从啤酒废酵母中提取核苷酸的方法 本发明涉及利用工业废料生产核苷酸的方法，具体地指一种从啤酒废酵母中提取核苷酸的方法。
啤酒废酵母是指啤酒酿制工艺的后发酵期所排出的酵母废水经粗滤而剩余的残渣，一般称其为湿酵母泥，湿酵母泥经滚筒等设备干燥后即成为干酵母饼。目前，对啤酒废酵母的综合利用处理方法很多，其中较为典型的方法是先将啤酒废酵母进行脱核等处理，从中得到对人体健康有良好益处的核酸、核苷酸等营养物质，再将经过处理的脱核酵母用作牲畜家禽的饲料。如公开号为CN1049521A的中国发明专利申请公开说明书中记载了一种利用酒厂废酵母生产5′-核苷酸的方法，该方法是先采用盐法来使湿酵母泥的细胞破裂，从中得到含核酸的提取液，然后将其中的核酸在pH值为2.5的条件下沉淀，沉淀在溶解后再利用含磷酸二酯酶地桔青霉菌发酵液对核酸进行酶解，从而得到核苷酸混合液，最后提纯混合液中的核苷酸。但该生产方法仍然存在如下的缺陷：由于在其工艺过程中需要将核酸进行沉淀，而核酸提取液中核酸的分子量大小不一，在同一条件下大分子的核酸较易沉淀，小分子的核酸则易游离出来从上清中排掉，这样会有相当一部分的核酸未能充分利用，而是在沉淀的过程中损失掉了，相应核苷酸的收得率也较为偏低。并且核酸沉淀工艺对酵母原料中核酸大分子率的要求相当高，使得原料的挑选工作范围小难度大，生产成本增加很多。同时该工艺中所选用酶及其他化学制剂的品种、用量和使用时机较为繁杂，对最终成品的影响较大，酶及其他化学制剂在某一步骤起到特定作用后，在下一步骤则成为防碍核苷酸提纯的杂质，使得核苷酸的得率含量和纯度的稳定性较差，产品质量控制难度加大。另外，该工艺中所加入的盐份也会使提取完核苷酸后的脱核酵母味咸，品质下降，不适于作饲料使用。
本发明的目的就是要解决上述盐法生产核苷酸工艺所存在的不足，充分利用现有啤酒废酵母中的有用资源，提供一种产品得率高、纯度好、成本低、且性能稳定的从啤酒废酵母中提取核苷酸的方法。
为实现此目的，本发明所研制的从啤酒废酵母中提取核苷酸的方法，包括以下步骤：
1)核酸液的提取：取干燥的啤酒废酵母与6～10倍体积的水混合，搅拌成均匀的浆液，调节其pH值至7.2～7.5；然后将此浆液加热升温至94～96℃，保持1.5～2小时；再将其降温至20℃～30℃，并调节其pH值至4.8～5.0；最后对此浆液进行离心分离，分离出的清液即为含有核酸的提取液，将此核酸提取液升温至80～90℃待用；
2)磷酸二酯酶酶液的制备：取重量为步骤1)所得核酸提取液中纯核酸量2.8～3.2倍的利用桔青霉菌种发酵生产的麸皮霉，与9～10倍重量的水在40～50℃的温度下浸泡1～2小时，然后降温至20～30℃，滤除固体霉，再升温使清液在70℃左右保持4～6分钟后迅速降温至30℃左右，随后去除孢子，所得清液即为磷酸二酯酶酶液；
3)混合酶解：将步骤1)所得的核酸提取液和步骤2)所得的磷酸二酯酶酶液相混合，在65～75℃、pH值4.8～5.5的条件下水解1～2小时，再将其pH值调至7.2～7.8，并升温至90℃左右，保持12～15分钟后，迅速降温至30～40℃，去除其中的不溶物，所得清液即为需要提纯的核苷酸粗液；
4)活性炭柱提纯：将步骤3)所得核苷酸粗液的pH值调节至1.5～3.0后上活性炭柱，以每毫升炭柱每分钟0.03～0.05毫升流出液的流速上柱完毕，然后以同样的流速用软水洗脱去杂，再以同样的流速换用由40～60％的酒精和0.5～1％的氨水组成的洗脱液进行洗脱，保持炭柱在50～70℃恒温下洗脱，直至流出液经酒精检测无白色浑浊为止，所得洗脱液即为浓度约为3～5％的核苷酸精液；保持此核苷酸精液的温度为50～70℃，在真空条件下浓缩回收其中的酒精，使其中核苷酸的浓度提高至9～12％；再调节此高浓度核苷酸液的pH值至2.5～3.5，加入其体积量3～5倍的95％以上的酒精即得核苷酸沉淀；将此沉淀真空干燥即得核苷酸成品。
本发明的优点在于：方法汲取了已有啤酒废酵母的提取经验，摸索出了较佳的反应条件和较短工艺路线，在从干酵母饼中提取出核酸液后，直接用磷酸二酯酶酶液对其进行定向酶解，再用活性炭柱分离提纯核苷酸。由于减少了中间沉淀核酸的步骤，避免了该过程中大量核酸的流失，充分利用了提取液中的所有核酸，使得核苷酸的提取率大幅上升；并且不经中间沉淀核酸的步骤，也极大地减少了对啤酒废酵母原料指标中核酸大分子率的限制，使原料的挑选范围更广，生产成本降低。同时由于采用了活性炭柱提纯技术，活性炭吸附核苷酸的量极大，减少了酶及其他化学制剂对提纯核苷酸的负面影响，使核苷酸成品的纯度、色泽、溶解性及产量等各项性能指标也得以大幅度提高。另外，本方法还充分利用了干酵母饼的细胞已部分破裂的特性，基本上不加盐来提取核酸，因而脱核后的废啤酒酵母口感不带咸味，品质较高，能满足饲料酵母的标准，价格比盐法提取核酸后的脱核酵母高。
以下是本发明所提出的从啤酒废酵母中提取核苷酸的方法的一种具体实施例，该方法包括以下步骤：
1)核酸液的提取：取经滚筒干燥的啤酒废酵母与8倍体积的水混合，搅拌成均匀的浆液，置于提取罐内用浓度为6N的氢氧化纳溶液调节其pH值至7.2～7.5。然后将此浆液加热升温至94～96℃，此时浆液发生反应开始析出核酸，在此温度下保持1.5～2小时，其间通过分光光度计取样监测浆液的OD260指标，直至其不再升高后停止提取。再用换热器将所提浆料的温度降至20℃～30℃，并调节其pH值至4.8。最后利用D424高速离心机对此浆液进行分离，分离出的清液即为含有核酸的提取液，将此核酸提取液升温至80～90℃待用。
2)磷酸二酯酶酶液的制备：利用中国科学院微生物研究所生产的标号为AS3.2788的桔青霉菌种发酵生产的麸皮霉，重量为步骤1)所得核酸提取液中纯核酸量的3倍，与10倍重量的水在45℃的温度下浸泡1小时，然后降温至20℃，用80目丝网滤除固体霉，再升温使清液在70℃左右保持5分钟后迅速降温至30℃左右，随后经管式高速分离机去除孢子，所得清液即为磷酸二酯酶酶液。
3)混合酶解：将步骤1)所得的核酸提取液和步骤2)所得的磷酸二酯酶酶液相混合，在70℃左右、pH值5.0～5.2的条件下水解2小时，再将其pH值调至7.2～7.4，并升温至90℃左右，保持15分钟后，迅速降温至30℃左右，用板框过滤去除其中的不溶物，所得清液即为需要提纯的核苷酸粗液。
4)活性炭柱提纯：将步骤3)所得核苷酸粗液的pH值调节至1.5后上活性炭柱，以每毫升炭柱每分钟0.03～0.05毫升流出液的流速上柱完毕，然后以同样的流速用软水洗脱约6小时去杂，再以同样的流速换用由50％的酒精和1％的氨水组成的洗脱液进行洗脱，保持炭柱在60℃的恒温下洗脱，直至流出液经酒精检测无白色浑浊为止，所得洗脱液即为浓度约为4％的核苷酸精液。保持此核苷酸精液的温度为50℃，在真空条件下浓缩回收其中的酒精，使其中核苷酸的浓度提高至9～12％。再调节此高浓度核苷酸液的pH值至3.0，加入其体积量5倍的95％以上的酒精即得核苷酸沉淀，最后将此沉淀置于真空干燥柜内烘干即得核苷酸成品。