重组的人类免疫缺损病毒融合抑制物及其制法和用途 【技术领域】
本发明涉及医药学领域，更具体地涉及抑制人类免疫缺损病毒(HIV-1)融合的抑制物(VFI)，所述抑制物的基因工程重组生产方法、以及含有所述抑制物的药物组合物。
背景技术
艾滋病是严重危害人类健康和社会稳定的传染病，它由人类免疫缺损病毒(HIV-1)感染引起。HIV-1具有高度的变异性和复制能力，因而在人群中传播迅速。
目前应用逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂联合用药的治疗的方法，因HIV病毒酶基因迅速发生突变，随之出现耐药变异毒株，最终使这类治疗方法失效。
为了克服治疗药物造成HIV-1产生的耐药性，新研发的一代药物是HIV-1融合抑制物(VFI)。VFI是一类完全不同的抗病毒药物，它是一种阻止病毒入侵的抑制物。VFI能阻断HIV-1入侵细胞所必需的膜融合过程，从而防止病毒进入到健康细胞。VFI作用于HIV-1外壳蛋白gp41转膜单位的一个特殊区域，与六个小螺旋构成的转膜蛋白外基团相结合，形成前发夹结合体，阻断融合活化状态，有效地抑制HIV-1引起的细胞-细胞和病毒-细胞的融合过程。
目前一些抑制物在美国正在进行临床试验的类似药物称T-20。T-20为36肽的形式，是第二代抗艾滋病药物。目前T-20由Trimeris和Roche制药公司共同开发，并已由美国FDA批准(Fast track程序)在美国和欧洲进行III/IV期临床试验，包括单个药物和与逆转录酶抑制剂联合应用的方案。该多肽药物是目前唯一的能防止病毒进入到健康细胞的抗艾滋病药物，对HIV-1耐药毒株也有效。在成人和儿童的临床试验中，治疗方案使用1-3mg皮下注射，每日二次；或5-9mg静脉滴液，每周二次。用药二周后能使病毒RNA负荷降至50拷贝以下，抗病毒作用较目前的HAART疗法更为优越。该药物有良好的耐受性，大剂量使用可以达到每日100-200mg。
目前在美国生产地T-20，使用化学合成法。由于肽链较长，使用合成法大规模制备该多肽有一定的困难，需要专用设备，而且成本昂贵，环境污染较难控制。另外，在美国用合成法生产的T-20是使用基于HIV-1 LAI毒株gp41转膜蛋白外基因序列，该毒株是欧美国家的流行株，属HIV-1 B亚型，淋巴细胞敏感株。虽然T-20的抗病毒作用能涵盖几乎所有的HIV-1亚型，但其作用强度在各种不同的亚型中存在差异。
因此，本领域迫切需要开发新型的抑制人类免疫缺损病毒(HIV-1)融合的抑制物(VFI)。
【发明内容】
本发明的目的就是提供一种新的抑制人类免疫缺损病毒(HIV-1)融合的抑制物(VFI)。
本发明的另一目的是提供所述抑制物的生产方法。
本发明的又一目的是提供含有所述抑制物的药物组合物。
在本发明的第一方面，提供了一种抑制人类免疫缺陷病毒融合的抑制物，所述抑制物包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
在本发明第二方面，提供了一种分离的DNA，它编码具有SEQ ID NO：所示氨基酸序列的抑制物。
在本发明的第三方面，提供了含有所述DNA的表达载体，以及含有所述DNA或表达载体的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了一种抑制人类免疫缺陷病毒融合的抑制物的制备方法，包括步骤：
(a)在表达条件下，培养宿主细胞，从而表达出所述的抑制物，其中所述宿主细胞含有一表达载体，所述表达载体含有与表达调控序列可操作性相连的、编码具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列抑制物的DNA序列；
(b)分离出所述的抑制物。
在一优选例中，所述的宿主细胞是大肠杆菌。
在另一优选例中，所述的DNA序列具有SEQ ID NO：3所述的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的表达载体含有2-4个编码SEQ ID NO：4所示抑制物的DNA序列。在另一优选例中，还包括步骤(c)对获得的多倍体抑制物进行切割处理(如用CNBr处理)，从而获得抑制物单体。
在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，它含有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的抑制物和药学上可接受的载体。
在优选例中，所述的药物组合物还含有氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的人类免疫缺陷病毒融合的抑制物。更佳地，SEQ ID NO：4所示的抑制物和SEQ IDNO：2所示抑制物的比例为1∶10-10∶1。
在本发明的第六方面，提供了一种抑制人类免疫缺陷病毒融合的抑制物的制备方法，包括步骤：
(a)在表达条件下，培养宿主细胞，从而表达出所述的抑制物，其中所述宿主细胞含有一表达载体，所述表达载体含有与表达调控序列可操作性相连的、编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列抑制物的DNA序列；
(b)分离出所述的抑制物。
在一优选例中，所述的DNA序列具有SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的表达载体含有2-4个编码SEQ ID NO：2所示抑制物的DNA序列。
【附图说明】
图1显示了构建四倍体的克隆技术路线。图中箭头为内切酶消化位置，质粒分别由BamHI，PstI和BglII，PstI双酶切，将获得的相应片段连接，克隆，VFI序列由单倍体形成为二倍体。图中BB(ggatct)由BamHI和BglII连接形成的序列，不再为二者识别。重复上述克隆过程形成四倍体。图中STOP表示终止密码子。
图2显示了本发明重组VFI-S1和VFI-S2四倍体在大肠杆菌中的表达。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图中，凝胶浓度20％，含0.1％SDS，考马斯亮蓝R250染色。泳道1和2为大肠杆菌生长，未经诱导；3和4为大肠杆菌经IPTG诱导后的全细胞裂解物。箭头表示VFI的条带。分子量约为16.5Kd。
图3显示了本发明VFI产物纯化后的电泳图。VFI-S1和VFI-S2纯化后呈现单一条带，分子量约为4000Da。
图4显示了本发明VFI对HIV-1膜融合的抑制作用。
【具体实施方式】
本发明人经过广泛而深入的研究，首次采用基因工程重组技术制备了VFI，并且用HIV-1淋巴细胞和巨噬细胞双向敏感毒株的靶基因序列进行编码。本发明的VFI具有显著的HIV-1膜融合抑制作用，适用于治疗HIV-1不同亚型的艾滋病，特别是对目前抗艾滋病药物已产生耐药的病例。在此基础上完成了本发明。
如本文所用，术语“本发明的多肽”指具有氨基酸序列YTDYIYDLLEKSQTQQEKNEKELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO：4)的抑制物VFI-S2，或者指VFI-S2与其他VFI的融合产物或混合物。
如本文所用，术语“抑制物单体”指含有1个VFI序列的多肽。
如本文所用，术语“多倍体抑制物”指含有2个或多个VFI序列的多肽。例如含有两个SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽就是二倍体的VFI-S2抑制物。另外，含有一个VFI-S2的氨基酸序列和一个其他VFI(如VFI-S1)序列的多肽也被视为多倍体抑制物。
对膜融合晶体结构的研究表明，HIV-1 gp41转膜基团用于抑制物的编码序列是胞外643-678。本发明人根据结构模型所设计的二种VFI属同一类抑制物的二个多肽，都是由36个氨基酸组成，其序列分别称为S1，S2。二者分别来自二个不同的HIV-1亚型的同源基因，S1来自HIV-1 LAI毒株，S2来自HIV-1 89.6毒株。这二个序列构成的多肽，分别称为VFI-S1和VFI-S2，二者都具有抑制HIV-1融合的生物活性。
VFI-S1的氨基酸序列与T-20相同，如SEQ ID NO：2所示。一种编码VFI-S1的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
VFI-S2的氨基酸序列与T-20不同，如SEQ ID NO：4所示。一种编码VFI-S2的DNA序列如SEQ ID NO：3所示。由于VFI-S2的序列源自淋巴细胞和巨噬细胞双向敏感株89.6，S2的序列。因此，有利于对HIV-1巨噬细胞敏感毒株的抑制作用，从而扩展了药物的临床适应症，特别在中国和亚洲地区。
本发明的编码VFI-S1和VFI-S2的基因可以方便地用人工合成的方法制备。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
本发明的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。适用于本发明的表达载体没有特别限制。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含VFI编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
适用于本发明的宿主细胞没有特别限制，宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS细胞等动物细胞。一种优选的宿主细胞是大肠杆菌。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
本发明的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化的多肽。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
在本发明的一个实例中，就全合成了VFI-S1和VFI-S2的基因，然后克隆入合适的表达载体，在宿主细胞(例如大肠杆菌)中表达，从而生产HIV-1融合抑制物。
在另一优选例中，本发明在重组技术上采用了多倍体基因的构建方法，使这种重组的VFI生产方法极大地提高了产量，在成本上具有合成法无法比拟的优越性，对环境的污染也小于合成法。
除了分别表达VFI-S1和VFI-S2之外，还可以将VFI-S1和VFI-S2融合在一起表达，然后将融合产物切割开，即可获得VFI-S1和VFI-S2的混合物。一种优选的方法是采用本发明制备多倍体基因的相同方法，将VFI-S1和VFI-S2融合在一起，形成VFI-S1和VFI-S2融合基因。另外，还可制备二倍体或四倍体的VFI-S1和VFI-S2融合基因。表达后，用CNBr切割位于各VFI-S1和VFI-S2之间的Met就可获得VFI单体。
此外，在一个表达载体中可含有1∶1的VFI-S1和VFI-S2编码序列，也可含有其他比例的VFI-S1和VFI-S2编码序列(如1∶2等)，这样就可方便地获得混合比例为1∶2的VFI-S1/VFI-S2混合物。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的多肽，即VFI-S2以及药学上可接受的载体或赋形剂。
此外，在本发明药物组合物中，还可含有其他VFI，例如VFI-S1或其他抑制物。一种优选方式是采用VFI-S1和VFI-S2，这有利于通过混合剂型提高疗效。对于VFI-S1和VFI-S2的混合剂型，两者的混合比例通常为1∶10-10∶1，较佳地为1∶2-2∶1，更佳地为约1∶1。
本文所用的术语“安全有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果例如可通过化学标记或抗原水平等方法加以检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效的量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
为了本发明的目的，有效量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克或0.05毫克/千克至10毫克/千克的本发明多肽。此外，本发明的药物组合物还可以与控制释放系统结合，从而降低皮下或静脉用药的剂量。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(即VFI)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。
治疗性组合物中的药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油、和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如作为液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
输药方法
一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是动物；尤其可以治疗人对象。
直接输送该组合物通常可通过皮下、静脉内或肌内注射等方式来实现。组合物也可输送至病灶区。其它给药方式包括口服、栓剂和透皮或经皮肤施用、用针。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。
此外，本发明的药物组合物还可与其他治疗艾滋病的药物一起联用。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明涉及的基因工程重组VFI，是由淋巴细胞和巨噬细胞敏感毒株相关序列编码而成二个类似物，具有显著的HIV-1膜融合抑制作用；同时混合成药物组合物扩展了HIV-1亚型的适用范围。
(2)应用基因全合成方法，根据大肠杆菌偏性密码子构建VFI基因，使VFI能在大肠杆菌中获得表达。
(3)应用具有表达增强序列的载体和多倍体表达系统构建VFI工程菌，使VFI得以大幅表达。
(4)产物采用分离和纯化方法简便，适合大规模生产。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
VFI编码基因的合成
1.基因的设计
按大肠杆菌偏性密码子设计编码S1和S2的全序列(SEQ ID NO：1和3)，分别分割成四个片段如下：
S1：
5′ TAT ACC AGC CTG ATT CAT AGC CTG ATT GAA GAA AGC CAG
3′ATA TGG TCG GAC TAA GTA TCG GAC TAA CTT CTT TCG GTC
① ↓ ②
AAC CAG CAG GAA AAA AAC GAA CAG GAA CTG CTG GAA CTG
TTG GTC GTC CTT TTT TTG CTT GTC CTT GAC GAC CTT GAC
④↑ ③
GAC AAA TGG GCG AGC CTG TGG AAC TGG TTT 3′
CTG TTT ACC CGC TCG GAC ACC TTG ACC AAA 5′
S2：
5′ TAC ACC GAC TAT ATC TAT GAC CTG CTG GAA AAA AGC CAA
3′ATG TGG CTG ATA TAG ATA CTG GAC GAC CTT TTT TCG GTT
①′ ↓ ②′
ACC CAG CAG GAA AAG AAT GAA AAA GAA CTG CTG GAA CTG
TGG GTC GTC CTT TTC TTA CTT TTT CTT GAC GAC CTT GAC
④′↑ ③′
GAC AAA TGG GCG AGC CTG TGG AAC TGG TTT 3′
CTG TTT ACC CGC TCG GAC ACC TTG ACC AAA 5′
2.片段合成
按常规的亚磷酰胺法合成下列寡核苷酸，经HPLC纯化后，用于合成S1基因：
(5′→3′)
①AATTCATGGG ATCCATGTAT ACCAGCCTGA TTCATAGCCT GATTGAAGAA AGCCAGAACCAGCA(64mer)(SEQ ID NO：5)
②GGAAAAAAAC GAACAGGAAC TGCTGGAACT GGACAAATGG GCGAGCCTGT GGAACTGGTTTATGAGATCT TAACTGCA(78mer)(SEQ ID NO：6)
③TTGACGACCT TGACCTGTTT ACCCGCTCGG ACACCTTGAC CAAATACTCT AGAATTG(57mer)(SEQ ID NO：7)
④GTACCCTAGG TACATATGGT CGGACTAAGT ATCGGACTAA CTTCTTTCGGTCTTGGTCGT CCTTTTTTTG CTTGTCC(77mer)(SEQ ID NO：8)
同样，按常规的亚磷酰胺法合成下列寡核苷酸，经HPLC纯化后，用于合成S2基因(5’→3’)：
①：AATTCATGGG ATCCATGTAC ACCGACTATA TCTATGACCT GCTGGAAAAAAGCCAAACCC AGCA(64mer)(SEQ ID NO：9)
②：GGAAAAGAAT GAAAAAGAAC TGCTGGAACT GGACAAATGG GCGAGCCTGTGGAACTGGTT TATGAGATCT TAACTGCA(78mer)(SEQ ID NO：10)
③TTGACGACCT TGACCTGTTT ACCCGCTCGG ACACCTTGAC CAAATACTCT AGAATTG(57mer)(SEQ ID NO：11)
④GTACCCTAGG TACATGTGGC TGATATAGAT ACTGGACGAC CTTTTTTCGG TTTGGGTCGTCCTTTTCTTA CTTTTTC(77mer)(SEQ ID NO：12)
3.拼接全基因：
上述S1和S2片段分别用10mM TrisHCl和0.1mM EDTA溶解，使最终浓度达到1μg/微升。各取10微升再加入10微升TE，总体积50微升。应用从75℃下降到15℃，共退火30分钟的退火程序，获得S1和S2全基因。
4.基因的修饰
对获得的S1和S2基因序列，按常规方法引入内切酶位点，Met，和终止密码子后，N端和C端延伸成为：5′AA TTC ATG GGA TCC ATG …(S1或S2) ATG AGA TCT TAA GTG CA 3′3′ G TAC CCT AGG TAC …(S1或S2)…TAC TCT AGA ATT G 5′
实施例2
VFI的分子克隆和工程菌的构建
1.S1和S2基因的分子克隆：
步骤如下：
(1)将PUC19(Promega公司)用EcoRI和PstI双酶切，取1微克PUC19电泳条带溶于10微升H2O中。
(2)S1和S2片段5微升分别加上PUC19质粒片段5微升和T4DNA连接酶1.0微升，连接缓冲液1.5微升，H2O 2.5微升，16℃连接过夜。获得连接产物。
(3)按常规方法，用连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α(Gibco公司)。
(4)筛选阳性克隆：铺板、培养、扩增、酶切并进行阳性克隆序列测定。
结果获得单倍体克隆PVFIS1和PVFIS2。
2.建立多倍体分子克隆：
按图1所示路线建立二倍体或四倍体克隆。即分别由BamHI，PstI和BglII，PstI双酶切质粒，将获得的相应片段连接，克隆，VFI序列由单倍体形成为二倍体。图中BB(ggatct)由BamHI和BglII连接形成的序列，不再为二者识别。重复上述克隆过程形成四倍体。
具体而言，按以下步骤进行：
①对挑选的阳性克隆PVFIS1提取质粒。将质粒PVFIS1分为二份，一份用
BamHl+Pst I双酶切，凝胶电泳，回收小片段。另一份用BglII+PstI双酶切，回收大片段。
②连接上述大DNA片段和小DNA片段，再转化大肠杆菌DH5α，筛选出阳性克隆，获二倍体克隆。
③重复上述克隆过程，最后获得VFI-S1的四倍体克隆，即P4XVFIS1。
用同样方法，不同点仅在于用和PVFIS2替换PVFIS1，结果获得VFI-S2的四倍体克隆，即P4XVFIS2。
3.构建表达载体：
按以下步骤，将四倍体VFI基因分别从P4XVFIS1和P4XVFIS2转入原核表达载体PET3a(Invitrogen公司)：
①合成下列引物，并分别以P4XVFIS1和P4XVFIS2为模板，作PCR反应，获得PCR产物：
5′引物：CGA CGG CCA GTC ATA TGA TGG GAT CCA TGT A(31mer)(SEQ ID NO：13)
3′引物：C CAA GCT TGC ATG CCA TAT GTT AAG ATC TCA TAA ACC(37mer)(SEQID NO：14)
②载体PET3a DNA和PCR反应产物(包括4XVFIS1和4XVFIS2)分别用内切酶NdeI消化，37℃，1小时。琼脂糖凝胶电泳分离纯化。
③纯化的酶切片段用T4连接酶连接，室温反应过夜。
④连接产物用电转法转化入大肠杆菌BL21(Gibco公司)，接种到LB+AMP琼脂平板，37℃培养过夜。
⑤选取十个单一细菌克隆，用LB+AMP液体37℃扩增过夜。
⑥各取2ul菌液作为模板，以5′-3′T7通用引物和3′-5′引物(SEQ ID NO：14)作PCR反应，筛选出阳性细菌克隆。
⑦提取阳性克隆质粒，进行DNA测序，确认插入片段的序列与设计的VFI基因序列一致。将经序列分析验证的阳性细菌克隆用作工程菌，分别命名为PET4XVFIS1/BL21和PET4XVFIS2/BL21。
实施例3
VFI表达产物的分离纯化
将实施例2中获得的大肠杆菌4XVFIS1/BL21和4XVFIS2/BL21分别在37℃培养4小时后，IPTG诱导2小时，菌体作SDS-PAGE电泳，检查表达的蛋白条带，并扫描计算蛋白表达量(见图2)。
VFI-S1/BL21和VFI-S2/BL21大肠杆菌的扩大培养。菌体分别悬浮于10mMTris-HCl和1mM EDTA(pH8.5)溶液中，超声或匀浆破壁，离心获得上清液，经QSepharose Fast Flow(Phamacia.)柱层析，0-1M NaCl梯度洗脱，收集VFI峰。透析除盐后，经SP Sepharose Fast Flow(Phamacia.)柱层析，0-1M NaCl洗脱，收集VFI峰，冷冻干燥。
冻干产物按0.16mg VFI加入0.5M CNBr0.2ml(CNBr溶于80％甲酸中)。室温裂解过夜，裂解液加入1.3ml H2O，终止半小时以除去CNBr，然后再冷冻干燥。干燥物溶于10mM磷酸缓冲液，pH5.0溶解，经DEAE柱层析，用0-1mM NaCl洗脱，收集VFI单体峰(见图3)。VFI-S1和VFI-S2的蛋白质产率分别约为菌体的25％。
实施例4
抗HIV-1膜融合活性测定
HIV-1膜融合抑制试验：应用HIV-1感染细胞株HIV-1SF33-Jurkat(可获自加里佛尼亚大学癌症研究所)和CD4+SupT细胞株(可获自ATCC)混合培养的方法，测出VFI抑制HIV-1诱生的细胞-细胞融合的浓度IC50和C90。
试验应用96孔平底培养细胞板进行。待试药物贮备液(1mg/ml的10％ DMSO溶液)，以10倍稀释度进行一系列稀释。然后在细胞培养板各孔中加入2微升稀释液。用RPMI1640培养基作对照。靶细胞和HIV-1感染细胞以2∶1比例加入，即2×104∶1×104，细胞混合培养3小时后。
结果
VFI对HIV-1诱导的膜融合的抑制作用如图4所示。图4(a)中，HIV-1感染细胞与CD4+靶细胞混合培养3小时后出现细胞病变，包括细胞凝集，形成巨核细胞和气球样病变；图4(b)中，在VFI-S1或VFI-S2的作用下，HIV-1引起的细胞病变被抑制50％；图4(c)中，VFI抑制细胞病变90％；图4(d)VFI与CD4+靶细胞单独培养，不出现细胞病变。VFI-S1和VFI-S2对细胞病变的抑制作用，在形态学上的变化是一致的。
根据细胞病变范围确定引起50％和90％抑制作用的药物浓度(表1)。
表1 本发明VFI抑制HIV-1融合的活性。 VFI VFI-S1 VFI-S2 IC50/nM 10.5 25.0 IC90/nM 50.0 75.0
表中，IC50/nM和IC90/nM分别是达到50％和90％抑制HIV-1膜融合的药物浓度。
实施例5
药物组合物
VFI-S1和VFI-S2冻干粉末各1毫克，溶解于1毫升PBS缓冲液中，制成注射用针剂。也可以将VFI-S1和VFI-S2冻干粉末各1毫克置于小瓶中，在使用前与1毫升PBS混合即可。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>华北制药集团有限责任公司
上海桑拜生物技术有限公司<120>重组的人类免疫缺损病毒融合抑制物及其制法和用途<130>021193<160>14<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>108<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(108)<223>HIV-1融合抑制物VFI-S1序列<400>1tat acc agc ctg att cat agc ctg att gaa gaa agc cag aac cag cag 48Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln1 5 10 15gaa aaa aac gaa cag gaa ctg ctg gaa ctg gac aaa tgg gcg agc ctg 96Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
20 25 30tgg aac tgg ttt 108Trp Asn Trp Phe
35<210>2<211>36<212>PRT<213>人工序列<400>2Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln1 5 10 15Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
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35<210>3<211>108<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(108)<223>HIV-1融合抑制物VFI-S2序列<400>3tac acc gac tat atc tat gac ctg ctg gaa aaa ggc caa acc cag cag 48Tyr Thr Asp Tyr Ile Tyr Asp Leu Leu Glu Lys Ser Gln Thr Gln Gln1 5 10 15gaa aag aat gaa aaa gaa ctg ctg gaa ctg gac aaa tgg gcg agc ctg 96Glu Lys Asn Glu Lys Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
20 25 30tgg aac tgg ttt 108Trp Asn Trp Phe
35<210>4<211>36<212>PRT<213>人工序列<400>4Tyr Thr Asp Tyr Ile Tyr Asp Leu Leu Glu Lys Ser Gln Thr Gln Gln1 5 10 15Glu Lys Asn Glu Lys Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
20 25 30Trp Ash Trp Phe
35<210>5<211>64<212>DNA<213>寡核苷酸<400>5aattcatggg atccatgtat accagcctga ttcatagcct gattgaagaa agccagaacc 60agca 64<210>6<211>78<212>DNA<213>寡核苷酸<400>6ggaaaaaaac gaacaggaac tgctggaact ggacaaatgg gcgagcctgt ggaactggtt 60tatgagatct taactgca 78<210>7<211>57<212>DNA<213>寡核苷酸<400>7ttgacgacct tgacctgttt acccgctcgg acaccttgac caaatactct agaattg 57<210>8<211>77<212>DNA<213>寡核苷酸<400>8gtaccctagg tacatatggt cggactaagt atcggactaa cttctttcgg tcttggtcgt 60cctttttttg cttgtcc 77<210>9<211>64<212>DNA<213>寡核苷酸<400>9aattcatggg atccatgtac accgactata tctatgacct gctggaaaaa agccaaaccc 60agca 64<210>10<211>78<212>DNA<213>寡核苷酸<400>10ggaaaagaat gaaaaagaac tgctggaact ggacaaatgg gcgagcctgt ggaactggtt 60tatgagatct taactgca 78<210>11<211>57<212>DNA<213>寡核苷酸<400>11ttgacgacct tgacctgttt acccgctcgg acaccttgac caaatactct agaattg 57<210>12<211>77<212>DNA<213>寡核苷酸<400>12gtaccctagg tacatgtggc tgatatagat actggacgac cttttttcgg tttgggtcgt 60ccttttctta ctttttc 77<210>13<211>31<212>DNA<213>引物<400>13cgacggccag tcatatgatg ggatccatgt a 31<210>14<211>37<212>DNA<213>引物<400>14ccaagcttgc atgccatatg ttaagatctc ataaacc 37