一种用于均相检测核酸的特异性双链探针及其实施方法 【技术领域】
本发明涉及一种用于核酸的均相特异性检测的新式探针，包括核酸的实时检测。
背景技术
传统的对核酸的特异性检测方法要求将杂交与未杂交的探针分离出来，而新的均相检测方法则取消了分离步骤，并且速度更快，简单并容易定量。已有多种核酸扩增技术被发明并且可以在2-3小时内扩增特异的核酸序列至几百万倍。然而，主要的凝胶电泳分析方法极大的妨碍了其在临床上的广泛应用。近来，均相检测与这些扩增技术的结合，特别是聚合酶链式反应(PCR)，极大的提高了核酸的基础诊断。因此定量实时PCR检测技术变得越来越广泛。
当前实时荧光PCR检测技术可以分为探针型和非探针型。探针型检测技术使用荧光探针，例如：5’-核酸外切酶技术(TaqMan探针)、分子信标、荧光能量转移探针、蝎子引物、点亮探针等。非探针型检测技术则使用荧光染色，例如SYBR GREEN1，以显示反应。非探针型检测技术尽管简单，但因其无法识别非特异扩增而在实际应用中受到很大限制。相对而言，探针型检测技术由于有第二识别步骤而更加可靠。但是，如前所述的这些目前的探针普遍存在设计及制造上复杂且价格昂贵等缺点。并且当前探针的另一个缺点在于其有限的特异性。即使是被称为最精确之一的分子信标，在一些具体实施中也不得不改进以识别单核苷突变。
本发明涉及用一种对核酸检测的均相特异性探针和新式探针。该探针在基本概念上与当前的探针不同。其设计简单、易于准备、便宜、非常精确，而且可以与当前任何核酸扩增技术相结合。
根据本发明的双链探针检测技术是基于寡核苷酸之间的杂交，竞争性反应超过当前探针使用的直接杂交。该探针不仅可以取得比当前探针更简单地方式，而且拥有比当前探针更多的优点。
发明概要
本发明涉及一种为核酸检测及其应用而特别设计的探针。该探针特别用于检测一种均相形式的核酸。该探针由两条被标记的不同长度的互补的寡核苷酸组成：其中一条上标记荧光供体，另一条标记淬灭剂或者荧光受体。在合适的条件下，探针是双链的。当探针链与靶杂交时，荧光强度发生改变。该探针在室温下可以识别与其完全匹配的靶序列，但与包含一个单个碱基突变的“靶序列”不发生反应。根据本发明的探针可以被用于实时核酸扩增检测技术。
根据本发明的探针可以由DNA，RAN，或者由二者共同组成。其可以由非自然核苷及非自然核苷链组成。其3’端可以被封闭以使之不能延伸。当我们提及探针的“寡核苷酸”时，包括前述部分。
本发明还涉及双链探针技术的应用。用于杂交检测单链靶序列的前述探针，检测双链靶的技术，如典型的PCR扩增，也可以包括有同样长度的互补寡核苷酸的双链探针。
【附图说明】
图1、双链探针及其反应原理的示意图。
图2、双链探针在PCR检测时处于变性及退火阶段的反应原理示意说明。
图3、与靶完全匹配及单核苷突变的双链探针的反应机制。
图4、双链探针实时PCR检测。从上至下，模板被连续10倍稀释，直至最后样品水。
图5、在实时PCR使用单核苷突变检测用于同样的反应管中，一双链探针与野生型靶互补，第二双链探针与突变靶互补。
【发明内容】
双链探针构成
依据本发明的双链探针由一对互补的不同长度的寡核苷酸构成。其中一条链标记荧光剂，而另一条标记淬灭剂。在少数的特定的具体实施中，淬灭剂可以由一种荧光剂的荧光受体代替。双链探针在不同的条件下可以有不同的形态，并反应在荧光的变化上。当在稳定的双链结构中自身杂交时，荧光剂及淬灭剂，或者荧光供体及受体，十分靠近。荧光剂或者供体被淬灭剂或者受体淬灭，在荧光剂或者供体的荧光发射波长内探针没有荧光。当在变性的条件下，比如在酸性，碱性或者高温溶液中，探针的双链分离，荧光剂(或者荧光供体)发出荧光。在杂交溶液中存在靶序列时，较长的探针可以自发地与靶杂交，双链探针分离，荧光剂(或者荧光供体)发出荧光。
双链探针与靶自发地发生反应
不同长度的链的双链探针可以与溶液中单链寡核苷酸发生反应。在这种反应中，双链 探针中的短链可以被靶寡核苷酸序列置换形成一种热力学更稳定的复式结构。双链探针分离的结果引起荧光的产生。在该反应中，双链探针的简单设计的实施方案有能力在室温下可以将完全匹配的靶从单核苷突变的靶中检测出来。其非常高的特异性基于在与探针本身的双链结构比探针和靶形成的结构更稳定。双链探针比单链探针更优越，因为单链探针能量是不稳定，并即使靶序列存在突变时其可以与其他单链多核苷酸杂交。分子信标比线性探针更特异是因其稳定的茎环结构可以减少较不稳定的突变反应。然而，分子信标的识别部分—环，仍然是单链，如果茎不够长或者环序列太长的话，其仍留有突变杂交的空间。近来的一份报告反应当分子信标与NASBA(一种著名的等温核酸扩增技术)结合时不能直接用于单核苷的区别。
根据图1，双链探针1由互补的不同长度的寡核苷酸2、3组成。较长的链，在本例中为正链2，用荧光剂4标记，较短的负链3用淬灭剂5标记。该探针不发荧光因为荧光剂与淬灭剂紧密靠近。在靶6存在时，负链3被靶置换，并远离荧光剂4，从而发出荧光。如果荧光剂4与淬灭剂相互交换，可以得知荧光同样也会产生。
双链探针与核酸扩增的结合使用
如上所述，根据本发明的双链探针可以与单链靶自发反应。我们发现，其也可以被用于检测在实时反应中新产生的单链扩增产物。在典型PCR周期中包括高温变性、低温退火及造温延伸。双链探针在变性(或者溶化)阶段因高温变性并产生荧光。在退火阶段，如果没有靶存在，探针的双链将处于双链结构，因此将不产生荧光。但是，当靶存在时，两个探针将与靶杂交，因此将产生荧光。在延伸阶段，探针链从靶上解离，通过对PCR阶段的每次退火步骤的测量，在实时状态中扩增产物可以被检测。
在退火阶段，如果靶不存在，该探针将自身退火并不发出荧光。可是，当靶存在时，该探针的有荧光标记的链，即所说的正链，从负链分离，与靶杂交，并发出荧光。当温度升高时(72℃)，引物可以延伸，双链探针与靶分离不影响链的延伸，通过在每个周期的退火阶段测量荧光的亮度，PCR反应在实时状态被检测。
根据图2所示一种双链探针21和双链扩增产物30，在媒介PCR周期中二者都存在于PCR扩增反应中。探针21包括链22，由荧光剂24标记，以及互补的链23，由淬灭剂25标记。标记可以被标于链的平端的终端，如图所述，链22、23是同等长度的，他们可以但不是必须用在实时PCR。扩增产物30包括互补的链31、32，在高温变性时，探针的链22、23相分离，扩增产物的链31、32也同样分离。当温度低于退火温度时(为PCR引物退火)，探针链22、23退火或者和其互补的扩增产物的靶的链杂交。荧光剂24不被淬灭剂淬灭，而发出荧光。
双链探针的设计方法
双链的相对长度：在大多数情况下，探针的双链长度不同，一般的，对于PCR，较长的链比较短的链长1-5的基本长度，对于等温等位基因，两条链的长度差为2-10个基本长度，最佳为2-7。根据本发明的一部分具体实施方案的技术中，如用于RNA检测的双链探针或者用于实时PCR的双链探针，其正负靶链与探针链分别杂交，两个链可以是同等长度。
双链探针的标记位置：荧光剂与淬灭剂均可标记在终端或者中部。在具体实施中，它们也可以被标记在互补的双链的终端。特别的，荧光剂与淬灭剂可被标记在探针的平端。在一些情况下，特别是当探针被荧光剂能量供体或者受体标记时，其标记的位置可以根据最佳能量传送调整。一些特定的但不是有限的具体实施中，荧光能量供体与受体都标记在探针双链的终端，其中一个链一般用加磷的基团封闭。
双链探针的最合适的结构：双链探针可以与普通的核酸扩增(特别是PCR)结合使用，在实时和反应完成后可以与被测量的扩增产物相结合。对于实时检测，荧光剂在退火温度时被测量。当前可利用的实时扩增/检测仪器和可使用的双链探针包括：AppliedBiosystems(ABI)公司的Model7700及Model5700，Bio-Rad公司的IQ Cycler，Hoffmann-La Roche公司的LightCycler以及Corbett Research公司的Rotor-Gene2000等等。
双链探针的积极效果
设计简单方便：在设计双链探针时其对整个反应体系没有太多的要求。与当前双染料标记探针或者相邻杂交探针相比，其设计本身十分简单。根据本发明探针可以由任何熟悉通常探针设计的人来设计。
制备简单：标记过程仅是单一染色修饰，包括在对双链探针的链的准备过程中，其可以被任何无需附加技术设备的DNA合成实现。纯化仅需一步。这比其他需要多步修饰及纯化，并且产率低，价格贵的双修饰探针先进。
高特异性：分子信标已经证明，结构限制型探针特异性比通常的线性探针高。双链探针是在概念上是一种结构限制型探针。仅当释放的能量大于双链探针的产生的能量时，该探针可以与靶杂交。如果靶发生突变时，该双链探针保持能量稳定性的，其可以保持自身的双链状态而不发生任何反应。
具体实施例
实施例1：双链探针与靶自发的发生自发反应
10mM Tris-HCI(Ph8.0)中的0.80μM的两探针50μL，内含1.5mM MgC12，保持在25℃，由Varian公司的荧光分析器Eclipse随时测量。在25℃时测定荧光强度2分钟。然后加入二倍摩尔浓度(16μM的5μL溶液)的靶寡核苷酸，每隔15秒记录荧光剂的荧光信号。探针两个链的核苷序列为5’FAM-ACGAACCTCAAACAGACACCAT-3’(长链)和5’-TGTCTGTTTGAGGTTGCT-dabcyl-3’(短链)。与长链互补的靶的序列为：5’-CCATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCT-3’，靶包含的单核苷置换(突变的靶)序列是5’-CCATGGTGTCTGTTTCAGGTTGCT-3’，其中下划线处证明该核苷被置换。
图3表示对完全互补的靶(线41)和突变的靶(线42)的实时荧光信号(F)观测。可以发现荧光强度上升了20倍以上。如果在靶中有一个单核苷突变，将不会产生荧光信号。
实施例2：人的β珠蛋白双链探针实时PCR检测
为测试作为在PCR技术中实时扩增产物的检测器的双链探针的有效性，PCR模板为一系列稀释样品。每50μL反应包括5μL系列稀释的模板，0.2μM的双链探针，每个引物0.4μM，2.0单位的Taq酶，每daTP200μM，50mM KCI，2.0mM MgCl2，以及10mMTris-HCI(pH8.3)。经94℃，5分钟变性，用荧光扩增仪(Rotor-Gene 2000，CorbettResearch)，在封闭的试管中执行扩增40个循环(95℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟)。荧光数据在退火阶段被采集。提取的原始DNA模板10倍稀释。水作为对比样品。双链探针包括一个与扩增产物互补的核酸序列。简单来说，探针与靶互补，然而，熟悉扩增及检测的人们将通过我们所说的“靶”了解到在本案中是完整的单链靶及其互补物，二者都是PCR扩增产物的上游及下游。扩增人β珠蛋白基因(GenBank codeHuMMB5E，-195~＝73)，扩增片段长268bp。其引物分别为5’-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3’及5’-CAACTTCATCCACGTTCACC-3’，探针的靶序列被置于扩增产物的中部，探针正链与负链分别为5’-FAM-AGCAACCTTCAAACAGACACCATGG-PO4-3’及5’-GGTGTCTGTTTGAGGTTGCT-dabcyl-3’。
在PCR扩增时荧光(F)实时检测测量了40个循环，其结果如图4所示。初始的靶浓度在稀释物最浓时的线51持续降低至最稀时的线54。线55说明无靶(水)的对比。
与引物相同的浓度下，双链探针可以很快与靶反应。没有靶时，探针片段很快地互相结合并淬灭其自身的荧光。因此，它们可以用于实时核酸检测技术。用于检测人类β珠蛋白的PCR技术中，我们选择一个熔化温度(Tm)接近于引物的20核苷的负链，和一个为了取得一个探针—靶杂交的熔点高于10℃的24核苷的正链。我们称该探针为“24/20探针”。在退火阶段，该探针在靶不存在时自身退火不发出荧光。但是，在靶存在时，探针的正链与负链分离，与靶杂交，并发出荧光。当温度上升致使引物可以延伸时(72℃)，探针的双链与靶相分离并不影响链的延伸。
不同长度的11个双链探针(22/22至22/17及20/20至20/16)都被研究，即使双链是等长的，它们在实时PCR中均工作良好。这些发现证明了对于实时PCR，双链探针的设计具有很强的适应性。
实施例3：实时PCR突变检测
为论证本发明的探针与实时PCR在单核苷突变检测中的效用，我们准备了两个模板，一个是从人β珠蛋白基因中提取的模板(靶)DNA，另一个通过单核苷突变的。我们同样准备了一个与“野生型”靶互补的双链探针和一个与“突变型”靶互补的双链探针。我们设计的用于Taq DNA聚合酶的探针在探针—靶杂交时熔点比典型的PCR退火温度(大约50℃)高约10℃，比特定延伸温度(大约72℃)低约10℃。该探针均为24/20探针(阳极链长为24核苷，比阴极链长4个核苷)。一探针与标有FAM的野生型的靶互补，另一探针与标有Texas Red的突变异种的靶互补。均有dabcyl淬灭剂。均由探针限制延伸物封闭。因为有不同的荧光光谱，每个荧光剂可以被区别检测。在存在的两个双链探针中我们做了4个PCR反应。4个反应的扩增的靶不同，分别为：无(阴性)靶序列，仅为野生型靶(Wild)，仅为突变型靶(Mutant)，以及野生型与突变型靶均有(Wild+Mutant)的反应。
探针的正链特异于人β-珠蛋白基因的野生型序列，其是一个24-mer的序列：FAM-5’-AGCAACCTCAAACAGACACCATGG-3’-PO3，而探针的负链是一个20-mer的序列：5’-ATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCT-3-dabcyl。特异于突发型版本的β珠蛋白的探针的两个链是：Texas Red-5’-AGCAACCTGAAACAGACACCATGG-3’-PO3及5’-ATGGTGTCTGTTTCAGGTTGCT-3’-dabcyl。每个探针的两条链在将它们加入反应混合前都被互相退火。与野生型及突变型的β-珠蛋白相应的DNA模板通过生物体外的突变形成方式准备。用于实时PCR的引物为5’-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3’及5’-CAACTTCATCCACGTTCACC-3’。每50个微升反应包括5000模板拷贝，0.4微升引物，每个探针的0.2微升正链及0.24微升负链，随同PCR所要求的的4.0mM MgCl2和其他组分。在一个荧光热周期中执行94℃温育反应混合物5分钟，再经过30秒95℃，50℃60秒，72℃1分钟，40循环。荧光在退火阶段被监测。图5显示了实时荧光PCR循环数据的结果。相对于野生型靶的探针发出的荧光被实心圆环表示(黑点)，相对于突变异种靶的探针发出的荧光被空心的圆环表示。
相对于阴性样本，野生型探针(曲线71)，及突变型探针(曲线72)，均没有发出荧光(F)。结果显示仅当模板包括在反应中相应荧光强度的增加。当两个靶均在样本中时，野生型探针(曲线73)，及变异探针(曲线74)，荧光强度显著增加。但是，对于野生型靶，荧光强度显著增强来自于野生型探针(曲线75)，而不是突变异种型探针(曲线76)。相反，对于突变型靶，荧光强度显著增强来自于突变型探针(曲线78)，而不是野生型探针(曲线77)。结果显示仅仅是匹配的探针可以产生正确的信号。野生模板与突变异种模板的100％完全检测。这证明了根据本发明的探针通过一个单核苷区分了靶。当无模板时无信号被发现，当有两个模板时，两个信号均被发现。
我们还研究了在双链探针中温度“窗口“，可以被用于分离单核苷突变。已有的研究显示分子信标有一个比线性探针大的窗口，因此，较好分离。虽然如此，分子信标的窗口在低温时还没有足够大到可以分离，这解释了报告的分子信标在分离等温扩增中的等位基因的失败的原因。我们发现根据本发明的双链探针有更大的窗口，可以相信使它们可以适合于等温扩增反应中的区分。