基—异恶唑—4—羧酸—(3—三氟甲基)苯胺化物的制备以三步进行：

    a)乙酰乙酸—(3—三氟甲基)—苯胺化物的制备

    在25ml装有Claisen蒸馏头和磁力搅拌器的圆底烧瓶中，将4g(18.6mm)α，α，α—三氟—对甲苯胺，3.71g(24.8mm，1当量)95％2，2，6—三甲基—4H—1，3—二氧杂环己烯—4—酮，112ml二乙醇胺和12.4ml二甲苯混合。混合物的温度升至110℃，混合物在此温度搅拌6小时，同时从体系中蒸出丙酮。反应进程用TLC(板：Merck Kieselgel 60F254，洗脱剂：石油醚(90—110℃馏分)∶丙酮2∶1)，用乙醇中5％PMA显色)监测。

    6小时后，在20Hg mm蒸去二甲苯，残余物用中压(2atm)液相色谱纯化，用硅胶60作固定相，石油醚(90—110℃馏分)∶丙酮2∶1作淋洗剂。

    收集在Rf＝0.3部分的产物—用用于反应监测的TLC系统—去掉溶剂后，3.82g乙酰乙酸—(3—三氟甲基)苯胺化物被分离出来。熔点：91—92℃。

    1H—NMR(ppm，丙酮—d6)

    ArH    7.36—7.87    4H    (m)

    NH     9.41          1H    (s)

    CH2   3.62          2H    (s)

    CH3   2.64          3H    (s)

    b)2—丙烯酰胺，2—乙酰基—3—乙氧基—N—[(三氟甲基)苯基]的制备

    在干燥过的(120℃，30分钟)50ml装有磁力搅拌器，温度计，橡胶隔膜和T型活塞上的氩气球的圆底烧瓶中，将1.0g(4.1mm)乙酰乙酸—(3—三氟甲基)—苯胺化物，0.85g(5.7mM)原甲酸三乙酯，1.37g乙酐和450mg干燥氯化锌混合。混合物在氩气氛中于60℃搅拌30分钟。反应进程用TLC(板：Merck Kieselgel 60 F254，洗脱剂：石油醚(90—110℃馏分)∶丙酮5∶1)监测。如果30分钟后反应没有完成，再加入0.85g(5.7mm)原甲酸三乙酯。

    反应混合物逐渐变成棕色。反应完成后，将反应混合物真空汽提，残余物溶于乙酸乙酯中，水洗，有机相用硫酸镁干燥，然后过滤，真空蒸去乙酸乙酯。1.16g粗产物用中压(2atm)液相色谱纯化，用硅胶60作固定相，石油醚(90—110℃馏分)∶丙酮5∶1作淋洗剂。

    在Rf＝0.231的产物部分被收集—用用于反应监测的TLC体系—去掉溶剂后，分离出2—丙烯酰胺，2—乙酰基—3—乙氧基—N—[(三氟甲基)苯基]。熔点：100.5℃。1HMR(ppm，丙酮—d6)

    ARH    7.29—8.00    4H    (m)

    NH     11.25         1H    (s)

    CH＝   8.46          1H    (s)

    EtCH2 4.37          2H    (s)

    EtCH3 1.45          3H    (s)

    AcMe   2.48          3H    (s)

    c)5—甲基—异恶唑—4—羧酸—(3—三氟甲基)苯胺化物

    在装有磁力搅拌器和温度计的25ml圆底烧瓶中，0.11g(1.5g mM)盐酸羟胺被溶于0.5ml水中，并往此溶液中加入64mg(1.6mM)氢氧化钠(加到0.5ml水中)。往此溶液中加入2.2ml甲醇，在室温下加入0.44g(1.6mM)2—丙烯酰胺，2—乙酰基—3—乙氧基—N—[(三氟甲基)苯基]。反应进程用TLC(板：Merck Kuselgel 60 F254，洗脱剂：石油醚(90—110℃馏分)∶丙酮4∶1，用乙醇中5％PMA显色)监测。反应完成后，将反应混合物真空浓缩，残余物溶于乙酸乙酯中。有机相用水洗，硫酸镁干燥。过滤并浓缩。得到的0.5lg粗产物用中压(2atm)液相色谱纯化，用硅胶60作固定相，石油醚(90—110℃)∶丙酮4∶1作淋洗剂。

    在Rf＝0.162的产物部分被收集—用用于反应监测的体系—去掉溶剂后，分离出0.22g 5—甲基—异恶唑—4—羧酸—(3—三氟甲基)苯胺。熔点：115—120℃。1HMR(ppm，丙酮—d6)

    ArH+NH    7.42—7.88    4H    (m)

    CH＝      8.50          1H    (s)

    CH        8.50          1H    (s)A12

    A12可如Patterson等人，J.Med.Chem.35：507—510(1992)所述制备。

    A13：N—三氟甲基苯基3，5—二甲基异恶唑—4—甲酰胺

    320mg 3.5—二甲基异恶唑—4—羰基氯化物和2ml二氯甲烷中的1ml 4—三氟甲基苯胺混合物在室温搅拌过夜。混合物然后用乙酸乙酯和水处理。粗产物用乙醇和水结晶得到330mg N—三氟甲基苯基3.5—二甲基异恶唑—4—甲酰胺。

                         第2组化合物B10

    B10以两步合成

    a)氰基乙酰基—(4—硝基)苯胺化物的合成

    将1.38g(10mmol)4—硝基苯胺溶于30ml绝对吡啶中，然后冷却至-30℃，在连续搅拌下滴加0.43ml(5mmol)三氯化磷，避免温度超过-20℃。0.5小时后，加入0.85g氰基乙酸，将溶液在-20℃搅拌0.5小时，再于室温搅拌12小时。

    真空蒸发溶剂。残余物用1N HCl覆盖并用乙酸乙酯提取。乙酸乙酯溶液用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。残渣用乙醚研制，过滤并真空干燥。产率为1.70g(83％)。产物具有如下特征：

    溶点：81—83℃

    Rf：0.95(己烷—EtOAc；1∶1)

    b)氰基乙酰基—(4—硝基)苯胺化物的乙酰化

    将0.82g(4mmol)氰基乙酰基4—硝基苯胺化物溶于2ml绝对吡啶中，接着加入20mg 4—氨基吡啶催化剂和0.50ml四甲基胍。搅拌反应混合物，硝基苯胺化物溶解。然后在0℃滴入5ml乙酐。

    2天后蒸发吡啶，加入乙酸乙酯，有机层用5％NaHCO3溶液提取，在1N HCl，和水中。有机层用Na2SO4干燥并蒸发。残余物从乙醚中结晶，得到210mg(21％产率)产物。产物具有下列特征：

    Rf＝0.35(EtOAC)

    熔点：260℃B11

    B11用两种不同方法合成：方法A和方法B。方法A

    27g A10于150ml乙醇中的混合物与16.2g 1，8—二氮杂双环[5.4.0]十一碳—7—烯混合。反应混合物然后在室温搅拌30分钟，并将乙醇蒸发掉。产生的固体悬浮于500ml乙醚中并与200ml 0.6N盐酸溶液混合。所有固体空吸过滤。用200ml乙醇洗涤并空吸干燥得到25g产物。方法B

    2—丁烯酰胺，2—氰基—3—羟基—N—[(4—三氟甲基)苯基](C12H19F3NO3)以如下两步制备：

    a)氰基乙酰基—(4—三氟甲基)苯胺化物的制备

    3g(18.6mM)α，α，α—三氟—p—甲苯胺和3.37g(29.8mM，1.6当量)氰基乙酸乙酯的混合物在50ml配有磁力搅拌器，温度计和氮气进口的烧瓶中，于180℃油浴上搅拌5小时。反应进程用TLC(板：Merck Kieselgel 60 F254，洗脱剂：石油醚(90—110℃馏分)∶丙酮1∶1)监测。反应混合物用中压(2atm)液相色谱纯化，用硅胶60作固定相，石油醚(90—110℃馏分)∶丙酮1∶1作淋洗剂。

    收集产物部分—用用于反应监测的TLC系统—去掉溶剂后，分离出2.11g氰基乙酰基—(4—三氟甲基)苯胺化物。熔点：192—194。

    1H—NMR(ppm，丙酮—d6)

    ArH    7.68—7.85     4H    (dd)

    NH     9.84    1H    (s)

    CH2   3.90    2H    (s)b)2—丁烯酰胺，2—氰基—3—羟基—N—[(4—三氟甲基)苯基]的制备

    在装有磁力搅拌器，温度计，橡胶隔膜和T型活塞(带有真空和氩气层气球接头)的圆底烧瓶中，将1.78g(0.89g，37.1mM)50％NaH油分散体悬浮于4ml干燥(用P2O5)乙腈中。悬浮液冷却至10℃、，在此温度搅拌下，加入2.72g(11.9mM)氰基乙酰基—(4—三氟甲基)苯胺，10分钟内溶于25ml干燥(用LiAlH4)四氢呋喃中。反应混合物变黄，加完后冷却至—10℃，然后在20分钟内加入1.05g(13.11mM，1.1当量)乙酰氯。在加入的过程中，反应混合物的温度不能高于-5℃。反应进程用TLC(板：Merck Kiesel-gel 60 F254，洗脱剂：石油醚(90—110℃馏分)∶丙酮1∶1)监测。

    当反应完成时，反应混合物在0℃搅拌30分钟，35C搅30分钟和65℃再搅30分钟，然后将反应混合物真空汽提。残余物溶于30ml蒸馏水中，在80℃活性碳处理并过滤。产生的残黄色滤液用10％盐酸溶液酸化，滤出沉淀的晶体，水洗并干燥。粗晶体(2.5lg)用中压(2atm)液相色谱纯化，用硅胶60作固定相，石油醚(90—110℃馏分)∶丙酮1∶1作淋洗剂。

    收集Rf＝0.138的产物部分—用用于反应监测的TLC系统—去掉溶剂后，分离出1.99g 2—丁烯酰胺，2—氰基—3—羟基—N—[(4—三氟甲基)苯基]。

    TLC石油醚(90—110℃)/丙酮1/1＝0.138。H—NMR     (ppm，DMSO—d)ArH        7.65—7.78    4H    (dd)NH         10.85         1H    (s)CH3       2.26          3H    (s)OH         6.39          1H    (s)B122—丙烯酰胺，2—氰基—3—羟基—3—(4—氟代苯基)—N—[(4—三氟甲基)苯基](C17H10F4N2O2MW：350.3)的制备如下进行：

    a)氰基乙酰基—(4—三氟甲基)苯胺化物的制备：

    3g(18.6mM)α，α，α—三氟—p—甲苯胺和3.37g(29.8mM，1.6当量)氰基乙酸乙酯的混合物在配有磁力搅拌器，温度计和氮气口的50ml烧瓶中，于180℃油浴上搅拌5小、时。反应进程用TLC(板：Merck Kieselgel 60 F254，洗脱剂：石油醚(90—110℃馏分)∶丙酮1∶1作洗脱剂。

    收集产物部分，去掉溶剂后，分离出2.11g氰基乙酰基—(4—三氟甲基)苯胺化物。产物具有下列特征：

    熔点：192—194℃。1HMR(ppm，丙酮—d6)ArH    7.68—7.85    4H    (dd)NH    9.84    1H    (s)CH2  3.90    2H    (s)

    b)2—丙烯酰胺，2—氰基—3—羟基—3—(4—氟苯基)—N—[(4—三氟甲基)苯基]的制备：

    在50ml配有磁力搅拌器，温度计，橡胶隔膜和T型活塞(带真空和氩气层气球接头)的圆底烧瓶中，将0.55g(0.275g，11.4mM)50％NaH油分散液悬浮于1ml干燥(用P2O5)乙腈中。将悬浮液冷却至10℃，在此温度搅拌下，10分钟内加入溶于10ml干燥(用LiAlH4)四氢呋喃中的1g(4.4mM)氰基乙酰基—(4—三氟甲基)苯胺化物。将反应混合物冷却至-10℃，在此温度下20分钟内加入0.77g(4.8mM，1.1当量)4—氟苄基氯。在加入期间，反应混合物的温度不允许高于-5℃。反应进程用TLC(板：MerckKieselgel 60 F254，洗脱剂：石油醚(90—110℃馏分)∶丙酮1∶1)监测。

    反应混合物再于0℃搅拌30分钟，然后将反应混合物真空汽提。残余物溶于30ml蒸馏水中，80℃活性碳处理并过滤。产生的浅黄色滤液用10％盐酸溶液酸化，沉淀的晶体被过滤，水洗并干燥。粗晶体(2.47g)用中压(2atm)液相色谱纯化，用硅胶60作固定相，石油醚(90—110馏分)∶丙酮1∶1作淋洗剂。

    收集Rf＝0.216的产物部分，去掉溶剂之后，分离出1.05g 2—丙烯酰胺，2—氰基—3—羟基—3—(4—氟苯基)—N—[(4—三氟甲基)苯基]。产物具有如下特征：溶点：195℃(分解)。1HMR(ppm，丙酮—d6)

    ArH    7.36—8.13    8H    (m)

    NH     9.5           1H    (s)

    OH     16.5          1H    (s)B13

    2—丙烯酰胺，2—氰基—3—羟基—3—环己基—N—[(4—三氟甲基)苯基](C17H17F3N2O2MW：338.3)的制备如对B12所述的进行，用0.71g(4.8mM，1.1当量)环己基乙酰基氯代替4—氟苯甲酰氯。所得产物具有下列特征：

    TLC∶Rf＝0.265(石油醚(90—110℃)∶丙酮，1∶1)

    熔点：212℃(分解)B14

    2—氰基—3—羟基—3—(2，2，3，3—四甲基环丙基)丙醇—4—(三氟甲基)苯胺化物的制备如上面对B12所述的进行，用2，2，3，3—四甲基环丙基羰基氯代替4—氟苯甲酰氯。B15

    2—丙烯酰胺，2—氰基—3—羟基—3—(五氟苯基)—N—[(4—三氟甲基)苯基]的制备如对B12所述的进行，用1.5g(6.51mM，1.1当量)五氟苯甲酰氯代替4—氟苯甲酰氯。所得产物具有下列特征：TLC∶Rf＝0.360(石油醚(90—110℃)：丙酮，1∶1)熔点：157—158℃。B16

    2—丙烯酰胺，2—氰基—3—羟基—3—((3—苯氧基)苯基)—N—[(4—三氟甲基)苯基](C23H15F3N2O3MW：424.4)的制备如对B12所述的进行，用1.65g(4.8mM，1.1当量)3—苯氧基苯甲酰氯代替4—氟苯甲酰氯。所得产物具有下列特征：TLC∶Rf＝0.300(石油醚(90—110℃)：丙酮，1∶1)熔点：197—198℃。B17

    2—丁烯酰胺，2—氰基—3—羟基—4—苯基—N—[(4—三氟甲基)苯基]的制备如对B12所述的进行，用0.68g(4.8mM，1.1当量)苯基乙酰氯代替4—氟苯甲酰氯。所得产物具有下列特征：TLC∶Rf＝0.165(石油醚(90—110℃)∶丙酮，1∶1)熔点：165—158℃。B18 2—己烯酰胺，2—氰基—3—羟基—5—甲基—N—[(4—三氟甲基)苯基](C15H15D3N2O2MW：312.3)的制各如对B12所述的进行，用0.58g(4.8mM，1.1当量)异戊酰氯代替4—氟苯甲酰氯。所得产物具有下列特征：TLC∶Rf＝0.323(石油醚(90—110℃)∶丙酮，1∶1)熔点：161—163℃。B192—丁烯酰胺，2—氰基—3—羟基—4，4—二苯基—N—[(4—三氟甲基)苯基](C24H17F3N2O2MW：422.4)的制备如对B12所述的进行，用1.12g(4.8mM，1.1当量)二苯基乙酰氯代替4—氟苯甲酰氯。所得产物具有下列特征：TLC∶Rf＝0.354(石油醚(90—110℃)∶丙酮，1∶1)熔点：195—202℃。

                           第3组化合物C10

    将340mg(1.5mM)1—苯基——3—氨基—4—氰基—5—氰甲基—2—吡唑，210mg(1.5mM)3，4—二羟基苯甲醛和4滴溶于30ml乙醇中的哌啶回流6小时。冷却并过滤得到145mg黄色固体。蒸发溶剂并用CH2Cl2—丙酮研制得到另外145mg黄色固体(56％产率)。产物具有147℃的熔点。

    NMR丙酮d6δ—7.87(1H，S，乙烯基)，7，68(1H，d，J＝2.2Hz，H2)7.66—7.45(5H，m，Ph)，7，28(1H，dd，J＝8.3.2.2Hz，H6).6.92(1H，d，J＝8.3Hz，H5)。C11

    C11用两步方法合成。

    a.合成3—氨基—4—氰基—5—氰甲基—2—吡唑：

    将2.2g丙二晴二聚物和于20ml水中的0.9ml N2H4在100℃加热15分钟。冷却并过滤得到1.5g(61％产率)熔点为187℃的白色固体。(NMR丙酮—d6δ3.88(s).)(参见Carboni等人，J.Am.Chem.Soc.80：2838(1958)，报道m.p.197℃)。

    b.与二羟基苯甲醛缩合：

    往0.28g(2mM)3，4—二羟基苯甲醛和1.33g(2.2mM)于20ml乙醇中的3—氨基—4—氰基—5—氰甲基—2—吡唑中加入三滴哌啶，反应混合物回流3小时。冷却，过滤并用乙醇洗涤得到1.3g(56％产率)，熔点为300℃的黄色固体。C13

    将0.7g，3mM，3，5—二叔丁基—4—羟基醛，0.46g，3.1mM，3—氨基—4—氰基—5—氰甲基吡唑(根据Carboni等人，J.Chem.Soc.，80：2838，1958制备)和40mg β—苯胺回流15小时。冷却并过滤得到0.5g，46％产率，黄色固体，mp.255℃。NMR CDCl3δ7.92(1H，S，乙烯基)，7.80(2H，S)，5.76(1H，S，OH)，3.75(2H br，S，NH2)，1.48(18H，S).MS—364(M+1，28)，363(M+，100％)，348(MCH3，58)，292(M—56—CH3，31)，147(41)，m/e。

                     第4组化合物D11

    将435mg(3mM)3—甲酰基吲哚，300mg(4.5mM)2—硫代氨甲酰乙腈和20mg β—苯胺(于30ml乙醇中)回流六小时。冷却并过滤得到0.47g(81％产率)具有238℃熔点的黄色固体)。D12

    如D11的合成，所不同的是用1，1，4—三氰基—2—氨基—1—丙烯代替乙腈衍生物。最终产物熔点293℃。D13

    如D11的合成，只是用2—氨基甲酰基乙腈代替乙腈衍生物。最终产物熔点242℃。D14

    将0.29g(2mM)3—甲酰基吲哚，0.29g(2mM)，3—氨基—4—氰基—5—氰甲基—2—吡唑和20mgβ—苯胺(于30ml乙醇中)回流4小时。冷却并过滤得到0.34g(62％产率)熔点为281℃的黄色固体。

    NMR丙酮d68.52(1H，S，乙烯基1)，8.42(1H，S，H2)，7.79(1H，m)，7.57(1H，m)，7.27(2H，m)，6.17(1H，br，S，NH)。MS—274(M+，100％)，219(14)，91(35)，m/e。D15

    0.3g(1.3mM)3—氨基—4—氰基—5—氰甲基—2—吡唑，0.2g(1.36mM)1—(3—二甲基氨基丙基)—3—甲酰基吲哚和20mgβ—苯胺在20ml乙醇中回流4小时。蒸发，用苯研制并过滤，得到0.4g黄色固体(94％产率)，含10％3—氨基—4—氰基—5—氰甲基—2—吡唑。0.4g用硅胶(70—220目)层析，用85∶15二氯甲烷∶甲醇洗脱得到0.12g熔点为250℃的亮黄色固体。NMR丙酮d68.45(1H1S1，乙烯基)，8.37(1H1S1，H2)，7.78(1H1，m)，7.60(1H1，m)，7.28(2H1，m)，4.47(2H1t1J＝6.8Hz)，2.29(2H1t1J＝6.8Hz)，2.24(6H，S，N—(CH3)2).MS—360(M+1，8％)，359(M+，31)，289(100)，261(15)，144(6)，m/e。D16

    将0.4g(1.7mM)3—氨基—4—氰基—5—氰甲基—2—吡唑，0.3g(1.73mM)1—氧代—1—(3，4—二羟基苯基)—2—氰基乙烷和20mgβ—苯胺在20ml乙醇中回流5小时。冷却并过滤得到0.1g褐色固体。制备性色谱得到20mg(3％产率)熔点为115℃的橙色固体。

    NMR丙酮d6δ8.72(1H，S，乙烯基)，8.52(1H1，S1，H2)，7.90(1H1，m)，7.73(1H，m)，7.40(4H，m)，7.0(1H，d，J＝8.2Hz，H5)，4.57(2H，t，J＝7.2Hz)，2.46(2H，t，J＝7.2Hz)，2.34(6H，S，N(CH3)2)，2.17(2H，五重峰，J＝7.2Hz)。D17

    0.4g(2mM)3—甲酰基吲哚，0.36g1—氧代—1—(3，4—二羟基苯基)—2—氰基乙烷和3滴哌啶，在25ml乙醇中，回流6小时。用苯处理和研制得到0.36g熔点为225℃的黄色固体。NMR丙酮d68.77(1H，S)，7.90(1H，m)，7.70(1H，m)，7.40(4H，m)，7.0(2H，t，J＝6.7Hz)，4.92(2H，t，J＝6.8Hz)，3.26(2H，t，J＝6.8Hz)。D18

    0.29g，2mM，3—甲酰基吲哚，0.29g，2mM，3—氨基—4—氰基—5—氰甲基—2—吡唑，和20mgβ—苯胺在30mg乙醇中回流4小时。冷却和过滤得到0.34g，62％产率，黄色固体，mp.281℃。NMR丙酮d6δ8.52(1H，S，乙烯基)，8.42(1H，S，H2)，7.79(1H，m)，7.75(1H，m)，7.27(2H，m)，6.17(1H，Br，S，NH)，MS—274(M+，100％)，219(14)，91(35)，m/e.D20

    80mg，0.55mM，3—甲酰基吲哚，130mg，0.6mM，3—氨基—4—氰基—5—氰甲基—1—苯基吡唑和2滴哌啶于10ml乙醇中回流8小时。冷却并过滤得到120mg，62％产率，黄绿色固体，m.p.258℃。NMR丙酮d6δ8.56(1H，S)，8.52(1H，S)，7.84(1H，m)，7.60—7.25(8H，m).

                       第5组

    第5组化合物以三步制备。

    a)N—芳基—草氨酸酯(＝乙基—草酰基苯胺化物)的制备：

    0.025mol(3.4ml)草酸二乙酯和0.1mol适当的苯胺混在一起并在190℃回流15分钟。产生的溶液冷却并放置过夜使产物结晶。滤出晶体，用乙醇洗涤并用热乙醇萃取。滤除不溶物，溶液放入冰箱内。产生的晶体过滤并干燥。

                                  表XXVIII

       No.   取代基    MP℃    分子式MW 产率[％]   1a 4—N(CH3)2  116—118 C12H16N2O3236.27    75   1b    3—OH  184—185 C10H11NO4209.20    86   1c   2—OCH3   81—82 C11H13NO4223.23    60   1d   2—OC2H5   74—76 C12H15NO4237.26    64   1e   3—NO2   93—96 C10H10N2O5238.20    53

    b)N—芳基—草氨酸酰肼(N—芳基—草氨酰基酰肼)的制备

    将0.05mol适当的N—芳基—草氨酸酯(1a…1e)溶于200m1乙醇中并慢慢加到充分搅拌的7.5ml(～0.15mol)水合肼于50ml乙醇中的溶液中。混合物在室温放置48小时。产生的非均相溶液回流15分钟并过滤热溶液。冷至室温后，过滤沉淀物，用乙醇洗涤并干燥。                                 表XXIX

       No.   取代基   MP℃    分子式     MW 产率[％]   2a 4—N(CH3)2 228—232 C10H14N4O2 222.25    83   2b   3—OH 200—202 C8H9N3O3 195.18    72   2c  2—OCH3 165—167 C9H11N3O3 209.21    67   2d  2—OC2H5 152—154 C10H13N3O3 223.23    58   2e   3—NO2 231—234 C8H8N4O5 224.18    49

    c)N—芳基—草氨酰基腙的制备：E10

    0.001mol(0.222g)N—(4—二甲氨基)苯基草氨酰基酰肼(2a)溶于5ml乙酸中，并于100℃，在催化量乙酸钠存在下与0.001mol(0.138g)3，4—二羟基苯甲醛加热20—25分钟。反应混合物然后冷却并放置过夜。滤出分离的晶体并用乙酸和水洗涤。

    纯产品的产率为0.23g(68％)，m.p.253℃。(C17H18N4O4，MW：342.36)元素分析[％]：实测C，59.51；H，5.28，N，16.25              计算C，59.64；H，5.30，N，16.37。E11

    0.001mol(0.195g)N—3—羟基苯基草氨酰基酰肼(2b)溶于5ml乙酸中，并于100℃在催化量的乙酸钠存在下与0.001mol(0.138g)3，4—二羟基苯甲醛加热20—25分钟。混合物然后冷却并在室温过夜。滤出析出的晶体并用乙酸和水洗涤。

    纯产品的产率为0.142g(45％)m.p.＞260℃。

    (C15H13N3O5，MW：315.29)

    元素分析[％]：实测C，57.06；H，4.10；N，13.20

                  计算C，57.14；H，4.16，N，13.33。E12

    0.001mol(0.195g)N—3—羟基苯基草氨酰基酰肼(2b)溶于5ml乙酸中，并于100℃在催化量的乙酸钠存在下与0.001mol(0.122g)2—二羟基苯甲醛加热20—25分钟。将混合物冷却并在室温过夜。滤出析出的晶体并用乙酸和水洗涤。

    纯产品的产率为0.224g(75％)m.p.264—266℃。

    (C15H13N3O4，MW：299.29)

    元素分析[％]：实测C，60.11；H，4.40；N，13.76

                  计算C，60.20；H，4.38；N，14.04。F13

    0.001mol(0.21g)N—2—甲氧苯基草氨酰基酰肼(2c)溶于5ml乙酸中，并于100℃在催化量的乙酸钠存在下与0.001mol(0.138g)3，4—二羟基苯甲醛加热20—25分钟。混合物然后冷却并室温过夜。滤出析出的晶体并用乙酸和水洗涤。

    纯产品的产率为0.21g(64％)m.p.232—238℃。

    (C16H15N3O5，MW：329.31)

    元素分析[％]：实测C，60.01；H，4.51；N，12.59

                  计算C，58.36；H，4.59；N，12.72。E14

    0.001mol(0.22g)N—2—乙氧苯基—草氨酰基酰肼(2d)溶于5ml乙酸中，并于100℃在催化量的乙酸钠存在下与0.001mol(0.138g)3，4—二羟基苯甲醛加热20—25分钟。混合物然后冷却并室温过夜。滤出析出的晶体并用乙酸和水洗涤。

    纯产品的产率为0.15g(44％)m.p.208—214℃。

    (C17H17N3O3，MW：343.34)

    元素分析[％]：实测C，59.78；H，4.81；N，12.10

                  计算C，59.47；H，4.99；N，12.24。E15

    0.001mol(0.22g)N—3—硝基苯基—草氨酰基酰肼(2e)溶于5ml乙酸中，并于100℃在催化量的乙酸钠存在下与0.001mol(0.138g)3，4—二羟基苯甲醛加热20—25分钟。混合物然后冷却并室温过夜。滤出析出的晶体并用乙酸和水洗涤。

    纯产品的产率为0.19g(56％)m.p.＞260℃。

    (C15H12N4O6，MW：344.286)

    元素分析[％]：实测C，52.08；H，3.47；N，16.10

                  计算C，52.32；H，3.51；N，16.27。E16

    0.001mol(0.22g)N—3—硝基苯基草氨酰基酰肼(2e)溶于5ml乙酸中，并于100℃在催化量的乙酸钠存在下与0.001mol(0.122g)4—羟基苯甲醛加热20—25分钟。混合物然后冷却并温室过夜。滤出析出的晶体并用乙酸和水洗涤。

    纯产品的产率为0.19g(61％)m.p.＞260℃。

    (C15H12N4O5，MW：328.29)

    元素分析[％]：实测C，54.80；H，3.59；N，16.86

                  计算C，54.88；H，3.68；N，17.07。

                       第6组化合物F10

    F10可用两步路线制备

    a)2—甲基—3—羟乙基喹唑啉—4—酮的制备：

    1.37g(0.01mol)邻氨基苯甲酸与8ml乙酐回流3小时。形成的乙酸在大气压下连续蒸出。乙酸形成结束后，混合物真空蒸发至干。产生的油状物与2ml乙醇胺混合并在160℃加热3小时，反应完成后，将物质冷却，与醇混合物并室温过夜。过滤收集沉淀的晶体。m.p.159—60℃；1.40g(65％)。

    步骤b

    1.08g(0.005mol)2—甲基—3—羟乙基喹唑啉—4—酮和0.69g 3，4—二羟基苯甲醛在160℃稠合并再加热30分钟。产生的物质溶于异丙醇，活性碳脱色并室温过夜。沉淀的晶体过滤并干燥。纯产品的产量为0.79g(49％)m.p.221—223℃。(C18H16N2O4，MW：324.34)，元素分析[％]：实测C，66.48；H，4.86；N，8.62。计算C，66.66；H，4.97；N，8.64。F11和F12

    1.01g(5mmol)3，4—二氢—1，4—恶嗪并[3，4—b]喹唑啉—6—酮与6mmol相应的苯甲醛衍生物在油浴上于100—200℃稠合。除去反应的水之后，所得混合物溶于乙醇并用活性碳净化。蒸发溶剂，产品重结晶。

    对于F11的制备，用3，4—二羟基苯甲醛得到熔点为290—292℃的产物(85％产率)。

    对于F12的制备，用3—羟基苯甲醛得到熔点为208—214℃的产品(63％产率)。

                         第7组化合物苯甲酰基羟亚氨基乙基乙酸酯

    在冰冷却下，往10g于20ml乙酸中的苯甲酰基乙基乙酸酯中加入3.7gNaNO2。10分钟后加入5ml水。3小时后加入100ml水，滤出固体7.7g，84％产率，mp.110℃。NMR CDCl3δ7.90(2H，m)，7.6—7.5(3H，m)，4.30(2H，q，J＝7.4Hz)，1.24(3H，t，J＝7.4Hz)。2—乙氧羰基—6，7—二甲基—3—苯基喹喔啉

    将5g，22.6mM苯甲酰基羟亚氨基乙基乙酸酯和3.1g，22.8mM，4，5—二甲基—1，2—苯二胺在20ml乙醇和5ml HCl中回流6小时。用H2O，NaHCO3，CH2Cl2处理，层析并用己烷研制，得到2g，29％产率，白色固体，mp.100℃。NMR CDCl3δ7.96(1H，S)，7.93(1H，S)，7.7(2H，m)，7.5(3H，m)4.30(2H，q，J＝7.0Hz)，2.53(6H，S)，1.17(3H，t，J＝7.0Hz)。6，7—二甲基喹喔啉—2—酮

    将2g，15mM，4，5—二甲基—1，2—二氨基苯和1.5g，16mM，水合乙醛酸在30ml乙醇中回流2小时。冷却并过滤得到1.2g，46％产率，白色固体mp.263℃，S1溶于丙酮。

    NMR DMSO d6 δ60∶40混合物

    主要的—8.07(1H，S)，7.55(1H，S)，7.06(1H，S)，2.30(6H，S)。次要的—8.02(1H，S)，7.42(1H，S)，7.28(1H，S)，2.28(6H，S)。备注—4.1g反应得到3g，57％。2—氯—6，7—二甲基喹喔啉

    将1.1g，6.2mM，6，7—二甲基喹喔啉—2—酮，1mlPOCl3和1ml二甲基苯胺在20ml甲苯中回流2小时。处理(NH3，CH2Cl2)并层析得到0.4g，33％产率，白色固体，mp.86℃。NMR CDCl3 δ8.68(1H，S，H2)，7.85(1H，S)，7.76(2H，S)，2.50(6H，S).G10

    将0.4g(4mM)苯二胺和0.6g(4mM)苯基乙二醛一水合物于20ml乙醇，和10ml乙酸中回流3小时。用50mlH2O和80ml CH2Cl2处理，接着用己烷研制得到0.38g(46％产率)熔点为65℃的白色固体。NMR(CDCl3δ9.44(1H，S)，8.1(4H，m)，7.8(2H，m)，7.6(3H，m).MS—206(M+，100％)，179(M—HCN，25)，152(37)，103(M—Ph—CN，42)，m/e。G12

    往3ml MDF和16ml POCl3中加入2.7g(10mM)N—(3，4—二甲氧基苯基)苯乙酰胺。反应在90℃加热4小时，倾在冰上，过滤并用水洗得到2.9g(96％产率)熔点为234℃的白色固体。NMR CDCl3)：δ8.26(1H，S，h4)，8.0(1H，s，H8)，7.15(5H，s Ph)，7.15(1H，s，h5)，4.13，4.05(6H，2s OCH3).MS：301，299(M+，33％，100％)，286，284(M—CH3，2％，6％)，258，256，(6％，18％)，220(9％)，215，213(4％，13％)，m/e。G11

    此化合物通过用于G12的方法合成，只是反应物N—(3，4，5—三甲氧基苯基)苯乙酰胺被取代。最终产物熔点为103℃。G13

    将2.3g(16mM)水合苯基乙醛酸和2.2g(16mM)3，4—二甲基—1，2—苯二胺在20ml乙醇中回流1.5小时。冷却并过滤得到3.25g(88％产率)熔点为124℃的白色固体。NMR CDCl3δ9.23(1H，S，H2)，8.19(1H，d，J＝1.6H2)，8.15(1H，d，J＝1.7H2)，7.90(2H，d，J＝9.0H2)，7.57(3H，m)2.52(6H，S，CH3).MS—234(M+，100％)，219(M—CH3，11)，207(M—HCH，12)，165(M—2HCN—CH3，2)，131(M—ph—CN，3)，m/e。G14

    7g藜芦醚(51mM)被加到19ml冰冷的70％HNO3中。冷却0.5小时后，0.5小时内慢慢加入10ml H2SO4。所得深色悬浮液在室温搅拌3小时，将冰和水加到悬浮液中沉淀产物。过滤，水洗并干燥得到10.2g(96％产率)黄色固体，熔点120℃(NMR CDCl3δ7.35(2H，S)，4.06(6H，OCH3))。(参见：J.Org，Chem.12：522(1947)，报导的mp.130℃，而J.Med，Chem.36：331(1993)报导的mp.122℃。此化合物由Lancaster Co.出售，(报导的mp 101℃)。

    2g 1，2—二硝基—4，5—二甲氧基苯用0.3g PtO2氢化1小时，然后过滤并蒸发得到1.5g黑色固体(参见J.Med.Chem.36：331(93)，报道为红褐色固体，mp.151℃)。黑色固体与1.3g苯基乙二醛，15ml绝对乙醇和15ml浓HCl混合并回流5小时。如G10处理，得到深色固体，将其用乙醇重结晶得到0.72g(31％产率)白色固体，熔点134℃。NMR CDCl3δ9.13(1H，S，H2)，8.16(1H，d，J＝1d.6H2)，7.60—7.40(5H，m)，4.09(6H，S，OCH3).MS—266(M+，100％)，251(M—CH3，12)，223(M—CH3—CO，13)，196(M—CH3—CO—HCN，5)，m/e。G15

    噻吩—2—乙二醛—双—硫代半卡巴腙(3.4mM)和0.6g(4mM)邻苯二胺在15ml乙酸中回流6小时。真空蒸去溶剂，残余物溶于CH2Cl2并用H2O洗。有机层真空蒸发，残渣用苯—己烷研制得到白色固体(23％产率)mp.104℃。NMR(CDCl3)：δ9.25(1H，d，H2)，8.07，7.72(4H，m，H5—8)，7.85，7.56，7，21(3H，m.噻吩)。MS：212(M+，100％)，185(M—HCN，25％)，141(6％)，106(8％)，m/e。G16

    2，3—二氨基吡啶和苯基乙二醛如对G13的反应，得到白色固体(77％产率)，熔点135℃。NMR CDCl3δ9.25(1H，S.H2)，9.21，8.50，7.71(8线ABC m，H7，H5，H6)，8.35(2H，m，Ph)，7.60(3H，m).MS—207(M+，100)，180(H—HCN，8)，179(11)，104(23)，77(14)，m/e.CDCl3δ7.67(1H，dd)，6.89(dd)，6.62(dd)，4.25，3.30(br.S.).G17

    G17以如下两步合成：

    a.2—甲氧基—4，5—二硝基本酚的合成

    3.3g1，2—二甲氧基—4，5—二硝基苯在20ml 48％HBr中回流16小时。加入水，反应用CH2Cl2提取得到1.1g橙色固体。硅胶层析，用含2％CH3OH的CH2Cl2洗脱得到0.42g(13％产率)黄色固体，与KOH一起变红。NMR(CDCl3)：δ7.44(1H，s)，7.42(1H，s)，6.30(1H，s)，4.07(3H，s).

    用乙酸乙酯提取水相得到2g红色油状物。硅胶层析，用含5％CH3OH的CH2Cl2的洗脱得到0.1g(3.5％产率)黄色固体，熔点160℃，与KOH呈紫色，对应于1，2—二羟基—4，5—二硝基苯。NMR(丙酮—d6)δ7.51(2H，s)。

    b.还原并与苯基乙二醛缩合

    0.2g2—甲氧基—4，5—二硝基苯酚用Pd/C在20ml乙醇中氢化1小时。滤掉Pd，加入0.3g苯基乙二醛，将反应回流3小时。蒸发并用硅胶层析，用含1％CH3OH CH2Cl2的洗脱得到0.1g橙色油。NMR(CDCl3)：δ8.10，7.6(7H，m)，3.54(3H，s)。G18将0.56g(4mM)，4，5—二甲基—1，2—二氨基苯和0.6g(4mM)苯甲酰基甲酸在15ml乙醇中回流5小时。冷却并过滤得到0.8g(80％产率)黄色固体，熔点275℃。NMR(CDCl3)：δ8.38(2H，m)，7.51(3H，m)，7.70(1H，s)，7.06(1H，s)2.40(3H，s)，2.37(3H，s).在8.38ppm处照射，于7.51ppm处得到单峰。G19

    3，4—二氨基甲苯和苯基乙二醛如G13反应得到浅褐色固体(31％产率)，熔点114℃。NMR CDCl3δ9.29，9.26(2S，2：1，H2)，8.2，8.17(2br.S)，8.07—7.90(3H，m)，7.60(3H，m)，2.62(3H，s).G20

    0.15g G14在5ml 48％HBr中回流23小时。冷却并过滤得到95mg(53％产率)黄绿色固体，对应于喹唑啉衍生物的HBr盐，mp280℃。HBr用元素分析确定。NMR(DMSO—d6)：δ9.25(1H，s，H2)，8.24(1H，d，J＝1.9Hz)，8.20(1H，d，J＝1，9Hz)，7.50(3H，m)，7.35(2H，m).

    母液用NaHCO3中和。用EtOAc提取得到20mg(15％产率)橙色固体，mp305℃，相当于游离臧。NMR(丙酮d6)：δ9.19(1H，s，H2)，8.29(1H，d，J＝1.5Hz)，8.25(1H，d，J＝1.5Hz)，7.60(3H，m)，7.40(2H，m).MS：238(M+，54％)，211(M—HCN，10％)，154(7％)，108(1，2—苯醌，100％)，m/e。G21

    4—苯甲酰基—1，2—苯二胺和苯基乙二醛如G13反应得到白色固体(69％产率)，熔点133℃。NMR：CDCl1δ9.40(1H，S，H2)，8.49(1H，S，H5)，8.27(4H，br，S，H7，8H2，｀6′)，7.90(2H，d，J＝7.6H2)，7.60(6H，m).G22

    将0.47g(3mM)2，3—二氨基苯和0.47g水合苯基乙二醛在20ml乙醇中回流1.5小时。冷却并过滤得到0.5g(65％产率)浅褐色固体，熔点163℃。NMR：CDCl3δ9.38(1H，S，H2)，8.71，8.67(2H，2d，H5，10)，8.25，8.10(4H，AA′BB′m.，H6.9)，7.58(5H，m，Ph)，MS—256(H+，100％)，229(H—CN，12％)，126(71)，m/e 。G23

    将0.6g，4mM，苯基乙二醛和0.6g，4mM，4—硝基苯二胺在15ml乙醇中回流1.5小时。冷却并过滤得到0.9g，90％产率，白色固体，mp203℃。NMR：CDCl3δ9.49(1H，S，H2)，9.02(2H，d，J＝2.5Hz，Hs)，8.54(1H，dd，J＝9.2，2.5Hz，H7)，8.27(3H，m，Ph＋H7)，7.60(3H，m，Ph)。G24

    将1.4g，10.3mM，4，5—二甲基—1，2—苯二胺和1.9g，10.2mM，α—氯—3，4—二羟基—苯乙酮在25ml乙醇中回流2小时。冷却并过滤得到0.76g，18％产率，深黄色固体，mp278℃，为HCl盐。G25

    2.4g2—乙氧羰基—6，7—二甲基—3—苯基喹喔啉和5g KOH于20ml乙醇和20mlH2O中，在室温搅拌20小时。用HCl酸化，过滤并用水洗涤得到2.1g，96％产率，浅黄色固体，mp153℃。NMR丙酮d6δ7.92(1H，S)，7.90(1H，S)，7.85(2H，m)，7.50(3H，m)，2.56(6H，S).G27：2—(4—硝基苯基)—6，7—二甲基喹喔啉1.4—硝基苯基乙二醛

    6.60g(40mmol)4—硝基苯乙酮溶于30ml二恶烷，5g(45mmol)二氧化硒溶于2.2ml水，两者混合。混合物在连续搅拌下回流16小时。反应混合物通过氧化铝柱以除去硒。真空蒸发溶剂。粗产物不经进一步纯化用于下步。Rf0.80(EtOAc)Y：7.00(85％)    IR(cm-1)：1730(CO)，1520，1330(NO2)2.2—(4—硝基苯基)—6，7—二甲基喹喔啉

    0.50g(3mmol)4—硝基苯基乙二醛溶于20ml乙醇中，0.34g(2.5mmol)1，2—二甲基—4，5—二氨基苯溶于乙醇中。反应混合物搅拌回流1小时。冷却后产品结晶，过滤，用乙醇，然后乙醚洗涤。G28

    G28可用下面对G29所述的方案生产，只是用了3—溴苯胺代替间碘苯胺。G29

    150mg，0.8mM，2—氯—6，7—二甲基喹喔啉和0.8g，3.6mM，间碘苯胺在100℃加热3.5小时。层析得到100mg，35％产率，黄色固体，mp185℃.NMR CDCl3δ8.33(1H，S)，8.22(1H，m)，7.7(2H，m)，7.40(1H，m).7.10(2H，m)，2.45(3H，S)，2.43(3H，S).G30

    210mg，1.1mM，2—氯—6，7—二甲基—喹喔啉和0.8g，3.6mM，对碘苯胺在100℃加热4小时。层析得到245mg，60％产率，浅绿色固体，mp228℃。NMR，CDCl3δ8.32(1H，S)，7.67(1H，S)，7.64(H，S)，7.68，7.56(4H，ABq，Jab＝9.0Hz).

                        第8组H10

    0.01mol(1.07g)苄胺和0.01mol(1.38g)3，4—二羟基苯甲醛混合于15ml乙醇中并在水浴上回流15分钟，然后加入0.01mol(3.44g)2—(1′—对甲苯磺酰氧乙基)喹唑啉—4—酮和1滴吡啶，混合物回流6小时。将所得溶液蒸发并用5％碳酸氢钠水溶液提取。滤出保留的晶体，水洗并用异丙醇重结晶。产量：3.07g(77％)mp：209—211℃，分子式：C24H21N3O3元素分析[％]计算：C：72.17 H：5.30 N：10.52实测：C：72.12 H：5.26 N：10.46H11

    0.01mol(1.07g)苄胺和0.01mol(1.22g)水杨醛混合在15ml乙醇中，并在水浴上回流15分钟，然后加入O.01mol(3.44g)1—(1′—对甲苯磺酰氧基乙基)喹唑啉—4—酮和1滴吡啶并将混合物回流6小时。将所得溶液蒸发并用5％碳酸氢钠水溶液提取。滤出保留的晶体，水洗并用异丙醇重结晶。产量：2.99g(78％)mp：189—192℃分子式：C24H21N3O2元素分析[％]计算：C：75.18 H：5.52 N：10.96实测：C：75.09 H：5.49 N：1O.90H12

    0.01mol(1.07g)苄胺和O.01mol(1.22g)3—羟基苯甲醛混合在15ml乙醇中，并在水浴上回流15分钟，然后加入0.01mol(3.44g)2—(1′—对甲苯磺酰氧基乙基)喹唑啉—4—酮和1滴吡啶并将混合物回流6小时。将所得溶液蒸发并用5％碳酸氢钠水溶液提取。滤出保留的晶体，水洗并用异丙醇重结晶。产量：2.72g(71％)M.p.：184—185℃分子式：C24H21N3O2元素分析[％]计算：C：75.18 H：5.52 N：10.96实测：C：75.02 H：5.45 N：11.08H13

    0.01mol(1.07g)苄胺和0.01mol(1.22g)3—羟基苯甲醛混合在15ml乙醇中，并在水浴上回流15分钟，然后加入0.01mol(3.44g)2—(1′—对甲苯磺酰氧基乙基)喹唑啉—4—酮和1滴吡啶并将混合物回流6小时。将所得溶液蒸发并用5％碳酸氢钠水溶液提取。滤出保留的晶体，水洗并用异丙醇重结晶。以下重复H12相应段落，只是将其中的“3—”改为“4—”产量：3.40g(89％)mp：217—219℃分子式：C24H21N3O2元素分析[％]计算：C：75.18 H：5.52 N：10.96实测：C：75.26 H：5.47 N：10.88H14

    0.01mol(1.07g)苄胺和0.01mol(1.54g)3，4，5—三羟基苯甲醛混合在15ml乙醇中，并在水浴上回流15分钟，然后加入0.01mol(3.44g)2—(1′—对甲苯磺酰氧基乙基)喹唑啉—4—酮和1滴吡啶并将混合物回流6小时。将所得溶液蒸发并用5％碳酸氢钠水溶液提取。滤出保留的晶体，水洗并用异丙醇重结晶。产量：3.36g(81％)mp：223—225℃分子式：C24H21N3O4元素分析[％]计算：C：69.39 H：5.10 N：10.11实测：C：69.51 H：5.07 N：10.08

                             第9组I10

    将5ml乙醇中的0.3g(2mM)5—甲酰基吲哚和0.4g(2mM)，2—氰基—H—(1—(+)—苯乙基)乙酰胺和2滴哌啶回流3小时。加入水和HCl，用乙酸乙酯提取反应得到粘性油。硅胶层析得到0.42g(66％产率)米黄色固体，熔点76℃。MS—315(M+，24％)，196(M—NCH(CH3)C6H5，22)，195(25)，188(21)，173(24)，168(13)，149(57)，145(100)，134(92)，116(53)，m/e。

                             第10组H10

    将230mg，1.06mM，5—溴—3，4—二羟基苯甲醛，76mg，0.53mM，二乙腈砜和10mg β—苯胺于10ml乙醇中回流5小时。冷却并过滤得到220mg，76％产率，橙色固体，mp＞300℃。NMR丙酮d6δ8.18(2H，S，乙烯基)，7.90(2H，d，J＝1.6Hz)，7.78(2H，d，J＝1.6Hz).J11：2—(3—溴—4，5—二羟基苯基)—1—氰基—1—氰甲基磺酰基乙烯

    500mg 5—溴—3，4—二羟基苯甲醛和700mg二乙腈基砜在6ml乙醇中与几滴哌啶回流4小时。乙醇在旋转蒸发器中除去，混合物用乙酸乙酯、稀酸和盐水处理。粗产物的一部分然后用HPLC在C—18柱上纯化产生约50mg2—(3—溴—4，5—二羟基苯基)—1—氰基—1—氰甲基磺酰基乙烯。

                            第11组6，7—二甲氧基喹唑啉—4—酮

    7g 4，5—二甲氧基—2—氨基苯甲酸和8ml甲酰胺在170℃加热。加入冷水并滤出固体得到0.9g，12％产率，浅褐色固体，mp.308℃。NMR—DMSO d6δ8.0(1H，S)7.43(1H，S)，7.12(1H，S)3.89(3H，S)，3.85(3H，S).4—氯—6，7—二甲氧基喹唑啉

    0.8g，6，7—二甲氧基喹唑啉—4—酮，1ml POCl3和1ml二甲基苯胺在20ml甲苯中回流3.5小时。用己烷处理并研制得到浅灰色固体，0.5g，57％产率，mp.188℃。NMR CDCl3δ8.88(1H，S)，7.41(1H，S)，7.36(1H，S)，4.09(3H，S)，4.08(3H，S)。P10

    0.3g，1.4mM，3，4—二羟基—5—溴苯甲醛，0.15g，0.7mM，N—3—氰甲基羰基氨基—N—丙基氰基乙酰胺，和25mgβ—苯胺于20ml乙醇中回流3小时。冷却并过滤得到0.24g，57％产率，黄色固体，mp282℃。P12：噻吩—2—羧酸(3，5—二—(三氟甲基)苯胺化物

    0.45ml(2.9mmol)3，5—二—(三氟甲基)苯胺溶于5ml绝对吡啶中，然后冷却至10℃。连续搅拌下滴加0.12ml(1.5mmol)三氯化磷。0.5小时后加入0.51g(4mmol)噻吩—2—羧酸，并在室温下搅拌12小时。真空蒸发溶剂，经残余物中加入1NHCl并用乙酸乙酯提取。乙酸乙酯溶液用碳酸氢钠溶液提取，硫酸钠干燥，过滤并蒸发。产物用乙醚研制，过滤并真空干燥。m.p.：145—147℃Rf：0.80(己烷—EtOAc＝1∶1)y：0.62g(80％)IR(cm-1：3280(N—H)；1640(CONH)；1560(Car)；1130(C—F)P13

    3g，20.1mM，3—甲基异喹啉在20ml乙酸中和5ml30％H2O2在70℃加热14小时。将水加入冷却过的溶液，碳酸氢盐中和。用CH2Cl2提取并用己烷研制得到1.9g，57％产率，白色固体，mp128℃。(J.O.C.，21：1337(1956)，mp138℃)。NMR CDClδ8.86(1H，S)，7.70—7.50(5H，m)，2.64(3H.S)。P14

    a.0.04g，1.8mM，，4—氯—6，7—二甲氧基喹唑啉和0.19g，2mM，苯胺在15ml乙醇中回流1小时。冷却并过滤得到0.445g，78％产率，浅黄色固体，mp268℃，为HCl盐P14a。

    b.游离碱—0.35g P14a用H2O—Na2CO3处理并用CH2Cl2提取得到0.13g，42％产率，白色固体，mp241℃。NMR CDCl3δ8.66(1H，S，H2)，7.67(1H，S)，7.63(1H，S)，7.4—7.14(5H，m)，3.96(3H，S)，3.93(3H，S).P15：1—(2—氯苯基亚甲基)—3—(3—甲氧基正丙基)—2，4—噻唑烷二酮

    400mg 3—(3—甲氧基正丙基)—2，4—噻唑烷二酮和260mg 2—氯苯甲醛于4ml乙醇的溶液与1滴哌啶回流4小时。然后将混合物用乙酸乙酯和水处理。粗产物用硅胶柱(5％甲醇于二氯甲烷中)纯化得到200mg 1—(2—氯苯基亚甲基)—3—(3—甲氧基正丙基)—2，4—噻唑烷二酮。(P15也可从Aldrich Chemical得到)。P16

    0.69g，2.5mM，5—碘香草醛，N—3—苯基—N—丙基氰基乙酰胺(如Gazit等人，J.Med.Chem 34：1896，1991所述制备)和50mg β—苯胺在30ml乙醇中回流5小时。蒸发得到油状物，将其用苯—己烷研制得到亮黄色固体，0.82g，71％产率。mp.83℃NMR CDCl3δ8.12(1H，S)，7.75(1H，d，J＝2.0Hz)，7.68(1H，d，J＝2.0Hz)，7.30—7.10(5H，m)，3.96(3H，S，O，CH3)，3.45(2H，q，J＝6.0Hz)，2.70(2H，t，J＝6.0Hz)，1.95(2H，quin，J＝6.0Hz).MS—462(M+，53)，357(M—CH2)3Ph，18)，335(M—I，100)，327(M—NH(CH2)3ph，31)，m/e。P17

    a.0.4g，1.8mM，4—氯—6，7—二甲氧基喹唑啉和0.24g，2mM，二氢吲哚在10ml乙醇中回流2小时，冷却并过滤得到0.46g，74％产率，黄色固体(P17a)，mp.238℃。

    b.游离碱—0.3g AG P17a用H2O—Na2CO3处理并用CH2Cl2提取得到0.13g，48％产率，白色固体，mp.158℃。

    NMR CDCl3δ8.79(1H，S，H2)，7.30(1H，S)，7.28(1H，S)，7.14—6.80(4H，m)，4.36(2H，t，J＝7.6Hz)，4.06(3H，S，OCH3)，3.85(3H，S，OCH3)，3.22(2H，t，J＝7.6Hz).P18：1—氰基—2—(3—乙氧基—4—羟基苯基)—1—甲氧羰基乙烯

    20g 3—乙氧基—4—羟基苯甲醛和13g氰基乙酸甲酯的混合物在100ml乙醇中与1ml哌啶回流4小时。使粗混合物冷至室温，并在搅拌下加水直至固体开始形成。然后将此混合物冷冻4小时并抽滤固体，用冷的乙醇和水的混合物(1∶2)洗涤，抽干得到25g 1—氰基—2—(3—乙氧基—4—羟基苯基)—1—甲氧羰基乙烯。P19：N—2—氯苯基—(2—氰基—2—N—吗啉基羰基)硫代乙酰胺

    在0℃将680mg乙醇钠加到1.5g N—吗啉基氰基乙酰胺于20ml四氢呋喃的溶液中。此混合物在0℃搅拌1小时，并滴加5ml四氢呋喃中的1.7g 2—氯苯基异硫氰酸酯。加完后，混合物温热至室温并在50℃加热6小时。冷却，除去所有乙醇，所得固体悬浮于10ml水中。然后加入3m11N氢氧化钠溶液，剧烈摇动并用50ml乙醚洗涤。水层然后用1N盐酸酸化直至pH1。然后抽滤收集固体。产生750mg N—2—氯苯基—(2—氰基—2—N—吗啉基羰基)硫代乙酰胺。(P19也可从Ryan Scientific得到)。P20：N—2—氯苯基—(2—氰基—2—N—3—三氟苯基氨基羰基)硫代乙酰胺

    P20用与P19所述相似的条件合成，但开始用N—3—三氟甲基苯基氰基乙酰胺。(P20也可从Ryan Scienfific得到)P21：N—3—甲氧基苯基—(2—氰基—2—N—吡咯烷基羰基)硫代乙酰胺

    P21用与P19所述相似的条件合成，但开始用N—吡咯烷基氰基乙酰胺和3—甲氧基苯基异硫氰酸酯作试剂。(P21也可从Ryan Scientific得到)。P22：N—4—三氟甲基苄基—3，5—二甲基异恶唑—4—甲酰胺

    P22用与N—三氟甲基苯基—3，5—二甲基异恶唑—4—甲酰胺(A13)所述相同的条件制造，但开始用4—三氟甲基苄胺。P23：N—三氟甲基苄基—3—甲基异恶唑—4—甲酰胺

    3g 3—甲基异恶唑—4—羧酸和4.8g 1，3—二环己基碳二亚胺于30ml二氯甲烷的溶液在室温搅拌30分钟。然后滴加8ml 4—三氟甲基苄胺，混合物在室温搅拌过夜。再将混合物用乙酸乙酯(100ml)稀释并用稀盐酸溶液，饱和碳酸氢钠和氯化钠溶液处理。硫酸钠干燥，过滤并浓缩。粗产物用乙醇和水结晶得到1.5g N—三氟甲基苄基—3—甲基异恶唑—4—甲酰胺。P24：1—三氟甲基苄氨基羰基—1—氰基—2—羟基丙烯

    将500mg N—三氟甲基苄基—3—甲基异恶唑—4—甲酰胺于5ml乙醇的溶液加到300mg 1，8—二氮杂双环[5.4.0]十一碳—7—烯中。混合物然后在室温搅拌1小时并用2ml 2N盐酸溶液酸化。过滤收集固体得到350mg 1—三氟甲基苄基氨基羰基—1—氰基—2—羟基丙烯。P25

    将0.42g，3mM，3，4—二羟基苯甲醛，0.6g，3.1mM，N—4—氟苄基氰基乙酰胺和2.0mgβ—苯胺回流5小时。浓缩并过滤得到0.89g，95％产率，黄色固体，mp212℃。NMR丙酮d6δ8.10(1H，S，乙烯基)，7.68(1H，d，J＝2.3Hz，H2)，7.40(3H，m，H6，H2，H6)，7.09(2H，t，J＝8.8Hz，H3，5′)，6.98(1H，d，J＝8.3Hz，H5)，4.56(2H，br，S).MS—312(M+，46％)，311(30)，295(H—OH，35)，161(17)，124(NHCH4C6H4F，100％)，109(CH2C6H4F，73)—m/e.

    其它实施方案在下述的权利要求书中。