诱导肉苁蓉种子产生愈伤组织并分化出芽的方法 技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种诱导肉苁蓉种子产生愈伤组织并分化出芽的方法。
背景技术
传统的中药材80％为野生资源，由于生态环境的恶化和人们对野生资源的盲目采集，从天然野生植物中提取次生代谢产物的方式受到了挑战。通过植物组织和细胞培养来产生次生代谢产物是解决这一问题地一个较好的方法，目前已有紫草、人参根、青蒿、毛地黄等达到中试和工业化规模(Curtin M E，Biotechnology，1983，1，649-657)。通过愈伤组织分化出芽，再进行分生组织培养和快速无性繁殖，可以为植物的生长繁殖提供充足的种苗。目前快繁技术已用于一些苗木的大规模商业化生产，如兰花、百合、香石竹、香蕉等(李宝健等，植物生物技术原理与方法，1990，343-350)
肉苁蓉(Cistanche deserticola Y.C.Ma)为列当科肉苁蓉，属多年生高等寄生植物，主要产于我国以及伊朗、蒙古、印度等国，生长于盐碱地、干河沟沙地和戈壁滩一带，寄生在梭梭、白梭梭和柽柳属植物的根上。肉苁蓉味甘咸微辛酸、微温，在《神农百草经》中列为上品，具有补中、入肝、益精、滋肾、壮阳等功效(中国药科大学，中药辞海-第一卷，1993，2098-2101)。长期以来，肉苁蓉来源于民间采挖，由于没有科学管理，滥采乱挖现象十分严重，肉苁蓉寄主梭梭等毁坏严重，破坏了自然生态环境，加速了土地沙漠化，形势十分严峻。而肉苁蓉的人工栽培虽已试验成功，但受寄主植物的数量、分布与根系发育等条件的影响，大量发展尚有一定困难。因此迫切需要开发肉苁蓉的组织和细胞培养技术，使肉苁蓉在工业条件下大量分裂繁殖，累积野生植物的药物成分，以满足国内外日益增长的需要，并杜绝无节制的滥采乱挖现象。
由于肉苁蓉是寄生植物，其种子的萌发机理具有一定的特殊性。肉苁蓉的种子具有一个近球形胚，这种近球形胚只在寄主梭梭根穿入种子内之后才能被刺激萌发。这种萌发的启动与寄主中某些细胞表面存在的化学因素的“识别”有关，而寄主梭梭根含有某些类似激素类物质刺激“芽管状器官”的形成(李天然等，内蒙古大学学报-自然科学报版，1989，20，395-400)。自然环境中，肉苁蓉的萌发和生长必须要有寄主的存在，因此受到自然条件的限制，而且栽培期长(3-5年)，人工养育困难，因此人工栽培有一定的局限性(郑兴国等，新疆林业，2001，2，29-30)；目前有用激素处理肉苁蓉种子，以提高肉苁蓉种子愈伤组织发生率的报道，但一般来说，如果仅用激素处理，肉苁蓉种子愈伤组织的发生频率较低，仅为12％(吴新等，西北药学杂志，1998，13，103-104)。
在肉苁蓉种子的愈伤组织诱导培养中药克服肉苁蓉对寄主的依赖而使之萌发，通过查新，目前尚未见有通过高温处理寄主植物种子使之愈伤组织的报道。
发明内容
本发明的目的提供一种诱导肉苁蓉种子产生愈伤组织并分化出芽的方法，通过诱导伤愈组织分化发芽，使肉苁蓉摆脱寄主的限制，由寄主转至自养，从而实现人工培养，达到规模生产的目的。
本发明的实施方案如下：
本发明提供的诱导肉苁蓉种子产生愈伤组织并分化出芽的方法，其特征在于，其步骤如下：
1.将肉苁蓉种子于30-70℃下进行热处理10-200分钟，消毒后接种到0.1-10mg/L 2，4-D的MS培养基上进行诱导培养；或者接种到0.1-10mg/L KT的MS培养基上进行诱导培养；或者接种到0.1-10mg/L 2，4-D与KT的MS混合培养基上进行诱导培养，诱导培养天数为30天；
2.将培养30天后产生的肉苁蓉伤愈组织转接到含0.1-5mg/L 6-BA的B5细胞分裂素的固体培养基上继代培养；或者转接到含0.1-5g/L GA3的B5细胞分裂素的固体培养基上继代培养；或者转接到含0.1-5mg/L 6-BA与GA3的B5细胞分裂素的固体混合培养基上继代培养，继代培养次数为2-20次；
步骤1)中对肉苁蓉种子进行热处理的温度以40-60℃为佳，热处理时间以30-120分钟为佳；步骤1)中对肉苁蓉种子进行诱导培养所使用的激素浓度或混合激素的浓度以0.3-5mg/L为佳；步骤2)中对肉苁蓉伤愈组织继代培养所使用的细胞分裂素或所使用的混合细胞分裂素的固体培养基浓度以0.3-3mg/L为佳；步骤2)所述的继代培养次数以5-8次为佳。
肉苁蓉是寄主植物，因此诱导肉苁蓉种子产生伤愈组织有一定困难，经过研究发现，高温处理对肉苁蓉种子有强烈的刺激作用，植物细胞被提高或称热休克时，植物会暂时合成一些新的蛋白质，称为热休克蛋白；热休克蛋白可能会刺激植物内一些酶的产生，诱导相关生长激素的活性，从而诱导伤愈组织的形成。细胞分裂素和赤霉素(GA3)是植物生长过程中重要的调节因子，主要用于促进细胞分裂，诱导组织分化等。通过改变它们在B5培养基中的组份和浓度，并经过多次继代培养，可以有效地促进伤愈组织的分化出芽。
肉苁蓉种子经过热处理后，需经表面消毒才能接种；在MS培养基中加入激素后一起灭菌，或者将激素通过除尘过滤器加入培养基中，每一种单一的激素适宜的浓度范围有所差别；肉苁蓉种子愈伤组织的诱导时间一般为30天；肉苁蓉愈伤组织诱导分化出芽培养的继代2-20次，并以继代5-8次为较佳。
本发明提供的诱导肉苁蓉种子产生愈伤组织并分化出芽的方法，利用热处理对寄生植物肉苁蓉种子的激活作用以及激素2，4-D和KT的协同作用，克服肉苁蓉种子萌发对寄主的依赖性，从而达到提高肉苁蓉种子愈伤组织发生率的目的；并利用赤霉素和细胞分裂素6-BA促进细胞分裂和诱导组织分化的作用，从而达到愈伤组织分化出芽的目的。
具体实施方式
实施例1：将肉苁蓉种子于40℃下进行热处理60分钟，消毒后接种到5mg/L2，4-D与KT的MS混合培养基上培养，30天后伤愈组织发生率为25％；将培养30天后的肉苁蓉愈伤组织转接到含3mg/L 6-BA与GA3细胞分裂素的B5固体混合培养基上进行继代培养5次后，分化出芽率为45％。
实施例2：将肉苁蓉种子于30℃下进行热处理120分钟，消毒后接种到4mg/L2，4-D与KT的MS混合培养基上培养，30天后伤愈组织发生率为15％；将培养30天后的肉苁蓉愈伤组织转接到含2mg/L 6-BA与GA3细胞分裂素的B5固体混合培养基上进行继代培养6次后，分化出芽率为33％。
实施例3：将肉苁蓉种子于50℃下进行热处理80分钟，消毒后接种到3mg/L2，4-D与KT的MS混合培养基上培养，30天后伤愈组织发生率为15％；将培养30天后的肉苁蓉愈伤组织转接到含1mg/L 6-BA与GA3细胞分裂素的B5固体混合培养基上进行继代培养8次后，分化出芽率为33％。
实施例4：将肉苁蓉种子于70℃下进行热处理70分钟，消毒后接种到0.5mg/L 2，4-D的MS培养基上培养，30天后伤愈组织发生率为20％；将培养30天后的肉苁蓉愈伤组织转接到含0.5mg/L 6-BA B5培养基上进行继代培养10次后，分化出芽率分别为30％。
实施例5：将肉苁蓉种子于70℃下进行热处理10分钟，消毒后接种到9mg/L2，4-D的MS培养基上培养，30天后伤愈组织发生率为15％；将培养30天后的肉苁蓉愈伤组织转接到含2.5mg/L 6-BA B5培养基上进行继代培养18次后，分化出芽率分别为29％。
实施例6：将肉苁蓉种子于70℃下进行热处理40分钟，消毒后接种到0.8mg/L2，4-D的MS培养基上培养，30天后伤愈组织发生率为21％；将培养30天后的肉苁蓉愈伤组织转接到含0.3mg/L 6-BA B5培养基上进行继代培养15次后，分化出芽率分别为30％。
实施例7：将肉苁蓉种子于65℃下进行热处理40分钟，消毒后接种到0.8mg/L2，4-D的MS培养基上培养，30天后伤愈组织发生率为15％；将培养30天后的肉苁蓉愈伤组织转接到含0.8mg/L 6-BA B5培养基上进行继代培养10次后，分化出芽率分别为28％。
实施例8：将肉苁蓉种子于55℃下进行热处理50分钟，消毒后接种到0.9mg/L2，4-D的MS培养基上培养，30天后伤愈组织发生率为20％；将培养30天后的肉苁蓉愈伤组织转接到含0.9mg/L 6-BA B5培养基上进行继代培养4次后，分化出芽率分别为25％。
实施例9：将肉苁蓉种子于50℃下进行热处理110分钟，消毒后接种到5mg/L2，4-D的MS培养基上培养，30天后伤愈组织发生率为25％；将培养30天后的肉苁蓉愈伤组织转接到含3mg/L 6-BA B5培养基上进行继代培养8次后，分化出芽率分别为33％。
实施例10：将肉苁蓉种子于60℃下进行热处理60-120分钟，消毒后接种到0.1-5mg/L 2，4-D的MS培养基上培养，30天后伤愈组织发生率为15％；将培养30天后的肉苁蓉愈伤组织转接到含0.3-3mg/L 6-BA B5培养基上进行继代培养2-20次后，分化出芽率分别为33％。