3-糖基黄酮或其衍生物及其制法和用途 一、技术领域
本发明涉及黄酮，具体地说，是涉及3-糖基黄酮。二、背景技术
黄酮类糖苷是一类广泛存在于自然界的天然有机化合物，它们具有一系列重要的生理活性，例如：3-糖基黄酮类糖苷可用于治疗多种心血管类疾病，还可用作免疫性抑制剂。3，7，3’，4’-四羟基-3-L-鼠李吡喃糖基黄烷酮(Astilbin)及其类似物5，7，3’，5’-四羟基-3-L-鼠李吡喃糖基黄烷酮(Smitilibin)、5，7-二羟基-3-L鼠李吡喃糖基色酮(Eucryphin)等3-糖基黄酮类糖苷在整体疾病模型上或细胞模型上显示出选择性的免疫抑制效应，且无现有药物常见的毒副作用。
然而，由于合成黄酮类糖苷的有效方法很少，大多数黄酮类糖苷主要依靠天然提取。迄今为止，已见报道的黄酮类糖苷的合成方法有以下三种：
方法一：Horhammer和Wagner(1968)首次报道了7，4’-二苄氧基栎精和α-乙酰溴葡萄二糖在Koenigs-Knorr的反应条件下，以Ag2O作催化剂合成黄酮类糖苷：
方法二：Demetzos等(1990)报道了以4’，7-二苄氧基-3-羟基黄酮和α-乙酰溴葡萄吡喃糖为原料，在氯仿-氢氧化钾水溶液中，用三乙基苄基溴化铵(TEBA)作相转移催化剂合成黄酮类糖苷：
方法三：Ken Ohmori等于2000年报道了黄酮类糖苷的又一制备方法，其合成路线如下：
以上这三种方法均存在有一定的局限性，方法一由于体系中有高浓度银盐使反应后处理较困难；方法二的反应时间长；方法三的反应步骤多。鉴于此，我们以易得的原料3-羟基黄酮，采用简便的方法、两步反应路线合成黄酮类糖苷。三、发明内容
本发明的目的在于提供一类3-糖基黄酮新化合物，并提供它们简易的制法及它们的用途。
本发明的技术方案如下：
一类3-糖基黄酮或其衍生物，其特征是有如下结构通式：
当R1-为CH3CO-，R2-为CH3-时，它是3-(2，3，4-三乙酰基-L-鼠李吡喃糖基)黄酮；当R1-为CH3CO-，R2-为CH3COOCH2-时，它是3-(2，3，4，6-四乙酰基-D-葡萄吡喃糖基)黄酮；当R1-为HO-，R2-为HOCH2-时，它是3-D-葡萄吡喃糖基黄酮。
一种制备上述3-糖基黄酮或其衍生物的合成路线如下：
一种制备上述乙酰化3-糖基黄酮的方法，它由以下步骤组成：
步骤一、将3-羟基黄酮和2，3，4-三乙酰基-1-氧-α-L-鼠李吡喃糖基三氯乙亚胺或2，3，4，6-四乙酰基-1-氧-α-D-葡萄吡喃糖基三氯乙亚胺混合，
步骤二、在步骤一得到的混合物中加入无水二氯甲烷，反应体系经液氮-乙醇浴冷却至-45～-78℃，
步骤三、在氮气保护下滴加催化量的三氟甲磺酸三甲硅酯(TMSOTf)至反应体系，
步骤四、加毕三氟甲磺酸三甲硅酯后，去冷浴，让反应体系自然升温至室温，继续反应至反应完全，在反应体系中加入三乙胺终止反应，
步骤五、减压蒸去溶剂后得棕黄色粘稠液体，
步骤六、棕黄色粘稠液体经柱层析分离纯化得3-(2，3，4-三乙酰基-L-鼠李吡喃糖基)黄酮或3-(2，3，4，6-四乙酰基-D-葡萄吡喃糖基)黄酮。
上述地制备方法，步骤一中，两反应物混合后可以经真空干燥。
上述的制备方法，步骤四中，可以用薄层层析监测反应是否完全。
上述的制备方法，步骤六中，可以用层析硅胶柱层析分离纯化，淋洗剂可以是石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1的混合溶剂。
一种制备3-L-鼠李吡喃糖基黄酮的方法，它由下列步骤组成：
步骤一、将3-(2，3，4-三乙酰基-L-鼠李吡喃糖基)黄酮溶于甲醇中，通入氨气至饱和，室温放置至反应完全，
步骤二、将步骤一所得的反应混合物减压蒸去溶剂，得橙黄色固体，
步骤三、将橙黄色固体经柱层析分离纯化得白色的3-L-鼠李吡喃糖基黄酮。
上述的制备方法，步骤一中，可以用薄层层析监测反应是否完全。
上述的制备方法，步骤三中，可以用层析硅胶柱层析分离纯化，淋洗剂可以是石油醚∶乙酸乙酯＝2∶5的混合溶剂。
本发明人研究发现，本发明的3-L-鼠李吡喃糖基黄酮对混合淋巴细胞反应有显著的抑制作用，对于经SRBC免疫活化的淋巴细胞有一定的诱导其凋亡的活性，对于Con A活化的Jurkat T细胞释放IFN-gamma也有显著的抑制作用。因此本发明的3-D-葡萄吡喃糖基黄酮可以用于制备治疗包括移植、类风湿性关节炎、红斑狼疮等自身免疫性疾病以及变态反应性疾病等各种免疫性疾病的药物。四、具体实施方式
实施例1：3-(2，3，4-三乙酰基-L-鼠李吡喃糖基)黄酮的合成：
将3-羟基黄酮(2.751g，0.0116mol)和2，3，4-三乙酰基-1-氧-α-L-鼠李吡喃糖基三氯乙亚胺(5.022g，0.0116mol)混合，经真空干燥2h后，混合物中加入180ml无水CH2Cl2，体系经液氮—乙醇浴冷却至-42℃，N2保护下滴入三氟甲磺酸三甲硅酯(TMSOTf)-247μl，加毕，去冷浴，反应体系逐渐回到室温，总反应时间约需3h，薄层层析(展开剂为石油醚∶乙酸乙酯＝3∶2)监测反应结束后，体系中加入三乙胺终止反应，旋转蒸发仪脱去溶剂后得棕黄色粘稠状液体，经层析硅胶柱层析分离纯化(淋洗剂为：石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1))得白色固体1.215g，mp.66-68℃，收率20.6％。化合物经1H-NMR、13C-NMR、IR、MS及元素分析进行了结构验证，结果表明其结构正确，数据如下：
1H-NMR(300MHz，DMSO-D6)：
8.10(d，1H J＝7.50Hz)7.92(m，2H)7.83(t，1H，J＝7.84，7.12)7.71(d，1H，J＝8.15，7.84)7.61(m，3H)7.51(t，1H，J＝7.50，7.12)5.54(s，1H)5.11(dd，1H，J＝3.03，10.23)4.81(t，1H，J＝10.04)3.25(m，1H)2.11(s，3H)1.98(s，3H)1.96(s，3H)0.74(d，3H，J＝6.03).
13C-NMR(75MHz，DMSO-D6)：
17.57，21.23，21.31，21.35，68.59，69.15，69.35，70.10，98.59，119.33，124.19，125.86，126.20，129.46，129.66，130.86，131.96，135.21，137.21，155.74，157.78，170.27，170.37，170.48，174.22
IR(KBr)；cm-1
3063.18，2985.54，2938.81，1751.49，1644.46，1619.09，1568.46，1467.79，1393.82，1370.89，1223.39，1201.32，1135.65，1055.19，982.20，965.61，905.07，795.59，763.12，698.81.
元素分析结果：计算值：C(％)：63.53 H(％)：5.10
实测值：C(％)：63.59 H(％)：5.10
实施例2.3-L-鼠李吡喃糖基黄酮的合成：
将3-(2，3，4-三乙酰基-L-鼠李吡喃糖基)黄酮(0.601g，1.178mmol)加CH3OH25ml溶解后，通入NH3至饱和，时间约4h，室温下放置48h后，薄层层析(展开剂：石油醚∶乙酸乙酯＝1∶5)监测体系中已无原料，旋转蒸发仪脱去溶剂得橙黄色固体，经层析硅胶柱层析(淋洗剂为：石油醚∶乙酸乙酯＝2∶5)分离纯化得白色固体0.385g，mp.96-99℃，收率83.6％。化合物经1H-NMR、13C-NMR、IR、MS及元素分析进行结构验证，结果表明其结构正确，数据如下：
1H-NMR(300MHz，DMSO-D6)：
8.12(d，1H J＝7.71Hz)7.91(m，2H)7.83(t，1H，J＝8.20，7.22Hz)7.77(d，1H，J＝8.20Hz)7.58(m，3H)7.51(t，1H，J＝7.71，7.22Hz)5.38(s，1H)4.05(s，1H)3.45(dd，1H，J＝2.93，9.19Hz)3.14(t，1H，J＝9.40Hz)2.91(m，1H)0.75(d，3H，J＝6.09Hz)
13C-NMR(75MHz，DMSO-D6)：
18.28，70.95，71.05，71.33，71.84，102.35，119.31，124.27，125.87，126.07，129.31，129.69，131.27，131.74，135.05，138.02，155.68，157.55，174.57.
IR(KBr)；cm-1
3422.65，3064.11，2920.93，2930.99，1637.47，1616.67，1561.11，1467.37，1396.97，1203.44，1134.14，1059.28，945.84，914.98，760.15，695.90.
MS：385.0(M+1)，407.1(M+Na)，790.9(2M+Na)
元素分析结果：计算值：C(％)：65.63 H(％)：5.21
实测值：C(％)：65.27 H(％)：5.30
实施例3.3-(2，3，4，6-四乙酰基-D-葡萄吡喃糖基)黄酮(VI)的合成：
3-羟基黄酮(1.088g，4.57mmol)和2，3，4，6-四乙酰基-1-氧-α-D-葡萄吡喃糖基三氯乙亚胺(2.251g，4.57mmol)混合，经真空干燥2h后，混合物中加入150ml无水CH2Cl2，体系经液氮—乙醇浴冷却至-78℃，N2保护下滴入三氟甲磺酸三甲硅酯(TMSOTf)98μl，加毕，去冷浴，反应体系逐渐回到室温，总反应时间约需3h，薄层层析(展开剂为石油醚∶乙酸乙酯＝3∶2)监测反应结束后，体系中加入三乙胺终止反应，旋转蒸发仪脱去溶剂后得棕黄色粘稠状固体，经层析硅胶柱层析分离纯化(淋洗剂为石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)得白色固体1.25g，mp.57-60℃，收率48.04％。化合物经1H-NMR、13C-NMR进行了结构验证，结果表明其结构正确，数据如下：
1H-NMR(300MHz，DMSO-D6)：
8.08(m，3H)7.77(m，1H)7.69(d，1H)7.55(m，3H)7.48(t，1H)5.81(d，1H)5.43(t，1H，J＝9.7Hz)5.02(t，1H，J＝8.93Hz)4.94(t，1H，J＝9.65Hz)3.99(m，3H)2.07(s，3H)1.98(s，9H)1.82(s，3H)
13C-NMR(300MHz，DMSO-D6)：
173.78，170.49，170.35，170.17，170.15，155.58，135.11，131.72，129.75，129.03，126.06，125.69，124.14，119.28，99.09，72.63，72.22，71.45，68.80，62.05，21.31，21.16，21.08，21.04
实施例4. 3-D-葡萄吡喃糖基黄酮的合成：
化合物(VI)(0.606g，1.067mmol)与CH3OH 25ml混合后，通入NH3至饱和，时间约4h，室温下放置48h后，薄层层析(展开剂为石油醚∶乙酸乙酯＝1∶5)监测体系中已无原料，旋转蒸发仪脱去溶剂得橙黄色固体，经柱层析分离纯化得白色固体0.427g，mp：178-181℃，收率81.3％。化合物经1H-NMR、13C-NMR进行了结构验证，结果表明结构正确，数据如下：
1H-NMR(300MHz，DMSO-D6)：
8.18(m，2H)8.13(d，1H)7.85(m，1H)7.77(d，1H)7.54(m，4H)5.61(d，1H，J＝7.47Hz)5.41(d，1H)5.09(m，1H)4.99(m，1H)4.31(m，1H)3.56(m，1H)3.36(m，1H)3.33(m，1H)3.23(m，1H)3.13(m，2H)
13C-NMR(300MHz，DMSO-D6)：
61.60，70.65，74.94，77.23，78.32，101.32，119.28，124.17，125.88，126.03，129.08，129.93，131.55，135.03，137.14，155.60，156.55，174.50。
实施例5.药理试验
本发明的3-L-鼠李吡喃糖基黄酮(AR)和3-D-葡萄吡喃糖基黄酮对混合淋巴细胞反应(sMLR)的影响
取BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠，分别无菌条件下摘出脾脏，置入含有冷10ml Hank’s平衡盐溶液(Hank’s Balanced Salt Solution，HBSS)，轻轻挤压脾脏，使细胞进入溶液中，经分散使成单细胞悬液，过滤后于300g离心5min，然后用0.17 M Tris-0.75％NH4Cl处理以去除红细胞，再用冷RPMI-1640培养液洗涤两次。将来自C57BL/6的脾细胞用1×10-6g/ml的丝裂霉素C处理1小时后，用含10％的RPMI-1640的培养基洗涤两次，再配制成1×106个/ml细胞悬液。BALB/c的脾细胞配制成1×107个/ml的细胞悬液。将来自BALB/c小鼠的脾细胞悬液100μl(1×106)与丝裂霉素C处理的C57BL/6的脾细胞悬液100μl(1×105)混合培养96小时，用MMT法检测脾细胞增殖。即在细胞中加入20μl 2mg/ml的MTT溶液，继续培养4小时，1000g离心10min，弃上清。加入200ml的二甲亚砜(DMSO)，置于平板微振荡器上振荡，待沉淀溶解完全后，用酶标仪测定OD540。按以下公式计算刺激指数(SI)：SI＝(OD540 C57BL/6+BALB/c-OD540 C57BL/6)/OD540 BALB/c。
结果如表1所示，3-L-鼠李吡喃糖基黄酮(AR)和3-D-葡萄吡喃糖基黄酮(AG)均浓度依赖性地抑制了淋巴细胞的增殖，其中以astilbin(A)的作用为最强，AG次之，AR的作用较弱。
表1.药物对sMLR的影响
Control 10-8 10-7 10-6 10-5A 1.99±0.21 1.85±0.23 1.62±0.12* 1.32±0.08*AR 2.45±0.09 2.74±0.03 1.99±0.21 1.85±0.23 1.82±0.12AG 2.38±0.15 1.93±0.15 1.74±0.06 1.52±0.08*
P＜0.05 vs Control(Students’t test)。药物浓度为g/ml。
本发明的3-L-鼠李吡喃糖基黄酮(AR)和3-D-葡萄吡喃糖基黄酮(AG)绵羊红细胞所致足跖肿胀小鼠脾细胞凋亡的诱导作用
在无菌的条件下将SRBC用生理盐水洗三次，洗涤完毕后配成2×108/ml的生理盐水溶液，在BALB/c小鼠左后足趾皮下注射该溶液40μl致敏，5d后在右后足趾皮下注射浓度为2×109/ml SRBC的生理盐水溶液40μl进行攻击，攻击后10小时摘取脾脏，按上述方法制备脾细胞悬液，与不同浓度药物共孵3h，用Hochest 33342和PI染色法测定凋亡，于荧光显微镜下计数凋亡细胞百分率。
结果如表2所示，与对照组相比，astilbin(A)明显地诱导了脾细胞的凋亡，作用呈浓度依赖性。AR和AG两个化合物在10-7g/ml的浓度时显著地诱导了脾细胞的凋亡。
表2.药物诱导来自SRBC免疫小鼠的脾细胞凋亡
Control -7 -6 -5
A 16.3±1.9 20.6±5.8 25.6±4.7* 32.3±11.5*
AR 17.2±0.8 29.5±7.4* 17.9±3.2 21.6±5.5
AG 17.3±6.6 27.6±9.7* 18.3±4.4 17.8±3.8
P＜0.05 vs Control。药物浓度为g/ml。
本发明的3-L-鼠李吡喃糖基黄酮(AR)和3-D-葡萄吡喃糖基黄酮(AG)对Con A活化的Jurkat细胞IFN-gamma释放量的影响
取Jurkat T细胞(2×105/ml)，在10μg/ml的Con A的共存下于37℃、5％CO2培养72小时，洗涤后，取该活化的Jurkat细胞5×106/ml，加入不同浓度的各化合物，共孵3小时，离心取上清液作为待试液，以不加化合物的上清作为对照，用生物法测定待试液中IFN-gamma的活力。另取J774 A.1细胞以1×105/0.1 ml/孔接种入96孔培养板，37℃、5％CO2下预培养24小时后，弃上清，加入100μl待试液待测上清，然后加入上述100μl及LPS 100μl(终浓度20μg/ml)，37℃、5％CO2下培养24小时，取上清转移到另一块96孔板中，加入等体积的Griess试剂，室温放置10分钟，检测OD540。同时用IFN-gamma标准溶液作标准曲线，以测得的值根据标准曲线求得待试液中IFN-γ的的活力单位。
结果如表3所示，与对照组相比，三个化合物对IFN-gamma的释放均有明显的抑制作用，尤以AG的作用为强。
表3 A，AG，AR对Con A活化的Jurkat细胞IFN-gamma释放的影响 Blank Control 10-6 10-5 10-4 A AG AR 1083 14337 1624 2300 9333 272 69 1016 2706 5749 8657
综上所述，本发明的3-L-鼠李吡喃糖基黄酮(AR)和3-D-葡萄吡喃糖基黄酮(AG)对于混合淋巴细胞反应有显著的抑制作用，对于经SRBC免疫活化的淋巴细胞有一定的诱导其凋亡的活性，对于Con A活化的Jurkat T细胞释放IFN-gamma亦有显著的抑制作用。这些结果表明，AR和AG可作为免疫抑制剂，有可能用于治疗包括移植，类风湿性关节炎、红斑狼疮等自身免疫性疾病以及变态反应性疾病等各种免疫性疾病。