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含促调亡蛋白质的治疗剂
    本发明要求美国临时专利申请序列号60/306,091的优先权，提交于2001年7月17日；美国临时专利申请序列号60/332,886的优先权，提交于2001年11月6日；美国临时专利申请序列号60/360,361的优先权，提交于2002年2月28日，它们全部纳入本文供参考。

    发明的技术领域

    本发明针对细胞生物学和分子生物学及癌生物学的领域。更具体的是，本发明提供涉及治疗剂的方法和组合物，治疗剂包括促凋亡部分和细胞‑特异的靶向部分。

    发明的背景

    选择性破坏单个细胞通常在多种临床情况中是需要的。细胞中多种信号转导途径与细胞死亡和存活相连，途经的限制性和/或关键成分的传递可根据其破坏产生。这种信号转导途径的一个经典例子是细胞凋亡，多种细胞凋亡途径的因子可用于靶向死亡细胞。细胞凋亡或细胞程序性死亡是控制正常组织稳态的一个基本过程，这是通过调节细胞增殖和死亡间的平衡(Vaux等，1994；Jacobson等，1997)。

    丝氨酸蛋白酶粒酶B(GrB)(Lob等，1986；Schmid和Weissman，1987；Trapani等，1988)整体参与凋亡细胞死亡，靶细胞中的细胞死亡通过细胞暴露于溶酶体样胞质颗粒(或溶细胞颗粒)的内含物来诱导，这种颗粒发现于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和天然杀伤(NK)细胞中(Henkart，1985；Young和Cohn，1986；Smyth和Trapani，1985)。细胞毒性淋巴细胞颗粒包含穿孔素、成孔蛋白质和定义为粒酶的丝氨酸蛋白酶家族(表1)。穿孔素的一些结构和功能类似于补体蛋白质C6、C7、C8和C9、补体攻膜复合体的成员(Shinkai等，1988)。在淋巴细胞‑介导的细胞溶解中，穿孔素插入靶细胞膜并表现出聚合以形成孔(Podack，1992；Yagita等，1992)，这介导粒酶B进入靶细胞的细胞质。一旦进入，粒酶B通过直接活化胱冬酶和引起DNA迅速断裂来诱导细胞凋亡(Shi等，1992)。

    表1：粒酶(淋巴细胞丝氨酸蛋白酶)

       名称  种类  其它名称 酶活性  A  小鼠  大鼠  人  Hanukah因子、MTSP、SE‑1、CTLA‑3  RNKP‑2、片段化酶1  Hanukah因子、HTSP‑1、粒酶1 类胰蛋白酶  B  小鼠  大鼠  人  CCP‑1、CTLA‑1  片段化酶2、RNKP‑1  HLP、粒酶2、HSE26.1、CSPB 天冬氨酸酶 (Asp‑ase)  C  小鼠  大鼠  CCP‑2  RNKP‑4 未知  D  小鼠  CCP‑5 未知  E  小鼠  CCP‑3、MCSP2 未知  F  小鼠  CCP‑4、MCSP3 未知  G  小鼠  MCSP1 未知  H  人  CCP‑X、CSP‑C Chymase  I  大鼠  GLP I和II 未知  J  大鼠  RNKP‑5 未知  K  大鼠  人  类胰蛋白酶2、片段化酶3  粒酶3 类胰蛋白酶 类胰蛋白酶  M  大鼠  人  RNK‑Met‑1  甲硫氨酸酶 甲硫氨酸酶

    粒酶结构相关，但有不同优选底物。粒酶B通过其在天冬氨酸残基后裂解的独特能力可体外裂解许多胱冬酶原(procaspase)，它是分析胱冬酶‑3(Darmon等，1995；Quan等，1996；Martin等，1996)、胱冬酶‑7(Chinnaiyan等，1996；Gu等，1996；Fernandes‑Alnemri等，1995)、胱冬酶‑6(Orth等，1996；Fernandes‑Alnemri等，1995)、胱冬酶‑8(Muzio等，1996)、胱冬酶‑9(Duan等，1996)和胱冬酶‑10a/b(Fernandes‑Alnemri等，1996；Vincenz和Dixit，1997)成熟的一个重要工具。此外，它对靶细胞有高毒性(Shi等，1992)。到目前为止假定粒酶B通过直接活化胱冬酶杀伤细胞，在一些情况下通过直接破坏下游胱冬酶底物来补充(Andrade等，1998)。进入细胞溶胶后，粒酶B迅速转位到核(Jans等，1996；Trapani等，1996)并可裂解多(ADP‑核糖)聚合酶和核基质抗原，有时用与胱冬酶优选不同的裂解位点(Andrade等，1998)。尽管许多胱冬酶原在体外有效裂解，粒酶B诱导的胱冬酶活化以等级方式在完整细胞中发生，在处决者胱冬酶如胱冬酶‑3水平开始，接着是胱冬酶‑7(Yang等，1998)。这与FasL‑介导的杀伤相反，FasL‑介导的杀伤依赖顶端胱冬酶如胱冬酶‑8产生的膜信号(Muzio等，1996；Sarin等，1997)。此外，一些研究显示粒酶B也可通过不依赖胱冬酶的机制诱导死亡，包括直接破坏非核结构，尽管此途径中的关键底物尚未阐明(Sarin等，1997；Trapani等，1998；Heibein等，1999；Beresford等，1999)。

    Froelich和同事的研究表明GrB通过受体‑介导的内吞作用内在化，穿孔素的作用是介导粒酶B从胞吞小泡中释放。事实上，穿孔素可被其它破坏泡的因子取代，如腺病毒产生的因子(Froelich等，1996；Pinkoski等，1998；Browne等，1999)。

    粒酶一般高度同源，与GrB有38‑67％的同源性(Haddad等，1991)，它们包含胰蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶的催化三联体(His‑57、Asp‑102和Ser‑195)。其它特征包括成熟的N末端Ile‑Ile‑Gly‑Gly序列、三或四个二硫桥和保守基序(PHSRPYMA)，此基序也出现在嗜中性白细胞组织蛋白酶G和肥大细胞糜酶(chymases)中。粒酶的碳水化合物部分是Asn‑相连(Griffiths和Isaaz，1993)。粒酶mRNA转录物翻译成前蛋白酶原。前或前导序列在内质网被信号肽酶裂解。当前肽被去除时，失活的前粒酶(酶原)成为活性蛋白酶。粒酶前肽序列开始于前导肽后并结束于N末端Ile前，需要蛋白酶以折叠成催化构象(Kam等，2000)。

    在迄今鉴定的多种细胞凋亡因子中，Bcl‑2家族成员代表此死亡途径的一些意义明确的调节物。Bcl‑2家族的一些成员促进细胞存活，包括Bcl‑2、Bcl‑XL、Ced‑9、Bcl‑w等，其它成员显示加强细胞凋亡，包括Bax、Bcl‑Xs、Bad、Bid、Bak、Bik和Bim(Adams和Cory，1998)。到目前为止关于Bcl‑2家族成员可能的生物功能提出了一些不同的假设。这些包括二聚物形成(Oltvai等，1993)、蛋白酶活化(Chinnaiyan等，1996)、线粒体膜去极化(6)、产生反应性氧中间物(Hockenbery等，1993)、调节钙流出(Lam等，1994；Huiling等，1997)和孔形成(Antonsson等，1997；Marzo等，1998)。

    Bcl‑2家族的一个21kDa死亡‑促进成员Bax是第一个鉴定为与来自不同细胞系的Bcl‑2共免疫沉淀的蛋白质(Oltvai等，1993)。过度表达Bax加速响应多种细胞毒性结果的细胞死亡。确定Bax蛋白的氨基酸序列显示它与Bcl‑2高度同源。Bax基因由6个外显子组成且产生另外的转录物，它的主导形式编码1.0kb mRNA并命名为Baxα。像Bcl‑2和一些其它Bcl‑2家族成员，Bax蛋白有高度保守的区域BH1、BH2和BH3结构域，这些蛋白质序列的亲水分析表明在它们的C末端存在疏水的跨膜区段(Oltvai等，1993)。

    Bax广泛表达，没有任何明显的组织特异性。然而，在诱导细胞凋亡中，Bax转位到线粒体中，导致线粒体功能紊乱和释放细胞色素c，细胞色素c随后活化胱冬酶途径(Hsu和Youle，1997；Wolter等，1997；Gross等，1998)。此转位过程迅速且发生在细胞凋亡的早期阶段(Wolter等，1997)。Bax在人卵巢癌中通过腺病毒基因转移来选择性过度表达，导致在体内显著杀伤肿瘤细胞(Tai等，1999)。通过二元(binary)腺病毒系统在来自人肺癌的培养细胞系中过度表达Bax基因导致胱冬酶活化、细胞凋亡诱导和细胞生长抑制。此外，肿瘤内注射表达Bax基因的腺病毒载体抑制裸小鼠中建立的人肺癌异种移植物生长(Kagawa等，2000；Kagawa等，2000)。

    WO 99/45128和Aqeilan等(1999)针对有细胞靶向特异性和细胞凋亡‑诱导活性的嵌合蛋白质，具体是重组嵌合蛋白质IL‑2‑Bax，特异靶向IL‑2受体表达的细胞并诱导细胞特异的细胞凋亡。

    WO 99/49059涉及一种嵌合毒素，此毒素包括促性腺激素释放激素(GnRH)和假单胞菌外毒素A(PE)以检测人腺癌表达的肿瘤相关抗原表位。

    WO 97/46259涉及靶嵌合毒素，此毒素包括针对瘤性细胞的靶向细胞部分和杀伤细胞部分。在一个具体例子中，嵌合毒素包括促性腺激素释放激素同系物和假单胞菌外毒素A。

    WO 97/22364涉及过敏反应的靶向治疗，其中嵌合细胞毒素Fc_2’‑3‑PE₄₀针对表达FccRI受体的细胞的靶向去除。

    尽管描述了一些嵌合蛋白质组合物，需要其它方法和组合物改进治疗，包括杀伤细胞。

    发明的概述

    本发明涉及的方法和组合物包括传递嵌合多肽，嵌合多肽含诱导靶细胞死亡的信号转导途径因子。在一个较佳实施方案中，此因子是促凋亡因子。

    几乎所有细胞包含倡导细胞死亡(细胞凋亡)的机制。因此在一些实施方案中，本发明涉及一些促凋亡蛋白的传递，这些蛋白是对靶细胞内部作用的主要介体，通过细胞凋亡机制导致细胞死亡。诱导细胞凋亡的部分在嵌合多肽进入靶细胞时引起细胞程序性死亡，传递嵌合多肽用于通过细胞‑特异的靶向部分来结合靶细胞。在本发明的一些实施方案中和作为相对本领域已知方法的一个优点，促凋亡多肽作为蛋白质传递而不是作为核酸分子翻译以产生所需多肽。另外的优点是人的序列被用于本发明嵌合多肽以避免任何来自外源多肽的不需要的免疫应答。

    在其它实施方案中，粒酶A或粒酶B是诱导细胞凋亡的介体。在具体的实施方案中，重组配体(VEGF)和/或重组抗体(scFvMEL)部分作为核酸序列与编码粒酶或Bcl‑2家族成员的序列融合。发明者在本文列出数据，证明嵌合多肽如粒酶B‑vegf121和粒酶B‑scFvMEL对靶细胞有细胞毒性。考虑到技术人员认识到有多种类似的细胞靶向和促细胞凋亡的例子可互换用于本文具体例子，表明含促凋亡蛋白的构建有重要的治疗潜力用于治疗疾病状态并代表一类有新作用机制的新治疗剂。

    在一个实施方案中，促凋亡蛋白用作嵌合蛋白质中的杀伤部分，使用结合黑素瘤细胞的细胞表面抗原gp240并有效内在化的重组抗体(scFvMEL)。发明者将编码scFvMEL的基因分别融合编码Bax、截短的Bax1‑5和Bax345的基因(分别命名为scFvMEL‑bax、scFvMEL‑Bax1‑5和scFvMEL‑Bax345)。这些基因插入表达蛋白质的载体并转化到细菌中。融合蛋白质被纯化、试验抗培养的靶细胞并显示对靶细胞有细胞毒性。这表明促凋亡蛋白Bax的构建有重要的治疗潜力用于治疗疾病并代表一类有新作用机制的新治疗剂。

    本发明的一个目标是一种嵌合多肽，多肽包括细胞‑特异的靶向部分和信号转导途径因子。

    本发明的另一个目标是一种嵌合多肽，多肽包括细胞‑特异的靶向部分和细胞凋亡诱导因子，其中所述细胞凋亡诱导因子是粒酶。在一个具体实施方案中，粒酶是粒酶B。在另一个具体实施方案中，所述粒酶B的氨基酸序列选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。在又一个具体实施方案中，所述粒酶B的氨基酸序列选自SEQ ID NO：60，SEQ IDNO：60进一步包括SEQ ID NO：61的N‑末端延伸或缺少最初20个氨基酸的SEQ IDNO：60。在另外一个具体实施方案中，所述粒酶B的氨基酸序列是来自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：60的至少100个毗连氨基酸。在进一步的一个具体实施方案中，所述粒酶B的氨基酸序列是来自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：60的至少75个毗连氨基酸。在另一个具体实施方案中，所述粒酶B的氨基酸序列是来自SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：60的至少40个毗连氨基酸。在其它一个具体实施方案中，粒酶是粒酶A。在另一个具体实施方案中，所述粒酶A的氨基酸序列选自SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25。在又一个具体实施方案中，所述粒酶A的氨基酸序列是来自SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的至少100个毗连氨基酸。在另外一个具体实施方案中，所述粒酶A的氨基酸序列是来自SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的至少75个毗连氨基酸。在进一步的一个具体实施方案中，所述粒酶A的氨基酸序列是来自SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的至少40个毗连氨基酸。在其它一个具体实施方案中，细胞特异的靶向部分是细胞因子、抗体、配体或激素。在一个具体实施方案中，配体是VEGF。在另一个具体实施方案中，VEGF是vegf121。在又一个具体实施方案中，抗体是单链抗体。在另外一个具体实施方案中，单链抗体是scFvMEL。在其它一个具体实施方案中，粒酶是粒酶B且所述细胞特异的靶向部分是vegf121。在另一个具体实施方案中，粒酶是粒酶B且所述细胞特异的靶向部分是scFvMEL。在又一个具体实施方案中，多肽进一步包括接头，如SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：52。在一个具体实施方案中，多肽由重组多核苷酸编码。

    本发明的另外一个目标是一个含多核苷酸的表达盒，多核苷酸编码嵌合多肽，多肽包括细胞特异的靶向部分和细胞凋亡诱导因子，其中所述细胞凋亡诱导因子是粒酶，所述多核苷酸是在宿主细胞中可操作调节序列的控制下。在具体实施方案中，粒酶是粒酶A或粒酶B。在一个具体实施方案中，粒酶A由多核苷酸SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28编码。在另一个具体实施方案中，粒酶B由多核苷酸SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22编码。在另外一个具体实施方案中，盒包括在重组病毒载体中，如腺病毒载体、腺‑相关病毒载体或逆转录病毒载体。

    本发明的又一个目标是一个含表达盒的宿主细胞，表达盒包括编码嵌合多肽的多核苷酸，多肽包括细胞特异的靶向部分和细胞凋亡诱导因子，其中所述细胞凋亡诱导因子是粒酶。在具体实施方案中，细胞被进一步确定为原核宿主细胞或真核宿主细胞。

    本发明的另一个目标是一种使用宿主细胞的方法，宿主细胞包含表达盒，表达盒包括编码嵌合多肽的多核苷酸，多肽包括细胞特异的靶向部分和细胞凋亡诱导因子，其中所述细胞凋亡诱导因子是粒酶，包括在适合于表达嵌合多肽的条件下培养宿主细胞。

    本发明的另外一个目标是一种在细胞中诱导细胞凋亡的方法，包括施用有效量的嵌合多肽给所述细胞，多肽包括细胞特异的靶向部分和粒酶。在具体实施方案中，粒酶是粒酶A或粒酶B。在具体实施方案中，细胞在体内和/或人中。

    本发明的又一个目标是一种在细胞中诱导细胞凋亡的方法，包括施用有效量的嵌合多肽给所述细胞，多肽包括细胞特异的靶向部分和粒酶，其中所述细胞特异的靶向部分是scFvMEL且所述粒酶是粒酶B。预期细胞特异的靶向部分通过靶向特异细胞来作用，例如在表面表达肽或多肽的细胞，肽或多肽能特异结合靶向部分。使细胞能被特异靶向的化合物可在本文称为靶。因此在发明的一些实施方案中，细胞可具有细胞特异靶向部分识别的靶。

    本发明的另一个目标是一种在细胞中诱导细胞凋亡的方法，包括施用有效量的嵌合多肽给所述细胞，多肽包括细胞特异的靶向部分和粒酶，其中所述细胞特异的靶向部分是vegf121且所述粒酶是粒酶B。

    本发明的一个其它目标是一种在细胞中诱导细胞凋亡的方法，包括施用有效量的嵌合多肽给所述细胞，多肽包括细胞特异的靶向部分和Bcl‑2家族的促凋亡成员。在一个具体实施方案中，Bcl‑2家族的促凋亡成员是Bax或其片断。在具体实施方案中，细胞在体内和/或人中。在一个具体实施方案中，Bax片断缺乏至少部分Bax多核苷酸序列中的外显子6编码的多肽。

    本发明的另外一个目标是一种在细胞中诱导细胞凋亡的方法，包括施用有效量的嵌合多肽给所述细胞，多肽包括细胞特异的靶向部分和Bcl‑2家族的促凋亡成员，其中所述细胞特异的靶向部分是scFvMEL且所述Bcl‑2家族的促凋亡成员是Bax或Bax片断。在一个具体实施方案中，Bax片断缺乏至少部分Bax多核苷酸序列中的外显子6。

    本发明的一个其它目标是一种治疗个体中疾病的方法，包括施用治疗上有效量的组合物给所述个体的步骤和药物载体，组合物含嵌合多肽，多肽包括细胞凋亡诱导部分和细胞特异的靶向部分。在一个具体实施方案中，药物载体包括脂质。在另一个具体实施方案中，疾病是癌症、糖尿病、关节炎、或炎症性肠病、动脉粥样硬化或糖尿病视网膜病。在另一个具体实施方案中，疾病是癌症。在又一个具体实施方案中，细胞凋亡诱导部分是粒酶。在另外一个具体实施方案中，粒酶是粒酶B或其片断。在其它具体实施方案中，细胞凋亡诱导部分是Bcl‑2家族的促凋亡成员。在另一个具体实施方案中，Bcl‑2家族的促凋亡成员是Bax或其片断。在另外一个具体实施方案中，Bax片断缺乏至少部分Bax多核苷酸序列中的外显子6编码的多肽。在又一个具体实施方案中，Bax片断缺乏至少部分外显子编码的多肽，外显子选自4、5和6。在其它具体实施方案中，施用是通过静脉注射。在另一个具体实施方案中，施用是通过吸入。在另外一个具体实施方案中，施用是静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、无玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、肿瘤内、肌肉内、腹膜内、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内、眼内、口腔、表面、局部、通过吸入(如气雾剂吸入)、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注冲洗靶细胞、经导管、经灌洗、在乳膏或脂质组合物中。在一个具体实施方案中，方法进一步包括给所述个体施用抗炎症组合物、化疗、手术、放射、激素治疗或基因治疗。

    预期的是，根据本发明的任何其它实施方案可使用在本发明的一个实施方案的范围中讨论的情况。

    附图的概述

    下图形成部分本说明书且被包括以进一步证明本发明的一些方面。发明可参考一张或更多这些附图并结合本文所示具体实施方案的详细描述来更好理解。

    图1阐述了来自Hut78细胞的人未成熟粒酶B cDNA。1％琼脂糖凝胶电泳证明人未成熟粒酶B cDNA通过RT‑PCR从Hut78细胞合成。泳道1表示低质量DNA分子标记；泳道2表示对照合成的cDNA(~500bp)；泳道3表示没有RT对照；泳道4表示人未成熟粒酶B cDNA(~800bp)。

    图2显示编码人未成熟粒酶B的核苷酸序列(SEQ ID NO：54)和氨基酸序列(SEQID NO：55)。

    图3阐述pET32GrB‑vegf121和pET32GrB‑scFvMEL融合构建物的构建。这些融合构建物的构建以PCR方法为基础。图3A显示pET32GrB‑vegf121的构建。图3B显示pET32GrB‑scFvMEL的构建。全长基因连接入表达载体pET‑32a(+)的Xba I/XhoI位点。

    图4证明大肠杆菌(E.coli)中表达的pET32a载体中的重组粒酶B‑vegf121(图4A)、粒酶B‑scFvMEL(图4B)的预期结构和粒酶B‑vegf121(图4C和4D)(核苷酸序列SEQ ID NO：56和氨基酸序列SEQ ID NO：57)、粒酶B‑scFvMEL(图4E和4F)(核苷酸序列SEQ ID NO：58和氨基酸序列SEQ ID NO：59)的序列。pET‑32a(+)载体包含T7启动子用于高水平表达。核酸的表达包括含Trx标记的序列，接着是His标记、凝血酶裂解位点和肠激酶裂解位点用于最终去除蛋白质纯化标记。

    图5显示融合蛋白表达的SDS‑PAGE分析，在还原条件下SDS‑PAGE考马斯蓝染色粒酶B‑vegf121(图5A)和粒酶B‑scFvMEL(图5B)。图5A的a组显示粒酶B‑vegf121的SDS‑PAGE考马斯蓝染色。泳道1显示非诱导的总细胞裂解物；泳道2显示诱导的总细胞裂解物；泳道3显示非诱导的可溶物；泳道4显示诱导的可溶物；泳道5显示非诱导的不溶物；泳道6显示诱导的不溶物；泳道7显示蛋白质分子分子标记。B组中，泳道1显示蛋白质分子标记；泳道2显示前粒酶B‑vegf121(来自Talon树脂的IMAC‑洗脱液)；泳道3显示前粒酶B‑vegf121(来自镍NTA的IMAC‑洗脱液)；泳道4：粒酶B‑vegf121(rEK切后)。在图5B中，显示粒酶B‑scFvMEL的SDS‑PAGE考马斯蓝染色。C组中，泳道1显示蛋白质分子标记；泳道2显示非诱导的总细胞裂解物；泳道3显示诱导的总细胞裂解物；泳道4显示非诱导的可溶物；泳道5显示诱导的可溶物；泳道6显示非诱导的不溶物；泳道7显示诱导的不溶物。D组中，泳道1显示蛋白质分子标记；泳道2显示前粒酶B‑scFvMEL(来自镍NTA的IMAC‑洗脱液)；泳道3显示粒酶B‑scFvMEL(rEK切后)。

    图6证明粒酶B‑vegf121和粒酶B‑scFvMEL的蛋白质印迹分析。

    图7显示粒酶B‑scFvMEL融合蛋白的scFvMEL部分的结合活性。在预包被蛋白质L的平板上检测不同scFvMEL融合蛋白的ELISA。

    图8证明粒酶B‑vegf121抗对数期PAE‑Flk‑1和PAE‑Flt‑1的细胞毒性测试。

    图9证明粒酶B‑scFvMEL对A375‑M的细胞毒性测试。

    图10阐述人Bax基因、其外显子、BH1、BH2和BH3结构域。

    图11证明通过PCR从Namalwa细胞克隆人Bax cDNA。泳道1：低质量DNA分子标记，泳道2‑6：对照合成的cDNA(~500bp)，泳道7‑8：人Bax cDNA(~580bp)，使用随机引物(泳道7)和寡(dT)引物(泳道8)。

    图12A和12B阐述scFvMEL‑bax‑相关融合构建物的构建。

    图13显示融合蛋白表达的SDS‑PAGE和考马斯蓝染色分析。

    图14显示转化入AD494(DE3)pLysS大肠杆菌的pET32‑scFvMEL‑bax和pET32‑Bax‑scFvMEL的表达和在IPTG诱导下的表达。

    图15证明全长bax和Bax‑scFvMEL蛋白质表达的蛋白质印迹分析。泳道1：pBad/His A(负对照)，泳道2：pBad/HisLacZ(表达正对照)，泳道3‑5：Bax蛋白质(泳道3：RM+葡萄糖+氨苄青霉素中的表达，泳道4：RM+氨苄青霉素中的表达，泳道5：LB+氨苄青霉素中的表达)，泳道6‑8：Bax‑scFvMEL蛋白质(泳道6：RM+葡萄糖+氨苄青霉素中的表达，泳道7：RM+氨苄青霉素中的表达，泳道8：LB+氨苄青霉素中的表达)。

    图16A和16B证明融合蛋白的scFvMEL部分的结合活性。

    图17显示scFvMEL‑bax345和Bax345‑scFvMEL融合蛋白对A375‑M的细胞毒性。

    图18显示粒酶B‑Vegf121对不同细胞系的ELISA(用小鼠抗vegf121抗体和小鼠抗粒酶B抗体检测)。

    图19证明粒酶B‑VEGF121对转染的内皮细胞的细胞毒性。

    图20显示粒酶B‑Vegf121对vegf121rgel在体外抗PAE/FLK‑1的细胞毒性试验。

    图21阐述用粒酶B‑Vegf121处理的PAE细胞的胱冬酶活性。

    图22证明用GRB/VEGF121处理的PAE细胞的细胞色素c释放。

    图23显示GRB/VEGF₁₂₁处理后PAE细胞的Bax转位。

    图24阐述A375‑M对用GRB/scFvMEL处理的SKBR3‑HP细胞的细胞色素c释放。

    图25阐述GrB/VEGF121引起PAE/flk‑1细胞的DNA成梯。

    图26显示gp240抗原阳性A375‑M对gp240抗原阴性T‑24细胞的GrB/scFvMEL的ELISA，用Grb小鼠单抗检测。

    发明的详细描述

    本发明的其它目标、特征和优点由下列详细描述显而易见。然而应该理解详细描述和具体例子尽管说明发明的较佳实施方案，它们仅用于阐述，因为根据此详细描述，发明精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员是显然的。

    如本说明书所用，“a”或“an”可指一个或多个。如权利要求书所用，当结合词语“包括”使用时，单词“a”或“an”可指一个或多个。如本文所用，“另一个”可指至少第二个或更多。

    如本文所用，术语“细胞凋亡”定义为细胞程序性死亡；内源细胞死亡程序导致细胞死亡。

    如本文所用，术语“细胞因子”定义为由细胞制成的试剂，此细胞影响另一个细胞的行为。在一个具体实施方案中，试剂是多肽。例如，由淋巴细胞制成的细胞因子通常称为淋巴因子或白介素(IL)。此外，细胞因子作用于受它们影响的细胞上的特异细胞因子受体。在一个具体实施方案中，术语“细胞因子”包括生长因子。

    如本文所用，术语“粒酶”定义为来自细胞毒性淋巴细胞颗粒的酶，在进入细胞的细胞溶胶时诱导细胞凋亡和/或核DNA断裂。在一个具体实施方案中，粒酶是淋巴细胞丝氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，粒酶是全长，而在另一些实施方案中，粒酶是部分的。

    如本文所用，术语“信号转导途径因子”定义为酶、底物、辅因子或其它影响另一种酶、辅因子或蛋白质的生物活性的蛋白质。在一个具体实施方案中，因子与受体‑介导的信号相连，从细胞膜外传送信号以调节细胞内生长反应。在一个实施方案中，调节的生长反应是前生长反应。在另一个实施方案中，调节的生长反应是抗生长反应，如诱导细胞凋亡。

    本发明涉及嵌合蛋白质，有细胞‑靶向特异性和破坏细胞的部分，如从相连信号转导途径直接或间接到细胞死亡。在一些实施方案中，破坏细胞的部分是细胞凋亡诱导活性。发明的嵌合蛋白质包括细胞‑特异的靶向部分和细胞凋亡诱导部分。细胞‑特异性的靶向部分提供细胞‑特异结合嵌合蛋白质的性质，而细胞凋亡诱导部分在进入靶细胞时引起细胞程序性死亡。在一些实施方案中，发明的嵌合蛋白质作为多肽传递且通过重组表达融合多核苷酸来产生，多核苷酸是在细胞靶向部分的编码序列和细胞凋亡诱导蛋白质的编码序列间。这种嵌合蛋白质可能优于本领域目前所用的免疫毒素，因为它们是人来源并因此预期在人受体中免疫原性降低。此外，嵌合蛋白质通过诱导细胞凋亡杀伤靶细胞，细胞凋亡不引起细胞器官释放入胞外环境以导致炎症反应。当细胞通过细胞凋亡途径死亡时，它们收缩和凝聚，但细胞器和质膜保持它们的完整性，死亡细胞在渗漏细胞内含物前被周围细胞或巨噬细胞迅速吞噬，从而引起最小的组织或全身反应。

    发明也涉及嵌合蛋白质的药物组合物、产生这种蛋白质的方法和体外及体内使用相同的方法，特别是用于去除具体不需要的靶细胞和用于治疗多种疾病情况以及使用蛋白质用于疾病诊断。

    在本发明中，揭示了涉及用嵌合多肽靶向破坏细胞的方法和组合物。嵌合多肽包括至少两个部分：一个部分是杀伤细胞的有效成分；第二个部分是嵌合多肽的传递成分，使杀伤成分靶向感兴趣的细胞。在本发明的一些实施方案中，至少一个部分且优选两个都是人来源，去除施用嵌合多肽的个体的免疫应答。在一个实施方案中，杀伤细胞的部分是信号转导途径的组成部分，如此途径中的限制性因子或限制点。信号转导途径的传递不需引起此途径的上游步骤，施用此限制点导致相同效果是破坏细胞。技术人员认识到可胞内传递以调节信号转导的试剂种类包括酶，如激酶(例如调节胰岛素信号的蛋白激酶B(PKB、AKT)；参与许多信号事件的蛋白激酶C；参与许多信号事件的磷脂酰肌醇3‑激酶)；磷酸酶；蛋白酶(如胱冬酶3)；核酸酶(如胱冬酶‑活化的脱氧核糖核酸酶(CAD)，细胞凋亡的介体)；磷脂酶；NCKAP1(阿尔茨海默氏病人脑组织中负调节的细胞凋亡‑相关蛋白质；Suzuki等，2000)或辅因子如细胞色素c(参与细胞凋亡信号)和环AMP(参与许多途径)。

    在一个具体实施方案中，信号转导途径因子是酶。酶可以是水解酶(如脱氨酶、酯酶、糖苷酶、脂肪酶、核酸酶、肽酶、磷酸酶、磷酸二酯酶和蛋白酶)；异构酶(如差向异构酶、变位酶和消旋酶)；连接酶或合成酶(如酰基辅酶A合成酶、氨基‑酰基‑tRNA合成酶和羧化酶)；裂合酶(如醛缩酶、脱羧酶、脱水酶和核苷酸环化酶)；氧化还原酶(如脱氢酶、双加氧酶、氢化酶、单加氧酶、固氮酶、氧化酶和还原酶)；和/或转移酶(如酰基转移酶、氨基转移酶、糖基转移酶、激酶、甲基转移酶、核苷酸基转移酶、磷酸化酶和磺基转移酶)。在具体实施方案中，酶被分类为毒素，指它对细胞、组织或生物体有毒性。

    在一些实施方案中，信号转导途径因子是细胞凋亡诱导因子。几乎所有细胞包含调节细胞死亡(细胞凋亡)的机制。在一个具体实施方案中，如本文实施例所证明，传递粒酶B蛋白质到靶细胞内部导致通过细胞凋亡机制的细胞死亡。使用结合肿瘤细胞的细胞表面和有效内在化的重组配体(VEGF)和重组抗体(scFvMEL)，发明者命名两种新的粒酶B‑相关融合蛋白：特异靶向内皮细胞的GrB‑vegf121；特异靶向黑素瘤细胞的GrB‑scFvMEL。

    技术人员认识到具体的细胞‑特异的靶向部分有助于嵌合多肽靶向感兴趣细胞。例如，细胞‑特异的靶向部分可以是具体细胞标记的抗体、生长因子、激素或细胞因子。

    技术人员意识到用于产生本发明嵌合多肽的核酸序列和氨基酸序列可获得，具体是通过公共数据库如全国生物技术信息中心(the National Center forBiotechnology Information)(NCBI)的GenBank数据库或可商业获得的数据库如Celera Genomics，Inc.(Rockville，MD)。例如，用于本发明的粒酶B氨基酸序列和它们的GenBank登录号可包括至少：P10144(SEQ ID NO：11)；XP_012328(SEQ IDNO：12)；A61021(SEQ ID NO：13)；NP_004122(SEQ ID NO：14)；CAA01810(SEQ IDNO：15)；和/或AAA75490(SEQ ID NO：16)。SEQ ID NO：60是人粒酶B序列，反映SEQ ID NO：11到SEQ ID NO：16中所见的变化，如在残基55(Gln或Arg)、残基94(Pro或Ala)，含SEQ ID NO：61的N末端延伸(MKSL SLLHLFPLPRAKREQGGNNSSSNQGSLPEK)，和/或缺失残基1到20。

    用于本发明的粒酶B核酸序列可包括至少：XM_012328(SEQ ID NO：17)；BF589964(SEQ ID NO：18)；BF221604(SEQ ID NO：19)；NM_004131(SEQ ID NO：20)；A26437(SEQ ID NO：21)；和/或M28879(SEQ ID NO：22)。用于本发明的粒酶A氨基酸序列和它们的GenBank登录号可包括至少：P12544或NP_006135(SEQ ID NO：23)或XP_003652(SEQ ID NO：24)。SEQ ID NO：25包括人粒酶A氨基酸序列并反映SEQID NO：23和SEQ ID NO：24在残基121的变化(分别为Thr或Met)。用于本发明的粒酶A核酸序列可包括至少：XM_003652(SEQ ID NO：26)；NM_006144(SEQ ID NO：27)；和/或U4006(SEQ ID NO：28)。技术人员认识到如何从NCBI GenBank数据库获得这些和序列相关序列。

    I.细胞凋亡诱导蛋白质

    需要严格调节的细胞死亡用于多谱系生物的发育和组织内稳态的维持。单个细胞的分化状态直接影响它在死亡刺激变化后是否执行自杀反应。已鉴定细胞程序性死亡(细胞凋亡)的正和负调节物调节物。Bcl‑2是细胞程序性死亡的阻遏物(Vaux等，1988)，最近显示其它Bcl‑2同源物抑制细胞凋亡。然而，一种Bcl‑2同源物Bax通过加速细胞凋亡调节相反效果。在Bcl‑2家族中，两个保守区域中有显著的同源性：Bcl‑2同源结构域1和2(BH1和BH2)(Oltvai等，1993；Boise等，1993；Kozopas等，1993；Lin等，1993)。Bcl‑1家族成员包括Bax、Bcl‑X_L、Mcl‑1、A1和DNA病毒中的一些可读框。其它Bax中的保守结构域不同于BH1和BH2，命名为BH3且调节细胞死亡和蛋白质结合功能(Chittenden等，1995)。促凋亡蛋白的亚群仅包含BH3结构域，意味着此具体结构域可能在促进细胞凋亡中有独特重要性。

    在体内Bax形成同源二聚体并也与BCL‑2形成异源二聚体，过度表达的Bax超越BCL‑2的死亡阻遏物活性(Oltvai等，1993)。Bax表达水平在膀胱肿瘤中高于Bcl‑2表达水平，与改善的病人预后有关。在其肿瘤表达的Bcl‑2超过Bax mRNA的病人中，观察到早期复发的频率高许多(Gazzaniga等，1996)。

    近来报导Bax的剪接变体Bax‑α在正常胸上皮细胞中高量表达，而在检测的40个癌组织样品中，39个仅检测到微弱的表达或没有表达(Bargou等，1996)，在不同组织亚类中检测到Bax‑α的负调节。此外，当Bax‑α在四环素依赖的表达系统控制下转染到乳腺癌细胞系时，Bax恢复癌细胞对血清饥饿和APO‑I/Fas‑引起的细胞凋亡的敏感性，显著减少SCID小鼠中的肿瘤生长。因此，提出破坏细胞凋亡途径可导致乳腺癌的发病机制，至少部分由于Bcl‑2基因家族成员间的不平衡(Bargou等，1996)。

    已鉴定细胞凋亡诱导蛋白质的Bcl‑2家族的其它成员。Bcl‑2家族新成员Bak表达在多种细胞种类中表达并在酵母中结合Bcl‑2同源物Bcl‑x2(Farrow等，1995；Chittenden等，1995)。Bak的一个结构域被鉴定为对细胞毒性活性和结合Bcl‑x1是必需和足够的。此外，与此结构域类似的序列在Bax和Bipl中鉴定，此结构域不同于BH1和BH2。此结构域对于调节多种细胞死亡调控蛋白质的功能是关键的，这些蛋白质与Bcl‑2家族成员相互作用(Chittenden等，1995)。

    在除去神经生长因子的交感神经元中过度表达Bak加速细胞凋亡并阻碍共注射的E1B 19K的保护效果。已知腺病毒E1B 19K蛋白质抑制E1A、肿瘤坏死因子α、FAS抗原和神经生长因子除去诱导的细胞凋亡(Farrow等，1995)。表达Bak引起除去血清的成纤维细胞迅速和广泛的细胞凋亡，表明Bak直接参与活化细胞死亡机制(Chittenden等，1995)。在正常和瘤性结肠中，免疫反应性Bak的粘膜表达与上皮细胞的细胞凋亡位置共局部化。在培养的人结肠癌细胞系HT29和大鼠正常小肠细胞系1EC 18中诱导细胞凋亡伴随着Bak表达增加，没有其它Bcl‑2同源蛋白质表达的一致变化(Moss等，1996)。因此，也表明Bak是与肠细胞的细胞凋亡最佳相关的内源Bcl‑2家族成员(Moss等，1996)。

    然而不像Bax，Bak可抑制EB病毒‑转化细胞系中的细胞死亡。具有Bak信使RNA独特分布的组织包括含长寿、末端分化细胞种类的组织(Krajewski等，1996)，表明细胞死亡诱导活性广泛分布，细胞凋亡的组织特异性调节主要通过调节抑制细胞凋亡的分子来控制(Kiefer等，1995)。

    Bcl2家族的另一个成员Bad具有BH1和BH2结构域的关键氨基酸基序。Bad缺乏标准的C末端信号锚序列，此序列用于其它家族成员的整合膜位置。Bad选择性地与Bcl‑x_L以及Bcl‑2二聚化，但不与Bax、Bcl‑Xs‑Mcl1、A1或本身二聚化。Bad反转Bcl‑x_L的死亡阻遏物活性，但不反转Bcl‑2(Yang等，1995；Ottilie等，1997；Zha等，1997)。

    Bcl2家族的另外一个成员Bik与细胞存活促进蛋白质、Bcl‑2和Bcl‑x_L以及病毒存活促进蛋白质、EB病毒‑BHRF1和腺病毒E1B‑19kDa相互作用。在瞬时转染试验中，Bik促进细胞死亡，方式类似于Bax和Bak、其它Bcl‑2家族的促凋亡成员。Bik的这种促凋亡活性可通过共表达Bcl‑2、Bcl‑x_L、EBV‑BHRF1和E1B‑19kDa蛋白质来抑制，表明Bik可能是细胞和病毒抗细胞凋亡蛋白质的共同靶。Bik不含与BH1和BH2保守结构域明显的同源性，这些保守结构域是Bcl‑2家族的特征，Bik与Bax和Bak共享9个氨基酸结构域(BH3)，这也许是这些蛋白质促进死亡活性的关键决定因素(Boyd等，1995；Ham等，1996)。

    Bcl‑2家族包括多对调节细胞凋亡的拮抗剂和激动剂蛋白，尽管它们的功能是否相互依赖还不清楚。使用Bcl‑2和Bax的功能获得和失去模型，Knudson等(1997)证明细胞凋亡和胸腺发育不全、Bcl‑2‑缺损小鼠的特征大部分在同样缺少Bax的小鼠中没有。单拷贝Bax在缺乏Bcl‑2时促进细胞凋亡。然而，过度表达Bcl‑2在缺乏Bax时仍抑制细胞凋亡。在体内Bax和Bcl‑2间存在竞争，各自能单独调节细胞凋亡。Bax显示在脂膜中形成通道并引起脂质体‑包囊的carboxyluorescein在中性和酸性pH释放。在生理pH，释放可被Bcl‑2阻碍。在平面脂双层中，Bax形成取决于pH和电压的离子传导通道。因此，Bax的促凋亡效果可通过内在孔形成活性引起，此活性可由Bcl‑2拮抗(Antonsson等，1997)。此家族的另两个成员Bcl‑2和Bcl‑1也显示在脂膜中形成孔(Schendel等，1997)。

    II.粒酶B和细胞凋亡

    宿主抗病毒、寄生虫试剂和转化细胞的防御需要细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和天然杀伤(NK)细胞(Berke，1995；Kagi等，1996)，用至少两种不同机制诱导靶细胞中的细胞凋亡。在第一种机制中，通过死亡配体在效应细胞表面上表达来刺激靶细胞上的细胞表面受体(如Fas)(Nagata和Golstein，1995；Ashkenazi和Dixit，1998)，随后导致靶细胞中胱冬酶级联活化。第二种机制表示为“颗粒胞吐作用”，载体将效应细胞的胞质颗粒内含物转移到靶细胞中(Doherty，1993；Shresta等，1995a；Shresta等，1995b)。穿孔素和丝氨酸蛋白酶的粒酶家族是这些颗粒的重要成分。

    穿孔素是70kDa蛋白质，以钙‑依赖方式结合膜磷酸胆碱组(Masson和Tshopp，1985；Young等，1986；Tschopp等，1989)。结合后，穿孔素插入膜并寡聚化，形成孔。这种膜的透化可能使其它分子如粒酶能进入靶细胞。

    粒酶A和B在CTLs和NK细胞颗粒中特别丰富(Smyth等，1996)。粒酶B也称为片段化酶或细胞毒性T细胞蛋白酶(CCP)，类似于具有在天冬氨酸残基后裂解底物蛋白特性的胱冬酶(Zunino等，1990；Lobe等，1986；Odake等，1991；Poe等，1991；Shi等，1992)。敲除粒酶B的小鼠证明粒酶B在诱导靶细胞的细胞凋亡中的重要作用。衍生自粒酶B^‑/‑小鼠的CTLs和NK细胞诱导靶细胞中凋亡DNA断袭的能力严重减少(Shresta等，1995a；Heusel等，1994)。尽管早期的补充研究显示当加入靶细胞时，纯化的粒酶B单独不促进细胞凋亡，用纯化的粒酶B和穿孔素蛋白质共处理在4个淋巴瘤靶细胞系中诱导显著的DNA断裂和细胞凋亡特征(Shi等，1992)。因此，可能粒酶B通过穿孔素产生的孔进入靶细胞，尽管这有争议。一些研究显示粒酶B由靶细胞在没有加入穿孔素的情况下内在化(Froelich等，1996；Jans等，1996；Shi等，1997；Pinkoski等，1998；Pinkoski等，2000)。已报导内在化的粒酶B位于胞质(Jans等，1996；Shi等，1997)或在新的泡区室中(Pinkoski等，1998)，尽管在有内在化粒酶B的细胞中引起细胞凋亡需要进一步加入穿孔素到细胞(Froelich等，1996；Jans等，1996；Shi等，1997；Pinkoshi等，1998；Pinkoski等，2000)。可能需要穿孔素用于将粒酶B从内部泡释放到靶细胞中。其它研究表明穿孔素促进粒酶B转位到核，核定位对于粒酶B引起细胞凋亡的能力是关键的(Jans等，1996；Shi等，1997；Pinkoski等，1998；Pinkoski等，2000；Pinkoski等，1996；Trapani等，1996)。

    尽管粒酶B亚细胞定位的重要性仍有争议，确定粒酶B有影响细胞凋亡途径的能力。体外研究显示粒酶B能裂解胱冬酶原3、‑6、‑7、‑8m‑9和‑10(Darmon等，1996；Darmon等，1996；Martin等，1996；Quan等，1996；Fernandes‑Alnemri等，1995；Orth等，1996；Fernandes‑Alnemri等，1995；Chinnaiyan等，1996；Gu等，1996；Boldin等，1996；Muzio等，1996；Duan等，1996；Fernandes‑Alnemri等，1996；Medema等，1997；Van de Craen等，1997；Talanian等，1997)。在胱冬酶原3、‑7和‑9的情况中，粒酶B‑介导的加工显示产生活性胱冬酶(Darmon等，1995；Quan等，1996；Gu等，1996；Duan等，1996)。更重要的是，全细胞的研究显示粒酶B和穿孔素共孵育后胱冬酶在靶细胞中活化(Darmon等，1996；Talanian等，1997；Shi等，1996)。然而哪些胱冬酶是粒酶B体内优选底物仍待确定。在任何情况中，提出粒酶B可仅通过裂解和活化靶细胞中内的源胱冬酶来促进细胞凋亡是合理的。

    同样在发生粒酶B/穿孔素介导的细胞凋亡的细胞中观察到胱冬酶底物蛋白PARP、核纤层蛋白B和U1‑70kDa的裂解(Medema等，1997；Talanian等，1997；Shi等，1996；Andrade等，1998)。这些裂解可能由于胱冬酶通过粒酶B裂解而活化，因为所有三种蛋白质的裂解被含100μM DEVD‑或VAD的肽抑制，肽抑制胱冬酶但不抑制粒酶B(Darmon等，1996；Medema等，1997；Talanian等，1997；Shi等，1996；Andrade等，1998)。另外两个胱冬酶底物蛋白DNA‑PKcs和NuMA也在粒酶B/穿孔素‑处理的细胞中裂解，但这些蛋白质的裂解对DEVD或VAD肽抑制剂不敏感(Andrade等，1998)。此外，粒酶B产生的DNA‑PKcs和NuMA蛋白水解片断大小与来自胱冬酶裂解的不同，表明在粒酶B介导的细胞凋亡中，重要的细胞底物以不依赖于胱冬酶的方式裂解。这些不依赖于胱冬酶裂解的重要性不知道。然而考虑到粒酶B/穿孔素介导的DNA断裂和细胞凋亡被100μM DEVD/VAD显著延迟(Darmon等，1996；Talanian等，1997；Shi等，1996)，这强调了此种形式的细胞凋亡期间胱冬酶活化的必要性。

    III.粒酶A和细胞凋亡

    成熟粒酶A酶是50kDa的二硫化物交联同源二聚体，在赖氨酸或精氨酸残基后裂解底物蛋白(Odake等，1991；Gershenfeld等，1986；Masson等，1986)，粒酶A是CTL细胞颗粒中发现的最丰富蛋白酶。此蛋白酶的作用机制与粒酶B显著不同，尽管粒酶A能在装入靶细胞后诱导细胞凋亡。此外，认为粒酶A在CTL‑诱导细胞凋亡中的作用比粒酶B精细很多。例如，缺乏粒酶A表达的小鼠(粒酶A^‑/‑小鼠)表现相对正常的CTL介导的细胞毒性(Andrade等，1998)，尽管它们不能清除小鼠痘病毒缺肢(Mulbacher等，1996)。相反，来自粒酶B^‑/‑小鼠的CTLs仅在延长共孵育后能诱导靶细胞死亡(Heusel等，1994)，因此粒酶B对于迅速CTL杀伤非常重要。近来使用缺乏粒酶A和粒酶B小鼠的实验表明粒酶A在CTL介导的杀伤中有一些作用。来自粒酶A^‑/‑粒酶B^‑/‑小鼠的CTLs即使在延长共孵育后不能诱导靶细胞DNA断裂(Shresta等，1999)，表明在延长暴露后粒酶A活性引起粒酶B^‑/‑CTLs诱导靶细胞的细胞凋亡的能力。因此，粒酶A可在粒酶B活性被抑制情况下(如表达粒酶B抑制剂的靶细胞)使CTLs杀伤靶细胞。

    在重组蛋白质的研究中，粒酶A和穿孔素共孵育靶细胞导致DNA单链断裂迅速(2小时内)积聚(Hayes等，1980；Beresford等，1999)，与此相反，粒酶B和穿孔素处理的细胞中DNA迅速降解成寡核小体长度片断。粒酶A/穿孔素处理也导致核凝聚(Beresford等，1999)。这些响应粒酶A发生的效果对胱冬酶抑制剂不敏感，表明粒酶A的这些作用不依赖于胱冬酶(Beresford等，1999)。粒酶A/穿孔素处理以一致方式不导致胱冬酶原‑3的加工/活化或胱冬酶底物蛋白PARP、核纤层蛋白B或rho‑GTP酶的裂解(Beresford等，1999)。然而，粒酶B诱导的DNA断裂严格取决于胱冬酶活化。粒酶A和粒酶B(结合穿孔素)也诱导靶细胞发生细胞溶解，两种情况都不依赖于胱冬酶。因此，目前的证据表明粒酶B是靶细胞DNA断裂和细胞凋亡的主要CTL介体，此蛋白酶的细胞凋亡效果主要通过胱冬酶活化来调节。另外，粒酶A更可以是靶细胞的细胞凋亡的默认或特殊的介体，粒酶A起始的途径与粒酶B起始的途径明显不同。

    IV.嵌合分子的产生

    本发明的嵌合蛋白质可通过化学合成方法或两个部分间的化学键产生，优选的是它们通过融合细胞‑特异靶向部分的编码序列和细胞凋亡诱导蛋白质的编码序列在调节序列控制下产生，调节序列指导融合多核苷酸在适当宿主细胞中表达。在较佳实施方案中，各嵌合蛋白质成分包括各部分的功能活性，作为细胞‑特异的靶向部分和信号转导途径因子(如细胞凋亡诱导蛋白质)。

    融合两个全长编码序列可通过分子生物学领域熟知的方法完成。优选的是融合多核苷酸仅在第一个编码序列的5’末端包含AUG翻译起始密码子而没有第二个编码序列的起始密码子，以避免产生两个分离的编码产物。此外，前导序列可放在多核苷酸的5’末端以使表达产物靶向具体位点或宿主细胞内的区室，便于在基因表达后分泌或随后的纯化。两个编码序列可不需任何接头直接融合，或使用灵活的多接头如由五聚物Gly‑Gly‑Gly‑Gly‑Ser(SEQ ID NO：50)重复1到3次组成。这种接头通过插入V_H和V_L间用于构成单链抗体(scFv)(Bird等，1998；Huston等，1988)。接头设计成能在两个β‑片层间正确相互作用，形成单链抗体的可变区。其它可使用的接头包括Glu‑Gly‑Lys‑Ser‑Ser‑Gly‑Ser‑Gly‑Ser‑Glu‑Ser‑Lys‑Val‑Asp(SEQ ID NO：51)(Chaudhary等，1990)和Lys‑Glu‑Ser‑Gly‑Ser‑Val‑Ser‑Ser‑Glu‑Gln‑Leu‑Ala‑Gln‑Phe‑Arg‑Ser‑Leu‑Asp(SEQ ID NO：52)(Bird等，1998)。

    A.细胞特异的靶向部分

    发明的嵌合蛋白质包括细胞特异的靶向部分和细胞凋亡诱导部分。细胞特异的靶向部分赋予对分子的细胞类型特异性结合，它在待靶向的特定细胞群的基础上选择。多种蛋白质适合用作细胞特异的靶向部分，包括但不限于受体的配体如生长因子、激素和细胞因子、抗体或其抗原结合片断。

    由于在不同谱系的造血细胞中鉴定了大量细胞表面受体，这些受体特异的配体或抗体可用作细胞特异的靶向部分。IL2可用作嵌合蛋白质中的细胞特异靶向部分以靶向IL2R⁺细胞。另外，其它分子如B7‑1、B7‑2和CD40可用于特异地靶向活化的T细胞(《白细胞抗原》(The Leucocyte Antigen Facts Book)，1993，Barclay等(编辑)，Academic Press)。此外，B细胞表达CD19、CD40和IL4受体并可被结合这些受体的部分靶向，如CD40配体、IL4、IL5、IL6和CD28。去除免疫细胞如T细胞和B细胞特别用于治疗自身免疫、超敏、移植排斥反应和治疗淋巴肿瘤。自身免疫病的例子是多发性硬化、类风湿性关节炎、胰岛素‑依赖的糖尿病、系统性红斑狼疮、硬皮病和葡萄膜炎。更具体的是，由于已知髓鞘碱性蛋白是多发性硬化中免疫细胞攻击的主要靶，此蛋白质可用作细胞特异的靶向部分以治疗多发性硬化(WO 97/19179；Becker等，1997)。

    其它可用于靶向特定细胞亚群的细胞因子包括白介素(IL1到IL15)、粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白血病抑制因子、肿瘤坏死因子、转化生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子和/或成纤维细胞生长因子(Thompson(编辑)，1994，《细胞因子手册》(The CytokineHandbook)，Academic Press，圣迭戈)。

    技术人员认识到有多种已知细胞因子，包括血细胞生成素(四螺旋束)(如Epo(红细胞生成素)、IL‑2(T细胞生长因子)、IL‑3(多集落CSF)、IL‑4(BCGF‑1、BSF‑1)、IL‑5(BCGF‑2)、IL‑6 IL‑4(IFN‑β₂、BSF‑2、BCDF)、IL‑7、IL‑8、IL‑9、IL‑11、IL‑13(P600)、G‑CSF、IL‑15(T细胞生长因子)、GM‑CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、OSM(OM，制瘤素M)和LIF(白血病抑制因子))；干扰素(如IFN‑γ、IFN‑α和IFN‑β)；免疫球蛋白超家族(如B7.1(CD80)和B7.2(B70、CD86))；TNF家族(如TNF‑α(恶液质素)、TNF‑β(淋巴毒素、LT、LT‑α)、LT‑β、CD40配体(CD40L)、Fas配体(FasL)、CD27配体(CD27L)、CD30配体(CD30L)和4‑1BBL))；以及未分配到具体家族的(如TGF‑β、IL‑1α、IL‑1β、IL‑1RA、IL‑10(细胞因子合成抑制剂F)、IL‑12(NK细胞刺激因子)、MIF、IL‑16、IL‑17(mCTLA‑8)和/或IL‑18(IGIF，干扰素‑γ诱导因子))。

    此外，一些细胞表面分子在肿瘤细胞中高度表达，包括激素受体如人绒(毛)膜促性腺激素受体和促性腺激素释放激素受体(Nechushtan等，1997)。因此，相应激素在癌症治疗中可用作细胞特异的靶向部分。

    因此，在发明的一些实施方案中，没有抗体用于嵌合多肽。然而，抗体是非常多功能和有用的细胞特异靶向部分，因为它们可产生抗任何感兴趣的细胞表面抗原。单克隆抗体产生抗细胞表面受体、肿瘤相关抗原和白细胞谱系‑特异标记如CD抗原。抗体可变区基因可通过本领域熟知的方法从杂交瘤细胞中分离。

    在过去几年中，一些单克隆抗体被准许用于治疗用途并获得显著的临床和商业成功。单克隆抗体的许多临床用途来自它们结合靶的亲和性和特异性，以及由于它们相对大的尺寸故循环期长。然而单克隆抗体不很适合用于指示，其中短半衰期具有优势或它们的大尺寸在身体上抑制它们到达潜在治疗活性的区域。

    此外，天然形式的抗体由两条不同多肽链组成，多肽链需以大致相同量产生且正确装配，天然形式的抗体不适于治疗目的。然而可能产生能保持单克隆抗体的抗原结合性质的单个多肽。

    单链抗体(SCAs)是遗传工程蛋白质，设计用于扩大单克隆抗体的治疗和诊断应用。SCAs有单克隆抗体的结合特异性和亲和性，它们的天然形式是约五分之一到六分之一大小的单克隆抗体，通常赋予它们很短的半衰期。人SCAs与大部分单克隆抗体相比提供许多好处，包括更特异定位到体内靶位点，从身体中更快速清除，口服、鼻内、经皮或吸入使用的机会更好。除了这些好处，完全的人SCAs可直接从人SCA库中分离，不需昂贵和费时的“人源化”过程。SCAs也可通过胞内表达(细胞内)产生以用于基因治疗用途，其中SCA分子起细胞功能的特异抑制剂的作用。

    重链和轻链可变区(VH和VL)都是约110个氨基酸长度。它们可由15个氨基酸接头连接，接头有序列(SEQ ID NO：50)₃，有充分灵活性使两个结构域装配一个功能性抗原结合袋。在具体实施方案中，加入不同信号序列使scFv靶向细胞内的不同细胞器或被分泌。加入轻链恒定区(Ck)可通过二硫键二聚化，提高稳定性和亲合力。因此对于单链Fv(scFv)SCA，尽管Fv片段的两个结构域由分离基因编码，证明能产生合成的接头通过重组方法使它们制成单蛋白质链scFv(Bird等，1988；Huston等，1988)。此外，由于它们容易从噬菌体展示库中分离和识别保守抗原的能力，它们常被使用(综述参见Adams和Schier，1999)。例如，scFv用于通过显示抗CEA scFv的逆转录病毒载体使自杀基因靶向表达癌胚抗原(CEA)的肿瘤细胞(Kuroki等，2000)。

    最后，抗体重链的Fc部分可用于靶向表达Fc受体的细胞，如使用IgE抗体的Fc部分靶向肥大细胞和嗜碱细胞。目前批准了通过抗体导向的治疗或免疫导向的治疗使用抗体靶向感兴趣多肽或肽并用于现在的治疗市场。

    因此，scFv优选用作本发明的细胞特异的靶向部分。

    B.细胞凋亡诱导部分

    BCL2家族的促凋亡蛋白尤其适合用作本发明的细胞凋亡诱导部分。预期这种人蛋白质对许多免疫毒素的免疫原性降低，免疫毒素由细菌毒素组成。尽管在本发明一个实施方案中Bax是有用的细胞凋亡诱导部分，此家族中其它成员适合用于本发明并包括Bak(Farrow等，1995；Chittenden等，1995；Kiefer等，1995)、Bcl‑Xs(Boise等，1993；Fang等，1994)、Bad(Yang等，1995)、Bid(Wang等，1996)、Bik(Boyd等，1995)、Hrk(Inohara等，1997)和/或Bok(Hsu等，1997)。编码这些蛋白质的核苷酸序列在本领域已知且可从数据库如GenBank获得，因此可获得cDNA克隆用于在表达载体中融合细胞特异靶向部分的编码序列。

    研究了Bcl‑2家族具体成员关于细胞凋亡诱导活性的特异结构域。例如，Bak的GD结构域参与细胞凋亡功能(美国专利号5,656,725)。此外，Bax和Bipla共享一个同源结构域。因此，Bcl‑2家族的任何生物活性结构域可作为细胞凋亡诱导部分用于本发明的实践。

    胱冬酶也在细胞凋亡中发挥重要作用且可构成部分细胞凋亡的共有核心机制。胱冬酶作为细胞凋亡的介体。由于认识到发育细胞死亡所需蛋白质CED‑3与哺乳动物半胱氨酸蛋白酶白介素‑1β转化酶(ICE)有序列同一性，已鉴定一个有至少10个相关半胱氨酸蛋白酶的家族。这些蛋白质的特征是对P1位置中的天冬氨酸有几乎绝对的特异性。所有胱冬酶(ICE样蛋白酶)包含保守的QACKG(其中X是R、Z或G)五肽活性位点基序。胱冬酶作为失活酶原合成，酶原包括N末端肽(前结构域)及一个大亚基和一个小亚基。胱冬酶‑1和胱冬酶‑3的晶体结构显示活性酶是异四聚体，含两个小亚基和两个大亚基。在细胞凋亡中活化胱冬酶导致关键细胞底物的裂解，包括多(ADP‑核糖)聚合酶和核纤层蛋白，从而促使细胞凋亡的剧烈形态变化(Cohen，1997，Biochem.J.326：1‑16)。因此，使用胱冬酶作为细胞凋亡诱导部分也在本发明范围内。

    近来一些新蛋白质被克隆和鉴定为调节蛋白质活性所需因子，这些蛋白质参与细胞凋亡途径，主要是胱冬酶。一个因子鉴定为以前知道的电子传递蛋白细胞色素c(Lin等，1996，Cell 86：147‑157)，命名为Apaf‑2。除了细胞色素c，活化胱冬酶‑3需要两个其它的胞质因子Apaf‑1和Apaf‑3。Apaf‑1是与秀丽新小杆线虫(C.elegans)CED‑4同源的蛋白质，Apaf‑3鉴定为胱冬酶家族的成员胱冬酶‑9。在细胞色素c存在时，两个因子通过它们各自的NH2‑末端CED‑3同源结构域彼此结合，导致胱冬酶‑9活化。活化的胱冬酶‑9依次裂解和活化胱冬酶‑3(Liu等，1996；Zou等，1997；Li等，1997)。另一个参与细胞凋亡途径的蛋白质是DNA断裂因子(DFF)，它是45和40kd亚基的异二聚体，作用于胱冬酶‑3下游以引起基因组DNA断裂成核小体区段(Liu等，1997)。

    C.嵌合多肽产生

    根据本发明的目标，编码嵌合蛋白质、突变多肽、嵌合蛋白质的生物活性片断或其功能等同物的多核苷酸可用于产生重组DNA分子，指导嵌合蛋白质、嵌合多肽片断或其功能等同物在合适宿主细胞中表达。

    由于遗传密码的内在简并性，其它编码大体相同或功能等同氨基酸序列的DNA序列可用于发明克隆和表达嵌合蛋白质的实践。这种DNA序列包括在严紧条件下能与嵌合序列或它们互补序列杂合的序列。在一个实施方案中，如本文所用，短语“严紧条件”指杂交条件(1)使用低离子强度和高温用于洗涤，例如0.015MNaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％ SDS，50℃；(2)杂交中使用变性剂如甲酰胺，例如50％(体积/体积)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％菲可/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/含750mM NaCl、75mM柠檬酸钠的50mM pH6.5磷酸钠缓冲液，42℃；或(3)使用50％甲酰胺、5xSSC(0.75M NaCl、0.075M焦磷酸钠、5xDenhardt溶液、超声波处理的鲑精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯，42℃，在0.2xSSC和0.1％SDS中42℃洗涤。

    根据发明可使用改变的DNA序列包括缺失、加入或取代不同核苷酸残基，产生编码相同或功能等同的融合基因产物的序列。基因产物本身可包含缺失、加入或取代嵌合序列中的氨基酸残基，导致沉默变化从而产生功能等同的嵌合蛋白质。这种氨基酸取代可在涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性基础上进行。例如，负电荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；正电荷氨基酸包括赖氨酸、组氨酸和精氨酸；无电荷极性头部基团的氨基酸有相似的亲水值，包括下列：甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸；非极性头部基团的氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸。

    可加工发明的DNA序列以改变嵌合编码序列用于多种末端，包括但不限于修饰基因产物加工和表达的改变。例如，可用本领域熟知的技术如定点诱变引入突变，以插入新的限制性酶切位点、改变糖基化模式、磷酸化等。

    在另外的发明实施方案中，嵌合蛋白质的编码序列可用本领域熟知的化学方法全部或部分合成(参见例如Caruthers等，1980；Crea和Horn，1980；Chow和Kempe，1981)。例如，这些部分的活性结构域可用固相技术合成，从树脂中切下并用制备型的高效液相色谱纯化，接着通过化学键形成嵌合蛋白质(参见例如Creighton，1983，《蛋白质结构和分子原理》(Protein Structures和MolecularPrinciples)，W.H.Freeman和Co.，N.Y.50‑60页)。合成肽的组成可通过氨基酸分析或测序确定(如Edman降解法，参见Creighton，1983，《蛋白质结构和分子原理》，W.H.Freeman和Co.，N.Y.34‑49页)。另外，嵌合蛋白质的两个部分用合成或重组方法产生，可根据本领域熟知方法用化学接头结合(Brinkmann和Pastan，1994)。

    为表达生物活性嵌合蛋白质，编码嵌合蛋白质或功能等同物的核苷酸序列插入合适表达载体，即载体包含转录和翻译插入的编码序列所需元件。嵌合基因产物以及用重组嵌合表达载体转染或转化的宿主细胞或细胞系可用于多种目的。这些包括但不限于产生抗体(即单克隆或多克隆)，抗体结合蛋白质的抗原表位以便于纯化。

    本领域技术人员熟知的方法可用于构建表达载体，载体含嵌合蛋白质编码序列和适当的转录/翻译控制信号。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如Sambrook等，1989，《分子克隆实验室手册》(MolecularCloning A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.和Ausubel等，1989，《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，GreenePublishing Associates和Wiley Interscience，N.Y.描述的技术。

    多种宿主‑表达载体系统可用于表达嵌合蛋白质编码序列。这些包括但不限于微生物如用重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌，表达载体含嵌合蛋白质编码序列；用重组酵母表达载体转化的酵母，表达载体含嵌合蛋白质编码序列；用重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统，表达载体含嵌合蛋白质编码序列；用重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染或用重组质粒载体(如Ti质粒)转化的植物细胞系统，表达载体含嵌合蛋白质编码序列；或动物细胞系统。应该指出由于大部分细胞凋亡诱导蛋白质在哺乳动物细胞中引起细胞程序性死亡，发明的嵌合蛋白质优选在原核或低等真核细胞中表达。第6部分阐述了IL2‑Bax可在大肠杆菌中有效表达。

    各系统的表达元件长度和特异性不同。取决于所用宿主/载体系统，任何一些合适的转录和翻译元件可用于表达载体，包括组成型和诱导型启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可使用诱导型启动子如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp‑lac杂合启动子；巨细胞病毒启动子)等；当在昆虫细胞系统中克隆时，可使用启动子如杆状病毒多角体蛋白启动子；当在植物细胞系统中克隆时，可使用的启动子来自植物细胞的基因组(如热激启动子；RUBISCO小亚基的启动子；叶绿素α/β结合蛋白的启动子)或来自植物病毒(如CaMV的35S RNA启动子；TMV的外被蛋白启动子)；当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可使用的启动子来自哺乳动物细胞的基因组(如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒(如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)；当产生的细胞系含多拷贝的嵌合DNA时，以SV40、BPV和EBV为基础的载体可与合适的可选择标记一起使用。

    在细菌系统中，可有利地选择一些表达载体，这取决于表达嵌合蛋白质的使用。例如，当要产生大量嵌合蛋白质时，需要指导蛋白质产物高水平表达的载体，蛋白质产物易于纯化。这种载体包括但不限于pHL906载体(Fishman等，1994)、大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，1983)，其中嵌合蛋白质编码序列可连接入符合lacZ编码区的载体从而产生杂合AS‑lacZ蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye，1989；Van Heeke和Schuster，1989)等。

    另一种可用于表达嵌合蛋白质的表达系统是昆虫系统。在这种系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多汗症病毒(AcNPV)用作表达外来基因的载体。病毒生长于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中。嵌合蛋白质编码序列可克隆入病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)控制下。成功插入嵌合蛋白质编码序列将导致多角体蛋白基因失活并产生非闭塞的重组病毒(即缺乏蛋白质外被的病毒，由多角体蛋白基因编码)。随后这些重组病毒用于感染草地夜蛾细胞，在其中表达插入的基因(参见例如Smith等，1983；美国专利号4,215,051)。

    有效翻译插入的嵌合蛋白质编码序列也需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。当完整嵌合基因包括其起始密码子和相邻序列插入适当表达载体时，不需要另外的翻译控制信号。然而，当嵌合蛋白质编码序列不包括其起始密码子时，必须提供外源翻译控制信号包括ATG起始密码子。此外，起始密码子必须与嵌合蛋白质编码序列的可读框同相以确保翻译完整的插入片断。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是多种来源，天然和合成的。可通过加入合适的转录增强子元件、转录终止子等提高表达效率(参见Bittner等，1987)。

    此外，可选择宿主细胞株调节插入序列的表达，或以所需具体方式修饰和加工基因产物。这种修饰(如糖基化)和加工(如裂解)蛋白质产物对于蛋白质功能是重要的。在嵌合蛋白质中存在一共有的N‑糖基化位点需要适当的修饰以最佳化嵌合蛋白质功能。不同宿主细胞具有特征和特定机制用于蛋白质的翻译后加工和修饰。可选择合适的细胞系或宿主系统以确保嵌合蛋白质的正确修饰和加工。为了这个目的，可使用真核宿主细胞，它们具有适当加工嵌合蛋白的初级转录物、糖基化和磷酸化的细胞机制。这些哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、W138等。

    为长期、高产量生产重组嵌合蛋白质，优选稳定的表达。例如，可设计稳定表达嵌合蛋白质的细胞系。而不是使用含病毒复制起点的表达载体，可用嵌合编码序列和可选择标记转化宿主细胞，序列受合适的表达控制元件控制(如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)。引入外来DNA后，可使工程细胞在富集培养基中生长1‑2天，然后转入选择性培养基。重组质粒中的可选择标记赋予对选择的抗性，使细胞稳定整合质粒到它们的染色体中并生长形成病灶，病灶可依次被克隆和扩张到细胞系中。

    可使用一些选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977)、次黄嘌呤‑鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalski和Szybalski，1962)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等，1980)基因，可分别用于tk‑、hgprt‑或aprt‑细胞。同样，抗代谢的抗性可作为基础选择赋予氨甲蝶呤抗性的dhfr(Wigler等，1980；O’Hare等，1981)；赋予霉酚酸抗性的gpt(Mulligan和Berg，1981)；赋予氨基糖苷G‑418抗性的neo(Colbere‑Garapin等，1981)；和赋予潮霉素抗性的hygro(Santerre等，1984)基因。描述了其它可选择基因，trpB使细胞利用吲哚代替色氨酸；hisD使细胞利用组氨醇代替组氨酸(Hartman和Mulligan，1988)；和ODC(鸟氨酸脱羧酶)赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2‑(二氟甲基)‑DL‑鸟氨酸，DFMO的抗性(McConlogue L，1987，《分子生物的当前信息》(Current Communications in Molecular Biology，Cold Spring HarborLaboratory)编辑)。

    D.蛋白质纯化

    发明的嵌合蛋白质可用本领域已知技术纯化，如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析等。用于纯化具体蛋白质的实际条件部分取决于如净电荷、疏水性、亲水性等因素，对于本领域技术人员是显然的。

    对于亲和层析纯化，可使用任何特异性结合蛋白质的抗体。为产生抗体，可通过注射嵌合蛋白质或其片断来免疫多种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。蛋白质可通过侧链功能基团或附于侧链功能基团的接头附着于合适的载体，如牛血清白蛋白(BSA)。可使用多种佐剂增加免疫应答，这取决于宿主种类，佐剂包括但不限于弗氏(完全或不完全)、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、普鲁尼克多聚醇、聚阴离子、肽、油乳胶、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚和潜在有用的人佐剂如BCG(卡介菌)和小棒杆菌(C.parvum)。

    嵌合蛋白质的单克隆抗体可用任何通过连续细胞系培养产生抗体分子的技术制备。这些包括但不限于Koehler和Milstein(1975)最初描述的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，1983；Cote等，1983)和EBV‑杂交瘤技术(Cole等，1985)。

    此外，可使用开发用于产生“嵌合抗体”的技术(Morrison等，1984；Neuberger等，1984；Takeda等，1985)，这是通过剪接来自合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因和来自合适生物活性的人抗体分子的基因。另外，可修改用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)以产生嵌合蛋白质特异的单链抗体用于嵌合蛋白质纯化和检测。

    V.使用嵌合多肽

    一旦嵌合蛋白质被表达和纯化，它的特性和功能活性可通过本领域熟知方法确定。例如，蛋白质两个部分的抗体可用于在蛋白质印迹分析中鉴定蛋白质。此外，可在结合分析中用荧光标记或放射性标记的第二抗体测试嵌合蛋白质对靶细胞的特异性结合。

    A.体外和活体外使用

    发明的嵌合多肽用于靶向细胞混合物中的具体细胞类型、通过诱导细胞凋亡来去除靶细胞。发明的嵌合多肽也用作诊断试剂。嵌合蛋白质结合靶细胞可用特异于细胞凋亡诱导部分的第二抗体来检测。就此而论，第二抗体或嵌合蛋白质酶或放射性同位素促进检测嵌合蛋白质与细胞的结合。

    B.体内使用

    在一些实施方案中，施用有效量的本发明嵌合多肽给细胞。在其它实施方案中，治疗有效量的本发明嵌合多肽施用给个体以治疗疾病。如本文所用，术语“有效量”定义为在施用的细胞或组织中引起生理变化必需的本发明嵌合多肽的量。如本文所用，术语“治疗有效量”定义为去除、减少、延迟或疾病(如癌症)的不利作用减少至最低程度的本发明嵌合多肽的量。技术人员认识到在许多情况中，嵌合多肽不能治愈仅可提供部分益处。在一些实施方案中，有一些益处的生理变化也认为是治疗益处。因此在一些实施方案中，提供生理变化的嵌合多肽的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。

    发明的嵌合蛋白质可施用给受试者或以药物组合物形式通过靶向病毒抗原如HIV的gp120来治疗癌症、自身免疫、移植排斥、创伤后免疫应答和传染病。更具体的是，嵌合多肽可用于去除参与免疫细胞介导的疾病的细胞，包括淋巴瘤、自身免疫、移植排斥、移植物抗宿主疾病、局部缺血和中风。药物组合物包括本发明蛋白质，通过常规混合、溶解、粒化、制成糖衣丸、研磨、乳化、包囊、截留或冻干过程生产。药物组合物可用一种或多种生理上可接受载体、稀释液、赋形剂或辅剂以常规方式配制，这些试剂促进蛋白质加工成可作为药物的制剂。适当制剂取决于所选的施用途径。

    对于局部施用，本发明蛋白质可制成本领域熟知的溶液、凝胶、油膏、乳膏、悬浮液等。

    全身性制剂包括设计用于注射如皮下、静脉内、肌肉内、鞘内或腹膜内注射以及设计用于经皮、经粘膜、吸入、口腔或肺部施用。

    对于注射，本发明蛋白质可在水溶液中配制，优选在生理上相容缓冲液中如Hank溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液。溶液也可包含配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

    另外，蛋白质可以粉末形式用于在使用前结合合适的载体，如无热原的灭菌水。

    对于经粘膜施用，适合于待渗透阻碍物的渗透剂可用于制剂。这种渗透剂一般在本领域已知。

    对于口腔施用，可通过蛋白质与本领域熟知的药学上可接受载体结合来制成蛋白质。这种载体能使发明的蛋白质能制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆、悬浮液等，用于待治疗病人口腔消化。对于口腔固体制剂例如粉末、胶囊和片剂，合适的赋形剂包括填充剂如糖，例如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；纤维素制剂如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基‑纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；粒化剂；和结合剂。如果需要，可加入崩解剂如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐如藻酸钠。

    如果需要，固体剂量形式可用标准技术有糖衣或肠溶衣。

    对于口腔液体制剂例如悬浮液、酏剂和溶液、合适载体、赋形剂或稀释液包括水、二醇、油、醇等。另外可加入调味剂、防腐剂、着色剂等。

    对于含服施用，蛋白质可采用片剂、锭剂等形式，以常规方式配制。

    对于吸入施用，根据本发明使用的蛋白质以来自密封包装或喷雾器的气雾剂喷射形式方便的传递，使用合适的推进剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压的气雾剂情况中，剂量单位可通过提供阀传递计量的量来确定。用于吸入器或吹入器的明胶胶囊和药筒可制成含蛋白质的粉末混合物和合适的粉末基础如乳糖或淀粉。

    蛋白质也可制成直肠或阴道组合物如栓剂或滞留灌肠剂，例如含常规栓剂基础如可可油或其它甘油酯。

    除了前述制剂，蛋白质也可制成贮存制剂。这种长作用制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内)或肌肉内注射施用。因此，例如蛋白质可用合适的聚合或疏水物质(如可接受油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或作为少量可溶性衍生物如少量可溶性盐。

    另外，可使用其它药物传递系统。脂质体和乳剂是熟知的传递载体的例子，可用于传递本发明蛋白质。一些有机溶剂如二甲亚砜也可使用，尽管通常产生较大毒性。此外，蛋白质可用缓释系统传递，如含治疗剂的固体聚合物的半渗透基质。确定了多种缓释物质并为本领域技术人员熟知。缓释胶囊可取决于它们的化学性质来释放蛋白质几周到超过100天。取决于嵌合蛋白质的化学性质和生物稳定性，可使用其它策略稳定蛋白质。

    发明的蛋白质可包含带电侧链或末端，它们可包括在任何上述制剂中作为游离酸或碱或作为药学上可接受盐类。药学上可接受盐类是大体保持游离碱生物活性的盐和通过与无机酸反应制备的盐。药学上的盐类往往比相应游离碱形式更溶于水和其它质子溶剂中。

    1.有效剂量

    发明的蛋白质一般以有效完成计划目标的量使用。为用于治疗或防止疾病情况，发明的蛋白质或其药物组合物以治疗有效量施用或应用。治疗有效量是有效缓解或防止症状或延长治疗病人存活的量。确定治疗有效量在本领域技术人员的能力内，特别是根据本文所提供的详细说明。

    对于全身性施用，治疗有效剂量可从体外分析中初步估计。例如剂量可在动物模型中制成以获得循环浓度范围，包括细胞培养中确定的IC₅。这种信息可用来更精确地确定人中有用的剂量，也可采用本领域熟知的技术从体内数据(如动物模型)中估计初始剂量。本领域普通技术人员可在动物数据基础上使人的施用最佳化。

    剂量和间隔时间可根据个人调节以提供足以维持治疗效果的蛋白质的血浆水平。通常注射施用的病人剂量范围从约0.1到5mg/kg/天，优选从约0.5到1mg/kg/天。治疗上有效血清水平可通过每天施用多剂量来获得。

    在局部施用或选择性吸收的情况中，蛋白质的有效局部浓度可不与血浆浓度相关。本领域技术人员能使治疗上有效局部剂量最佳化而不需过多实验。

    施用的蛋白质的量当然取决于治疗的受试者、受试者体重、疾病严重性、施用方式和处方医生的判断。

    当症状可检测或甚至不能检测时，治疗可间断重复。治疗可单独提供或结合其它药物。在自身免疫疾病的情况中，可采用与发明的IL2‑Bax结合的药物包括但不限于类固醇和非类固醇消炎药。

    2.毒性

    优选的是，本文所述嵌合蛋白质的治疗有效剂量提供治疗益处而没有引起显著毒性。

    本文所述蛋白质的毒性可通过细胞培养或实验动物中的标准药物过程确定，如通过确定LD₅₀(对50％群体的致死剂量)或LD₁₀₀(对100％群体的致死剂量)。毒性和治疗效果间的剂量比例是治疗指数。优选表现出高治疗指数的蛋白质。获得自这些细胞培养试验和动物研究的数据可用于配制在人中无毒性使用的剂量范围。本文所述蛋白质剂量优选在循环浓度范围内，包括毒性很小或没有毒性的有效剂量。剂量可在此范围中变化，取决于所用剂量形式和所施用途径。精确的制剂、施用途径和剂量可由各医生根据病人情况选择。(参见例如Fingl等，1975，《治疗学的药理基础》(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，第1章第1页)。

    VI.生物功能等同物

    编码本发明嵌合多肽的多核苷酸和/或嵌合多肽本身的结构可根据本发明作出修饰和/或改变。当获得的分子有类似或改进的特征时，这种生物功能等同物也包括在本发明中。

    A.修饰的多核苷酸和多肽

    生物功能等同物可包括多核苷酸，它被加工以包含不同序列而同时保持编码“野生型”或标准蛋白的能力。这可实现遗传密码的简并性，即存在编码相同氨基酸的多密码子。在一个例子中，本领域技术人员希望将限制性酶识别序列引入多核苷酸而不干扰此多核苷酸编码蛋白质的能力。

    在另一个例子中，编码嵌合多肽的多核苷酸可以是(且可编码)有更显著变化的生物功能等同物。一些氨基酸可在蛋白质结构中取代其它氨基酸而不明显失去与结构相互作用的结合能力，例如抗体的抗原结合区、底物分子上的结合位点、受体等。所谓“保守性”变化不干扰多肽的生物活性，因为此结构变化不影响多肽完成其设计功能的能力。因此发明者预期可对本文所述基因和蛋白质序列作出不同变化，但仍完成本发明的目的。

    在功能等同物方面，技术人员理解“生物功能等同”蛋白质和/或多核苷酸定义中固有的是分子的确定部分内可作出变化数量有限制，同时保持具有可接受相等生物活性水平的分子。本文中生物功能等同物如此定义，因为所选氨基酸(或密码子)中的多肽(和多核苷酸)可被取代。功能活性包括信号转导途径因子部分杀伤靶细胞的能力或细胞特异的靶向部分特异性靶向细胞的能力。

    一般，分子长度越短，保持功能时分子内可作出的变化越少。较长结构域可有中间数量的变化。全长蛋白质对较大数量变化有最大的耐受性。然而，必须理解一些高度取决于其结构的分子或结构域可忍受很少或没有修饰。

    氨基酸取代一般以氨基酸侧链取代基的相对类似性为基础，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小和/或其它。氨基酸侧链取代基的大小、形状和/或类型分析揭示精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸都是带正电的残基；丙氨酸、甘氨酸和/或丝氨酸都有类似大小；和/或苯丙氨酸、色氨酸和/或酪氨酸都有一般类似的形状。因此基于这些考虑，本文定义精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和/或丝氨酸；和/或苯丙氨酸、色氨酸和/或酪氨酸为生物功能等同物。

    为获得更定量的变化，可考虑氨基酸的亲水指数。各氨基酸在它们的疏水性和/或电荷特征基础上赋予亲水指数，这些是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(‑0.4)；苏氨酸(‑0.7)；丝氨酸(‑0.8)；色氨酸(‑0.9)；酪氨酸(‑1.3)；脯氨酸(‑1.6)；组氨酸(‑3.2)；谷氨酸(‑3.5)；谷氨酰胺(‑3.5)；天冬氨酸(‑3.5)；天冬酰胺(‑3.5)；赖氨酸(‑3.9)；和/或精氨酸(‑4.5)。

    一般在本领域中理解亲水氨基酸指数赋予蛋白质相互作用的生物功能的重要性(Kyte & Doolittle，1982，纳入本文供参考)。已知一些氨基酸可被有类似亲水指数和/或数值和/或仍保持相似生物活性的其它氨基酸取代。在亲水指数基础上作变化，亲水指数在±2内的氨基酸取代优选，±1内尤其优选，和/或±0.5内更尤其优选。

    本领域中也理解类似氨基酸的取代可在亲水性基础上有效进行，尤其是产生用于免疫实施方案的生物功能等同蛋白质和/或肽，如本发明的一些实施方案。纳入本文参考的美国专利4,554,101阐述了由其相邻氨基酸的疏水性决定的蛋白质最大局部平均亲水性与其免疫原性和/或抗原性相关，即与蛋白质的生物性质相关。

    如美国专利4,554,101所述，下列亲水性值已赋予氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(‑0.4)；脯氨酸(‑0.5±1)；丙氨酸(‑0.5)；组氨酸(‑0.5)；半胱氨酸(‑1.0)；甲硫氨酸(‑1.3)；缬氨酸(‑1.5)；亮氨酸(‑1.8)；异亮氨酸(‑1.8)；酪氨酸(‑2.3)；苯丙氨酸(‑2.5)；色氨酸(‑3.4)。在类似亲水性值的基础上作变化，亲水性值在±2内的氨基酸取代优选，±1内尤其优选，和/或±0.5内更尤其优选。

    B.改变的氨基酸

    本发明在许多方面取决于细胞中肽和多肽的合成，通过适当多肽的转录和翻译。这些肽和多肽包括20个“天然”氨基酸和其翻译后修饰。然而体外肽合成可使用修饰和/或稀有氨基酸。本文下面提供了修饰和/或稀有氨基酸的范例表，但不限于此表。

    

    C.模拟物

    除了上述生物功能等同物，本发明者也预期可制成结构类似的化合物以模拟本发明肽或多肽的关键部分。这种化合物可定义为肽模拟物，可使用的方式与发明肽相同，因此也是功能等同物。

    一些模拟蛋白质二级和三级结构元件的模拟物描述于Johnson等(1993)。使用肽模拟物的基本原理是蛋白质的肽主链的存在主要确定氨基酸侧链方向以促进分子相互作用，如抗体和/或抗原。因此设计肽模拟物使分子相互作用类似于天然分子。

    一些肽模拟物概念的成功应用集中在蛋白质内β‑转角的模拟物上，已知这些蛋白质是高度抗原的。如本文所讨论，可能多肽内β‑转角结构可通过以计算机为基础的算法来预测。一旦确定转角的氨基酸成分，可构建模拟物以获得氨基酸侧链的必需元件的类似空间方向。

    其它方法集中在使用小、含多二硫化物的蛋白质作为具吸引力的结构模板用于产生模拟大蛋白质的结合位点的生物活性构象(Vita等，1998)。在一些毒素中进化上似乎保守的结构基序是小(30‑40个氨基酸)、稳定和突变高度允许的。此基序包括一个β片层和一个α螺旋，通过三个二硫化物桥接于内部核心中。

    用环L‑五肽和有D‑氨基酸的肽成功地模拟βII转角(Weisshoff等，1999)。同样Johannesson等(1991)报导具有相反转角诱导性质的双环三肽。

    在本领域中揭示了产生具体结构的方法。例如，α‑螺旋模拟物公开于美国专利5,446,128；5,710,245；5,840,833和5,859,184。这些结构产生更热稳定的肽或蛋白质，也增加对蛋白水解性降解的抗性。公开了6、7、11、12、13和14节的环结构。

    描述了产生构象限制的β转角和β凸起的方法，例如美国专利5,440,013；5,618,914和5,670,155。β‑转角可改变侧面取代基而不改变相应主链构象，有适当末端用于通过标准合成过程掺入到肽中。其它种类的模拟转角包括反向和γ转角。反向转角模拟物描述于美国专利5,672,681和5,674,976。

    D.脂质体寻靶

    与脂质体有关的本发明的嵌合多肽可以改善嵌合多肽生物分布和其他特征。例如，脂质体介导的核酸传递和外源DNA体外表达都已非常成功(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987)。在培养的鸡胚胎、Hela细胞和肝细胞中进行脂质体介导的传递和外源DNA表达已证明是可行的(Wong等，1980)。静脉注射后在大鼠中进行脂质体介导的基因转移也已成功实现(Nicolau等，1987)。

    可预料的是，脂质体/嵌合多肽组合物可以含有附加材料以便运送到组织中。例如，在本发明的某些实施方式中，脂质或脂质体可以与凝血性病毒(HVJ)相关。这已被证实可以促进与细胞膜融合并促使脂质体包裹的DNA进入细胞内(Kaneda等，1989)。在另外一个实施例中，脂质或脂质体可以是复合的或用于与核非组蛋白染色体蛋白(HMG‑1)连接(Kato等，1991)。在还有一个实施方式中，脂质可以是复合的或用于与HVJ和HMG‑1连接。

    可以通过添加配体达到靶向传递，这种添加不会降低这些脂质体传递大量嵌合多肽的能力。可预期的是，这种方法可以使其传递到特定细胞、组织和器官。基于配体的传递系统的靶向特异性是以不同类型的细胞上都有配体受体的分布为基础的。靶向配体既可以非共价也可以共价连接到脂质复合物上，也可以用各种方法连接到脂质体上。

    E.交联剂

    双功能交联剂已广泛用于各种目的，包括制备亲合基质、修饰或稳定不同结构、鉴定配体和受体结合位点以及结构研究。带有两个相同官能团的同双功能试剂被证明在相同或不同的大分子或大分子亚基之间诱导交联，以及将多肽配体与其特异性结合位点的连接中是高度有效的。异双功能试剂含有两个不同的官能团。利用两个不同官能团的差异反应性，可选择性地和有序地控制交联。所述双功能交联剂可按照其官能团的特异性划分，如氨基、巯基、胍基、吲哚基、羧基特异性基团。其中，定向游离氨基的试剂最普遍，因为它们是商业上可获得的，容易合成且可用于温和反应条件下。大多数异双功能交联剂含有伯胺反应基团和硫醇反应基团。

    配体与脂质体交联方法的例子在美国专利5,603,872和5,401,511中已有描述，本文已完整地纳入作为参考。各种配体都可以通过胺残基的交联共价结合于脂质体表面。脂质体，特别是含有磷脂酰乙醇胺(PE)的多层脂泡(MLV)或单层脂泡如微乳化脂质体(MEL)和大单层脂质体(LUVET)都可以通过确立的方法制备。脂质体中的PE提供了一个位于脂质体表面的用作交联的活性功能残基‑伯胺。配体如表皮生长因子(EGF)已成功地与PE‑脂质体连接。配体共价结合于脂质体表面上的离散位点。这些位点的数量和密度是由脂质体制剂和脂质体类型所决定的。脂质体表面也可能有非共价结合的位点。为了形成配体与脂质体的共价结合，研究了交联剂的效率和生物相容性。交联剂包括戊二醛(GAD)、双功能环氧乙烷(OXR)，乙二醇二环氧丙基醚(EGDE)和水溶性碳二亚胺，优选1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。通过交联的复杂化学，建立了识别物质的胺残基与脂质体的连接。

    在另外一个实施例中，描述了异源双功能交联剂及其使用方法(美国专利5,889,155，本文已完整纳入作为参考)。交联剂将亲核的酰肼残基与亲电子的马来酰亚胺结合，使醛基与游离巯醇偶合。可以修饰交联剂以交联各种功能基团，因而可用于交联多肽和糖。表3列出了可用于本发明的某些异源双功能交联剂。

    

    如果一特定多肽在其天然序列中不含有适合所给交联剂的残基，就可采用基本序列中的保守性遗传或合成的氨基酸变化。

    VII.联合治疗/癌治疗

    为增加本发明的嵌合多肽或其编码的表达构建物的效力，可以将这些组合物与其它可有效治疗超增殖性疾病(hyperproliferative disease)的试剂，如抗癌剂，联合。超增殖性疾病包括与任何类型的异常细胞生长或异常生长调控有关的疾病和症状。在本发明的方法中，优选的患者是人。可用本发明的方法治疗各种超增殖性疾病。在本发明中要治疗的一些超增殖性疾病有银屑病、类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、骨关节炎(OA)和口、前列腺、乳房、肺等部位的肿瘤发生前的病变。本发明特别涉及一种超增性疾病：癌症。

    因此，在一些实施方案中，所述超增殖性疾病进一步被定义为癌症。再进一步的实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、牙龈癌(gum)、舌癌、白血病、成神经细胞瘤、头部肿瘤、颈部肿瘤、乳房肿瘤、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸肿瘤、卵巢肿瘤、间皮瘤、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑瘤、结肠癌、肉瘤或膀胱癌。所述癌症可包括由肿瘤细胞构成的肿瘤。在其它实施方案中，超增殖性疾病是类风湿性关节炎、炎性肠病、骨关节炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纤维瘤、血管阻塞、再狭窄、动脉粥样硬化、肿瘤发生前病变(如腺瘤增生和前列腺上皮内瘤形成)、原位癌、口腔毛状白斑(oral hairy leukoplakia)或银屑病。

    “抗癌”剂是能够在受试者中对癌症造成负作用的试剂，例如，通过杀死癌细胞、诱导癌细胞的细胞凋亡、降低癌细胞的生长速度、减少转移的发生率或数量、减小肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤细胞或癌细胞的血液供给、促进抗癌细胞或肿瘤的免疫应答、防止或抑制癌症的进展、或延长癌症患者的寿命。更一般地，这些其它的组合物可以有效杀死或抑制所述细胞增殖的组合量提供。这一方法包括使所述细胞同时接触表达构建物和试剂或多个因子。这一方法的实现可通过使细胞接触含有这两种试剂的单一组合物或药物制剂，或使细胞同时接触两种不同的组合物或制剂，其中一种组合物包括表达构建物而另一种包括第二种试剂。

    肿瘤细胞对化疗和放疗药剂有抗性是临床肿瘤学的主要问题。目前癌症研究的一个目的就是通过将化疗和放疗与基因疗法相结合以找到改进化疗和放疗的效力的方法。例如，单纯疱疹‑胸苷激酶(HS‑tK)基因，当通过逆转录病毒载体系统将其输送到脑部肿瘤中时，成功地诱导出对抗病毒剂更昔洛韦(ganciclovir)的易感性(Culver等，1992)。在本发明中，预计除其它促凋亡(pro‑apoptotic)试剂或细胞周期调节剂外，嵌合多肽可用类似的方法与化疗剂、放疗剂、基因疗法或免疫疗法联合使用。

    或者，所述治疗可在其它药剂治疗之前或之后进行，时间间隔为数分钟至数周。在实施方案中，其它药剂和表达构建物是单独给予细胞的，通常应该确保每次给予的时间之间没有明显的时间间隔，这样药剂和表达构建物仍能对细胞发挥有利的组合效果。此时，可以在约12‑24小时内用两种方式接触细胞，更优选约6‑12小时内使细胞接触另一种。在一些情况中，可能需要明显延长治疗时间，然而，每次给予之间有数天(2，3，4，5，6或7天)至数周(1，2，3，4，5，6，7或8周)的间隔。

    可采用各种组合，用“A”表述基因治疗，用“B”表示辅助的药剂，如放疗剂或化疗剂：

    A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  A/B/B  B/A/A  A/B/B/B  B/A/B/B

    B/B/B/A  B/B/A/B  A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A

    B/A/B/A  B/A/A/B  A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A

    给予患者本发明的治疗性表达构建物将按照一般的给予化疗剂的方案进行，如果有其它载体的话要考虑其它载体的毒性。必要时治疗周期将重复。还可与所述超增生性细胞疗法联合施用各种标准疗法以及手术方法。

    A.化疗

    癌症治疗也包括基于化学治疗和放射治疗的联合疗法。例如联合化疗包括顺铂(CDDP)、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、二甲磺酸丁酯、亚硝基脲、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合药、紫杉醇、耶西塔宾、诺维体、法尼基蛋白转移酶抑制剂、反式铂、5‑氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和氨甲蝶呤，或者上述药物的任何类似物或衍生变体。

    B.放疗

    广泛使用的引起DNA损伤的其他因素包括通常知道的γ射线、X射线、和/或直接将放射性同位素运送到肿瘤细胞。其他形式的DNA损伤因子还有微波和紫外线辐射。最可能的是所有这些因子都可以对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复以及染色体的装配和维持造成广泛的损伤。X射线的照射剂量范围从每日50‑200伦琴持续较长时间(3到4周)，到单剂量2000‑6000伦琴。放射性同位素的剂量范围很宽，根据同位素的半衰期、辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的摄取量而定。

    本文中所用的术语“接触”和“暴露”用到细胞上时是指将治疗构建物和化疗药或放疗药运送到靶细胞的过程或直接与靶细胞并列放置的过程。为了达到杀伤细胞或抑制细胞的目的，两种药物以有效结合量运送到细胞以杀伤细胞或阻止细胞分裂。

    C.免疫治疗

    一般来说，免疫治疗依赖使用免疫效应细胞和效应分子以靶向和杀伤癌细胞。免疫效应物可以是具有肿瘤细胞表面上一些标记物特异性的抗体。抗体可单独作为治疗的效应物，或可以通过其他细胞来达到杀伤靶细胞的目的。抗体也可以连接到药物或毒素(化疗药、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)且仅仅作为靶向药剂。另外，效应物也可以是淋巴细胞，淋巴细胞上携带能直接或间接与肿瘤细胞靶位相互作用的表面分子。各种效应细胞包括细胞毒T细胞和NK细胞。

    因此，免疫疗法可与基因疗法结合用作联合疗法的一部分。关于联合疗法的一般过程将在下文中讨论。通常，肿瘤细胞必须带有一些可被寻靶的标记，即大多数其它细胞上不带有的标记。存在许多肿瘤标记，其中任何一个都适合作为本发明的寻靶。普通的肿瘤标记物包括癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿肿瘤相关抗原、胎儿抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG‑72、HMFG、Sialyl Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP，雌激素受体、层粘连蛋白受体、erb B和p155。

    D.基因

    在另一个实施方案中，所述辅助治疗是基因治疗，其中，在给予本发明的嵌合多肽之前、之后或同时给予治疗性多肽。将嵌合多肽与编码以下基因产物之一的第二种载体联合给予将会对靶组织产生组合的抗超增生效果。或者可以使用编码这两种基因的单一载体。本发明包括多种蛋白质，其中一些在下文中描述。

    1.细胞增殖的诱导物

    根据功能诱导细胞增殖的蛋白质进一步归入不同的类别。

    所有这些蛋白共性是其调节细胞增殖的能力。例如，PDGF的一种形式sis癌基因是一种分泌型的生长因子。癌基因很少来自于编码生长因子的基因，目前sis是唯一已知的天然产生的癌基因性生长因子。在本发明的另一个实施方式中，针对细胞增殖的特定诱导物的反义mRNA用来抑制细胞增殖的诱导物的表达。

    蛋白质FMS、ErbA、ErbB和neu是生长因子受体。这些受体的突变会导致调节功能的丧失。例如，影响Neu受体蛋白跨膜区的一个点突变会形成neu癌基因。ErbA癌基因来源于甲状腺激素的胞内受体。经修饰的癌基因型ErbA受体被认为可以与内源性的甲状腺激素受体竞争而引起生长失控。

    最大的一类癌基因是信号转导蛋白(如Src，Abl和Ras)。Src蛋白是一种胞质蛋白酪氨酸激酶，在某些情况下通过527位的酪氨酸残基发生突变而使其从原癌基因转变为癌基因。相反，在一个例子中GTP酶蛋白ras通过序列中12位上的缬氨酸突变成甘氨酸而使其从原癌基因转变为癌基因，ras GTP酶活性降低。

    Jun、Fos和Myc蛋白作为转录因子直接在核内发挥功能。

    2.细胞增殖的抑制剂

    肿瘤抑制癌基因可以抑制细胞过度增殖。这些基因的灭活破坏了它们的抑制活性，导致无法调节的细胞增殖。下面描述的是肿瘤抑制基因p53、p16和C‑CAM。

    已发现在许多经化学致癌、紫外照射以及几种病毒转化过的细胞中有高水平的突变p53基因表达。在各种人类肿瘤中p53基因是很常见的突变灭活靶位，文献中把它列为人类肿瘤中最常发生突变的基因。在人NSCLC(Hollstein等，1991)以及很多其他肿瘤中的突变率超过50％。

    P53基因编码一个含393个氨基酸的磷蛋白，可以与宿主蛋白如大T抗原和E1B形成复合物。此蛋白在正常组织和细胞发现，但与转化细胞或肿瘤组织相比其浓度微小。

    在许多种类的细胞中野生型p53基因被认为是重要的生长调节剂。P53基因常常发生错义突变，这是转化癌基因的能力所必需的。点突变造成的单个遗传性改变就可产生致癌基因p53。但与其他癌基因不同的是，已知在至少30个不同的密码子上都会发生p53的点突变，常常产生显性等位基因而造成细胞表型中的漂移，而不降低纯合性。另外，在生物体中许多这样的显性负等位基因似乎是耐受的，且在种系内传代。各种突变等位基因表现为从极小的功能障碍到强渗透性的显性负等位基因(Weinberg，1991)。

    另外一种细胞增殖的抑制剂是p16。真核细胞周期的过渡主要由依赖周期蛋白的激酶即CDK’s的激发。一种CDK，依赖周期蛋白的激酶4(CDK4)调节细胞通过G1期。这个酶的活性在G1晚期可能使Rb磷酸化。CDK4的活性由活化亚基，D型周期蛋白和抑制亚基控制，抑制亚基p16^INK4的生化特征是作为一个蛋白它可以特异性地结合并抑制CDK4，因此可以调节Rb的磷酸化(Serrano等，1993；Serrano等，1995)。既然p16^INK4蛋白是CDK4抑制剂(Serrano，1993)，缺失此基因可增加CDK4的活性，导致Rb蛋白的过度磷酸化。已知p16也调节CDK6的功能。

    p16^INK4属于一类新描述的CDK抑制蛋白，这一类蛋白还包括p16^B、p19、p21^WAF1和p27^KIP1。p16^INK4基因位于染色体9p21区域，该区域常在许多类型的肿瘤中缺失。人类肿瘤细胞系中常常发生p16^INK4基因的纯合缺失和突变。此证据表明p16^INK4基因是一种肿瘤抑制基因。但是这一观点最近受到挑战，研究发现在原代未培养的肿瘤中p16^INK4基因改变的频率比培养的肿瘤细胞系中的改变频率低很多(Caldas等，1994；Cheng等，1994；Hussussian等，1994；Kamb等，1994；Kamb等，1994；Mori等，1994；Okamoto等，1994；Nobori等，1995；Orlow等，1994；Arap等，1995)。通过转染质粒表达载体恢复野生型p16^INK4基因的功能降低了一些人癌细胞系的克隆形成(Okamoto，1994；Arap，1995)。

    可以用于本发明的其他基因包括Rb、APC、DCC、NF‑1、NF‑2、WT‑1、MEN‑I、MEN‑II、zac1、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR‑1、FCC、rsk‑3、p27、p27/p16融合子、p21/p27融合子、抗血栓基因(如COX‑1，TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、gsp、hst、abl、E1A、p300、参与血管形成的基因(如VEGF，FGF，凝血细胞反应素，BAI‑1，GDAIF，或它们的受体)以及MCC。

    3.程序性细胞死亡的调节剂

    凋亡或程序性细胞死亡是正常胚胎发育、维持成体组织中的稳态以及抑制癌发生的必需过程(Kerr等，1972)。已证实Bcl‑2蛋白家族和ICE样蛋白酶是其他系统中细胞凋亡的重要调节物和效应物。已经发现Bcl‑2蛋白与滤泡性淋巴瘤相关，在控制凋亡和增加受各种凋亡刺激的细胞存活率方面发挥主要作用(Bakhshi等，1985；Cleary和Sklar，1985；Cleary等，1986；Tsujimoto等，1985；Tsujimoto和Croce，1986)。进化保守的Bcl‑1蛋白现在被认为是相关蛋白家族的一个成员，这一家族被分类为细胞死亡激动剂或细胞死亡拮抗剂。

    在此发现以后又观察到Bcl‑2可以抑制由各种刺激激发的细胞死亡。而且现在发现明显存在一个Bcl‑2细胞死亡调节蛋白家族，该家族具有共同的结构和序列同源性。这些不同的家族的成员中有的与Bcl‑2的功能相似(如Bcl_XL、Bcl_W、Bcl_S、Mcl‑1、Al、Bfl‑1)，有的则对抗Bcl‑2的功能和促进细胞死亡(如Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。

    E.手术治疗

    大约60％的癌症患者要进行某种手术，其中包括预防性手术、为诊断或分期而进行的手术、要治性手术以及姑息性手术。根治性手术是一种可以结合其他疗法的癌症治疗，如本发明的治疗、化疗、放疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或替代疗法。

    根治性手术包括切除，就是将全部或部分癌组织去掉、切去和/或破坏。肿瘤切除是指物理去除至少一部分肿瘤。除了切除肿瘤以外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电手术、以及显微控制的手术(Mohs’手术)。需要进一步说明的是，本发明也可和除去浅表癌、前期癌或附带量的正常组织结合使用。

    癌细胞、组织或肿瘤被部分或全部切除以后会在体内形成一个腔。可以通过灌注、直接注射或局部使用附加抗癌疗法进行治疗。这种治疗可以重复进行，如每1，2，3，4，5，6或7天，或者每1，2，3，4或5周，或者每1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，或12个月进行一次。治疗剂量也可以变化。

    F.其他药物

    需要说明的是，其他药物也可以和本发明的组合物联合使用以改进治疗效果。这些药物包括免疫调节剂、影响细胞表面受体的上调和GAP连接的药物、细胞抑制剂和分化剂、细胞黏附抑制剂或增加过度增殖性细胞对凋亡诱导物的敏感性的药物。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子；干扰素α、β、γ；IL‑2及其他细胞因子；F42K及其他细胞因子类似物；或MIP‑1、MIP‑1β、MCP‑1、RANTES及其他趋化因子。需要进一步说明的是，细胞表面受体或其配体如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL的上调通过对过度增殖性细胞的自分泌或旁分泌效来加强本发明组合物的凋亡诱导能力。增加GAP连接的数目而导致的细胞内信号增强提高了对邻近的过度增殖性细胞群体的抗过度增殖效应。在另外一些实施方式中，细胞抑制剂和分化剂可以和本发明的组合物联合使用以改进治疗的抗过度增殖效果。细胞黏附抑制剂也可以改进本发明组合物的治疗效果。细胞黏附抑制剂的例子是病灶黏附激酶(FAKs)抑制剂和洛伐他丁。需要进一步说明的是，增加过度增殖性细胞对凋亡敏感性的其他药物如抗体c225也可以和本发明的组合物联合使用以改进治疗效果。

    激素治疗也可与本发明的治疗或上面所描述的其他癌症治疗联合使用。激素可用于治疗某些癌症如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或宫颈癌以降低某些激素如睾酮或雌激素的水平或阻断其效果。这种治疗通常和至少一种其他癌症疗法联合使用作为任选治疗方案或减少肿瘤转移的风险。

    VIII.药物制剂

    本发明的药物组合物包含有效量的一种或多种嵌合多肽或含有嵌合多肽和至少一种溶解或分散在药学上可接受的载体中的其它试剂。术语″药学上或药理上可接受的″是指当施用给合适的动物，例如人类时不会产生副作用、过敏或其它不良反应的分子实体和组合物。就本发明公开的内容而言，含有至少一种嵌合多肽或其它活性成分的药物组合物的制备方法是精通此领域的技术人员已知的，如《Remington制药科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack印刷公司，1990)的例证，在此并入以供参考。此外，对动物(如人类)施用时，需了解所述制剂应该满足FDA生物标准办公室规定的无菌度、热原性一般安全和纯度要求。

    当用在这里时，″药学上可接受的载体″包括任何和所有溶剂、分数介质、包被、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂，抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、类似的物质及其组合、以及此领域的一般技术人员知道的那些(例如参见Remington’，第18版，Mack印刷公司，1990，1289‑1329页，在此并入以供参考)。除了任何与活性成分不相容的常规载体外，其在治疗或药物组合物中的应用是可以预期的。

    根据是以固体、液体或气雾剂形式用药，以及在用注射等途径给药时是否需要无菌，所述嵌合多肽可包含不同类型的载体。本发明可通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、肿瘤内、肌肉内、腹膜内、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内、眼内、口腔、表面、局部、通过吸入(如吸入气雾剂)、通过注射、输注、连续输注、直接局部灌注冲洗靶细胞、经导管、经灌洗、在乳膏或在脂质组合物(如脂质体)中施用，或通过其它方法其它方法或用此领域的一般技术人员已知的上述方法的任何组合(例如参见Remington制药科学，第18版。Mack印刷公司，1990，在此并入以供参考)。

    用于动物受试者的本发明组合物的实际剂量可根据身体因素或生理因素决定，如体重、症状的严重性、治疗的疾病类型、以前或同时的治疗介入、患者的特发病和给药途径。任何情况下，医生决定给药途径都要考虑组合物中活性成分的浓度以及对于个体受试者的合适剂量。

    在一些实施方案中，例如，药物组合物可以含有至少约0.1％的活性化合物。在其它实施方案中，所述活性化合物可占单位重量的约2％‑约75％，或例如约25％‑约60％，及其中包含的任何范围。在其它非限制性的实施例中，每次给药剂量包括约1微克/千克/体重、约5微克/千克/体重、约10微克/千克/体重、约50微克/千克/体重、约100微克/千克/体重、约200微克/千克/体重、约350微克/千克/体重、约500微克/千克/体重、约1毫克/千克/体重、约5毫克/千克/体重、约10毫克/千克/体重、约50毫克/千克/体重、约100毫克/千克/体重、约200毫克/千克/体重、约350毫克/千克/体重、约500毫克/千克/体重至约1000毫克/千克/体重或更高，或其中包含的任何范围。从上述所列数量中可导出的范围的非限制性实施例中，根据上述数量，可施用约5毫克/千克/体重‑约100毫克/千克/体重，约5微克/千克/体重‑约500毫克/千克/体重，等等。

    在任何情况下，所述组合物可含有各种抗氧化剂以阻止一种或多种组分的氧化。此外，可通过防腐剂以防止微生物的作用，防腐剂有各种抗菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如甲基对羟基苯甲酸酯、丙基对羟基苯甲酸酯)、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒或它们的组合。

    嵌合多肽可制成游离的碱性、中性或盐形式。药学上可接受的盐，包括酸加成盐，例如那些和蛋白性质的组合物的游离氨基形成的盐，或和无机酸如盐酸或磷酸形成的盐，或与有机酸如乙酸、草酸、酒石酸或苦杏仁酸形成的盐。与游离羧基形成的盐也可来自无机碱，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或来自有机碱如异丙胺、三甲铵、组胺或普鲁卡因。

    在实施方案中，所述组合物是液体形式，载体可以是溶剂或分散介质，其中包含但不限于水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、脂类(例如甘油三酯、植物油、脂质体)及其组合物。可以保持适当的流动性，例如，通过使用包被如卵磷脂；通过分散在载体如液体多元醇或脂质中以保持所需的粒度；通过使用表面活性剂如羟丙基纤维素；或这些方法的组合。许多情况下，含有等渗剂是优选的，等渗剂如糖类、氯化钠或它们的组合。

    在其它实施方案中，本发明可以使用滴眼液、鼻溶液或喷雾、气雾剂或吸入剂。这种组合物通常被设计成与靶组织类型兼容的形式。在一个非限制性的实施例中，鼻溶液通常被设计成以液滴或喷雾形式给药的水溶液。制备的鼻溶液在许多方面与鼻分泌物类似，这样就可以保持正常的纤毛作用。因此，在优选的实施方案中，所述含水鼻溶液通常是等渗的或轻微缓冲以将pH保持在约5.5‑约6.5。此外，如果需要的话，所述制剂中可以含有与眼制剂中所用类似的抗菌防腐剂、药物或合适的药物稳定剂。例如，各种市售的鼻制剂是已知的，并包括抗生素或抗组胺剂之类的药物。

    在一些实施方案中，制备了通过口摄入途径给药的嵌合多肽。在这些实施方案中，所述固体组合物可以包括例如溶液、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊(例如硬或软壳明胶胶囊)、缓释制剂、含服组合物、锭剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、薄片或它们的组合。口服组合物可直接掺入饮食的食物中。优选的口服给药的载体包括惰性稀释剂、可吸收的可食用载体或它们的组合。在本发明的其它方面，口服制剂可制成糖浆剂或酏剂。例如，糖浆剂或酏剂可含有至少一种活性剂、甜味剂、防腐剂、调味剂、染料、或它们的组合。

    在一些优选的实施方案中，口服制剂可含有一种或多种粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、调味剂以及它们的组合物。在一些实施方案中，组合物中可含有一种或多种以下物质：粘合剂，例如西黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉、明胶或它们的组合；赋形剂，例如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或它们的组合；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸或它们的组合；润滑剂，例如硬脂酸镁；甜味剂，例如蔗糖、乳糖、糖精或它们的组合；调味剂，例如薄荷、冬青油、樱桃香料、桔子香料等；或上述物质的组合。当单位剂型是胶囊时，除上述物质外，它可含有载体如液体载体。各种其它物质可作为包被存在或修饰单位剂量的物理形式。

    适合其它给药方式的制剂包括栓剂。栓剂是供插入直肠、阴道或尿道的各种重量和形状的固体剂型，通常加有药物。插入后，栓剂软化、融化或溶解在腔液中。通常，栓剂可含有常规的载体，例如聚二醇、甘油三酯或它们的组合。在一些实施方案中，栓剂可由混合物形成，例如，混合物中含有约0.5％‑约10％，优选约1％‑约2％的活性成分。

    无菌可注射溶液是将所需量的活性化合物掺入按照需要含有各种其它上述成分的合适溶剂，然后再过滤灭菌制得的。通常，分散体是将各种无菌活性成分掺入含有碱性分散介质和/或其它成分的无菌载体制得的。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液、悬液或乳液的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，它可从上述无菌过滤的液体介质中产生活性成分和其它所需成分的粉末。如果需要的话，所述液体介质应适当地缓冲，液体稀释剂首先被等渗然后再和盐水或葡萄糖一起注射。也可以制备供直接注射的高浓度组合物，此时需用DMSO作为溶剂以得到非常迅速的穿透，将高浓度的活性剂输送到小区域。

    所述组合物必须适合制造和储藏，并可防止微生物(如细菌和真菌)的污染。最好将内毒素污染保持在最低的安全水平，例如每毫克蛋白质小于0.5纳克。

    在特定的实施方案中，可在组合物中使用延迟吸收剂以延长可注射组合物的吸收，延长吸收剂例如单硬脂酸镁、明胶或它们的组合。

    IX.脂质组合物

    在某些实施方式中，本发明涉及含有一种或多种脂质的新型组合物，该脂质与至少一种嵌合多核苷酸相连。脂质的特征在于不溶于水但可用有机溶剂提取。本文所描述的化合物可以被本领域的技术人员理解为脂质，这些化合物包括在本发明的组合物和方法中。

    脂质可以是天然产生或合成的(即人工设计或产生的)。但是脂质通常是一种生物物质。生物脂质是本领域所熟知的，包括中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜、溶血脂(lysolipids)、鞘糖脂、糖脂、硫苷酯(sulphatides)、具有醚和酯相连的脂肪酸的脂质和可聚合的脂质、以及上述物质的组合物。

    A.脂质种类

    中性脂肪含有甘油和脂肪酸。典型的甘油是一种三碳乙醇。脂肪酸一般是一种含有碳链的分子，在链末端有酸性部分(如羧酸)。脂肪酸可以具有任何长度的碳链，但是优选的碳链长度为约2，约3，约4，约5，约6，约7，约8，约9，约10，约11，约12，约13，约14，约15，约16，约17，约18，约19，约20，约21，约22，约23，约24，约25，约26，约27，约28，约29，到约30或多个碳原子，以及其中可导出的任何范围。优选的范围为脂肪酸的主链部分中含有约14到约24个碳原子，在某些实施方式中，特别优选约16到约18个碳原子。在某些实施方式中，脂肪酸的碳链可以包含奇数的碳原子，但在一些实施方式中优选偶数的碳原子。碳链上只含有单键的脂肪酸被称为是饱和的，而碳链上含有至少一个双键的脂肪酸被称为是不饱和的。

    特异脂肪酸包括但不限于：亚油酸、油酸、棕榈酸、亚麻酸、硬脂酸、月桂酸、肉豆蔻酸、花生酸、棕榈炔酸、花生四烯酸、蓖麻油酸、结核硬脂酸、乳杆菌酸。一个或多个脂肪酸的酸性基团共价结合于甘油的一个或多个羟基。因此，单酸甘油酯由一个甘油和一个脂肪酸组成，甘油二酯由一个甘油和两个脂肪酸组成，甘油三酯由一个甘油和三个脂肪酸组成。

    磷脂一般含有甘油或鞘氨醇、离子磷酸基团以产生两性化合物及一个或多个脂肪酸。磷脂的种类包括磷酸甘油酯，其中磷酸基团连接于甘油二酯和鞘氨醇磷脂(如鞘磷脂)的甘油的第一个碳原子，其中磷酸基团被酯化成鞘氨醇氨基乙醇。鞘磷脂的另外一个例子是硫苷脂，它含有一个离子硫酸基团可以使分子两性。当然，磷脂也可以含有其他化学基团，如连接于磷酸基团的乙醇。这种乙醇基团的例子包括丝氨酸、乙醇胺、胆碱、甘油和肌醇。因此，特异性的磷酸甘油酯包括磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油或磷脂酰肌醇。其他的磷脂包括磷脂酸或二乙酰磷酸。一方面，磷脂酰胆碱含有二油酰磷脂酰胆碱(a.k.a.心磷脂)、卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、单肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、单棕榈酰磷脂酰胆碱、单硬脂酰磷脂酰胆碱，单油酰磷脂酰胆碱、二丁酰磷脂酰胆碱、二戊酰磷脂酰胆碱、二己酰磷脂酰胆碱、二庚酰磷脂酰胆碱、二辛酰磷脂酰胆碱或二硬脂酰磷脂酰胆碱。

    糖脂与鞘磷脂相关，但通过一个糖基团而不是磷酸基团连接于鞘氨醇的第一个羟基。有一类糖脂叫脑苷脂，含有一个连接于鞘氨醇的第一个羟基的糖基(如葡萄糖或半乳糖)。另外一种糖脂是神经节苷脂(如单唾酸神经节苷酯，GM1)，含有连接于第一个羟基的约2、约3、约4、约5、约6、到约7个或更多个糖基，这些糖基可以位于支链上。在另外的实施方式中，糖脂是神经酰胺(如乳糖基酰基神经酰胺)。

    类固醇是菲的四元环状系统菲衍生物。类固醇通常具有调节细胞、组织和生物体的功能，包括激素及与孕激素(孕酮)、糖皮质激素(皮质醇)、盐皮质激素(醛固酮)、雄激素(睾酮)及雌激素(雌酮)家族相关的化合物。胆固醇是类固醇的另一例子，一般发挥结构功能而不是调节功能。维生素D是甾醇的另一例子，参与从小肠中吸收钙。

    萜是一种含有一个或多个五碳异戊二烯基团的脂质。萜具有多种生物功能，包括如维生素A、辅酶Q和类胡萝卜素(如番茄红素和β胡萝卜素)。

    B.带电荷和中性的脂质组合物

    在某些实施方式中，组合物的脂质成分是不带电荷或基本不带电荷的。在一个实施方式中，组合物的脂质成分包含一种或多种中性脂质。在另一方面，组合物的脂质成分基本不含有阴离子和阳离子脂质，如某些磷脂(如磷脂胆碱)和胆固醇。在某些方面，不带电荷或基本不带电荷的脂质组合物的脂质成分包含约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的不带电荷、基本不带电荷的脂质和/或含有等量正电荷和负电荷的脂质混合物。

    在另外一个方面，脂质组合物可以是带电荷的。例如带电荷的磷脂用于制备本发明的脂质组合物，且带有净正电荷或净负电荷。在一个非限制性实施例中，二乙酰磷酸可用于赋予脂质组合物负电荷，而硬脂胺可用于赋予脂质组合物正电荷。

    C.脂质制备

    脂质可以从天然来源中获取，也可以从市场上买到，或通过化学合成，这是本领域普通技术人员所熟知的。例如磷脂可以从天然来源中获得，如蛋或大豆卵磷脂、脑磷脂酸、脑或植物磷脂酰肌醇、心磷脂以及植物或细菌的磷脂酰乙醇胺。在另外的实施例中，适合使用于本发明的脂质是从市场上买到的，例如Sigma Chemical Co.的二肉豆寇基磷脂酰胆碱(″DMPC″)；K & K Laboratories(Plainview，NY)的二乙酰磷酸(“DCP”)；Calbiochem‑Behring的胆固醇(“Chol”)；Avanti Polar Lipids有限公司(Birmingham，Ala.)的二肉豆寇基磷脂酰甘油(″DMPG″)和其他脂质。在某些实施方式中，保存在氯仿或氯仿/甲醇中的脂质溶液可以存放在约‑20℃。氯仿是优选的唯一溶剂，因为氯仿比甲醇更容易蒸发。

    D.脂质组合物的结构

    在本发明的优选实施方案中，嵌合多肽可与脂质相关。

    和脂质相关的嵌合多肽可以分散在含脂质的溶液中，与脂质溶解，脂质乳化，与脂质混和，与脂质结合，与脂质共价结合，悬浮于脂质中，包含或与微团或脂体体复合或相反与脂质或脂质结构相关。本发明的脂质或脂质嵌合多肽相关组合物不限于任何特定的结构。例如，它们也可以简单地散布于溶液中，可能形成聚集物，但没有均一的大小或形状。在另外的实施例中，它们可以以双层结构、微团或“折拢”结构存在。在另外的非限制性实施例中，也可以是lipofectamine(Gibco BRL)或Superfect(Qiagen)嵌合多肽复合物。

    在某些实施方式中，脂质组合物含有的特定脂质、脂类或非脂质组分如药物、蛋白、糖、核酸或本文描述的其他材料的量为约1％，约2％，约3％，约4％约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约11％，约12％，约13％，约14％，约15％，约16％，约17％，约18％，约19％，约20％，约21％，约22％，约23％，约24％，约25％，约26％，约27％，约28％，约29％，约30％，约31％，约32％，约33％，约34％，约35％，约36％，约37％，约38％，约39％，约40％，约41％，约42％，约43％，约44％，约45％，约46％，约47％，约48％，约49％，约50％，约51％，约52％，约53％，约54％，约55％，约56％，约57％，约58％，约59％，约60％，约61％，约62％，约63％，约64％，约65％，约66％，约67％，约68％，约69％，约70％，约71％，约72％，约73％，约74％，约75％，约76％，约77％，约78％，约79％，约80％，约81％，约82％，约83％，约84％，约85％，约86％，约87％，约88％，约89％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约100％，或其中可导出的任何范围，这是本领域技术人员所熟知的。在一个非限制性实施例中，脂质组合物含有约10％到约20％中性脂质、约33％到约34％脑苷脂和约1％胆固醇。在另一个非限制性实施例中，脂质体含有约4％到约12％萜，其中约1％的微团是特异性的番茄红素，剩下约3％到约11％的脂质体作为包含其它的萜；和约10％到约35％的卵磷脂，以及约1％的药物。因此本发明的脂质组合物可以含有任何脂质、脂类或其他组分，这些组分可以任何组合或百分比范围。

    1.乳化剂

    脂质可以包含在乳化液中。脂质乳化液是由两种或多种通常互不相溶的脂质混和形成的永久异源脂质混合物，通过机械搅拌或加入小量的乳化剂形成。制备脂质乳化液和添加附加成分的方法是本领域所熟知的(如《现代药物学》(ModernPharmaceutics)，1990，本文已纳入作为参考)。

    例如，将一种或几种脂质加入到甲醇或氯仿或任何其他合适的有机溶剂中，手动搅拌或机械搅拌，然后将溶剂从混合物中蒸发掉剩下干燥的脂质。将脂质重新悬浮于水性介质如磷酸盐缓冲液中得到了乳化液。为了使乳化脂质的大小分布更具有均一性，可以用常规超声技术进行超声处理，然后通过微流化机(例如用Microfiuidizer，Newton，Mass.)进一步乳化混合物，和/或用挤出机(LipexBiomembranes，Vancouver，Canada)在高压(如600psi)下挤出。

    2.微团

    脂质可以包含在微团中。微团是一簇或一团脂质化合物，通常以脂单层的形式存在，可以通过本领域普通技术人员所熟知的任何微团制备方法制备(如Canfield等，1990；EI‑Gorab等，1973；胶态表面活性剂，1963；和在微团和大分子系统中催化，1975，本文都已纳入作为参考)。例如，典型的制备方法是将一种或几种脂质加入到有机溶剂中制成悬液，蒸发掉溶剂后将脂质重悬于水性介质中，超声处理，然后离心。

    3.脂质体

    在特定实施方式中，脂质包含脂质体。“脂质体”是一个通用术语，包括各种通过包裹脂双层或聚集物而形成的单层或多层脂质载体。脂质体的特征是具有双层膜的泡状结构，一般含有磷脂及由水溶性组合物组成的内介质。

    多层脂质体具有多脂质层，各层之间被水性介质分开。将含有磷脂的脂质悬浮于过量的水溶液中自然地形成多层脂质体。在形成闭合结构之前脂质组分会经过自身重排，在脂双层之间截留水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat，1991)。亲脂性分子或具有亲脂性区的分子也可以溶于脂双层中，或与脂双层相连。

    在一些不十分优选的实施方案中，最好不要将天然来源的磷脂，如蛋或大豆卵磷脂、脑磷脂酸、脑或植物磷脂酰肌醇、心磷脂和植物或细菌磷脂酰乙醇胺用作主要的磷脂，即占总磷脂组合物或脂质体的50％或以上，因为这样会使得到的脂质体不稳定且不致密。

    在某些特定的实施例中，脂质和/或嵌合多肽可以被包裹在脂质体的含水内部，散布于脂质体的脂双层内，通过一个连接脂质体和嵌合多肽的分子附着在脂质体上，陷入脂质体中，与脂质体等复合。

    a.脂质体制备

    用于本发明的脂质体可以通过不同的方法制备，这些方法都是本领域普通技术人员所熟知的。当分散于水中时，磷脂可形成各种不同于脂质体的结构，取决于脂质与水的克分子比。低比例脂质体是优选的结构。

    例如，磷脂(Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)如中性磷脂二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)溶于叔丁醇。然后将脂质与嵌合多肽、和/或其他组分混和。将Tween 20加入到脂质混合物中，Tween 20约占组合物重量的5％。将过量的叔丁醇加入上述混合物，其中叔丁醇的体积至少要占95％。混合物旋转搅拌、在干冰/丙酮浴中冷冻且冻干过夜。冻干的制备物贮存在‑20℃可以保存3个月。利用Tween20包裹嵌合多肽所得到的颗粒平均直径约为0.7‑1.0μm。需要的冻干脂质体在0.9％盐水中重建。

    另外，脂质体还可以通过在装有溶剂的容器如玻璃梨型烧瓶中混和脂质而制备。容器的体积至少要有预计悬浮的脂质体体积的10倍。利用旋转蒸发器在负压、约40℃下将溶剂去除。根据所需的脂质体的体积，一般在约5分钟到2小时内去除溶剂。组合物可在真空干燥器内进一步干燥。干燥的脂质一般在约1周后废弃因为脂质体随时间而逐渐变质。

    干燥的脂质可在约25‑50mM磷脂的无菌无热源水溶液中水化，不断振荡直到所有的脂质膜重悬浮。然后可以将水性脂质体分成等分，每等分装入一小玻璃瓶中，真空下冻干密封。

    在另外一种方法中，脂质体可以根据其他已知的实验方法制备(见Bangham等，1965；Gregoriadis，1979；Deamer和Uster 1983，Szoka和Papahadjopoulos，1978；本文已将相关部分纳入作为参考)。这些方法的区别在于其不同的截留水性材料的能力以及水空间‑脂质比例。

    按照上述方法制备的干燥或冻干的脂质体可以在抑制性肽溶液中脱水和重建，并用合适的溶剂如DPBS稀释到适当浓度。然后将混合物在振荡混和器中剧烈振荡。未被包裹的附加材料如试剂，包括但不限于激素、药物、核酸构建物等可以通过29,000×g离心去除并洗涤脂质体沉淀。经过洗涤的脂质体重悬于合适浓度的磷脂溶液中，总浓度约为50‑200mM。被包裹的附加材料或活性试剂的量可以用标准方法确定。确定了包裹在脂质体制备物中的附加材料或活性试剂的量以后，可以将脂质体稀释到适当浓度并贮存在4℃备用。含有脂质体的药物组合物通常含有无菌的药学上可接受的载体或稀释剂，如水或盐溶液。

    由于合成方法的不同，脂质体的大小差别也很大。本发明的脂质体可以有各种尺寸。在某些实施方式中，脂质体很小，如外径小于约100nm，约90nm，约80nm，约70nm，约60nm，或小于约50nm。要制备这种脂质体，本文所描述的任何一种方法或本领域普通技术人员所熟知的任何方法都可以使用。其他制备脂质体的非限制性例子见以下文献的描述：美国专利4,728,578，4,727,575，4,737,323，4,533,254，4,162,282，4,310,505和4,921,578号；国际申请PCT/US85/01161和PCT/US89/05040号；英国专利申请GB2193095A号；Mayer等，1986；Hope等，1985；Mayhew等，1987；Mayhew等，1984；Cheng等，1987；以及《脂质体技术》(Liposome Technology)，1984，本文都已纳入作为参考)。

    悬浮于水溶液中的脂质体一般呈球状小泡形，具有一层或多层同心状的脂双层分子。每一层由一层平行排列的分子组成，由通用结构式XY代表，其中X是亲水性部分，Y是疏水性部分。在水性悬液中，由于呈同心状排列，因此亲水性部分趋向于与水相接触，而疏水性区域趋向于自身相连。例如，当脂质体内外有水相存在时，脂质分子形成XY‑YX排列的双层，称为薄片。当多个脂质分子的亲水部分和疏水部分互相接触时形成脂质的聚集物。这些聚集物的大小和形状由于多种不同变量如溶剂的性质和溶液中其他化合物的存在而不同。

    脂质制剂的制备通常通过超声处理或脂质体混合物的连续挤出来完成，主要过程如下：(I)反相蒸发(II)脱水‑再水化(III)去污剂透析(IV)薄膜水合。一方面，某些实施方式中制备脂质体的方法是通过热超声处理，经过递减孔径的膜或滤器顺序挤压脂质，从而形成小而稳定的脂质体结构。这一制备过程制备的脂质体/嵌合多肽或脂质体仅具有合适而均一的尺寸，其结构稳定且产生最大活性。这种技术是本领域普通技术人员所熟知的(见Lang等，1990)。

    制备出来后脂质结构就可用于包裹毒性的(如化疗药)或在循环中不稳定的(如核酸)的化合物。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和/或二价阳离子的存在。脂质体对离子和/或极性物质的渗透性低，但在温度升高时会发生相变，这会显著改变其渗透性。相变包括从紧密包裹的有序结构(称为凝胶态)变为松散包裹的无序结构(称为流态)。这发生在特征性相变温度下，和/或导致对离子、糖和/或药物的渗透性增加。脂质体包裹可以使这种化合物的毒性降低，在血液中的半衰期延长(Gabizon等，1990)。

    脂质体与细胞接触并通过四种不同的机制传递药剂：网状内皮系统的吞噬细胞如巨噬细胞和/或噬中性白细胞的胞吞作用；通过非特异性弱疏水作用和/或静电力，和/或通过与细胞表面组分的特异性相互作用吸附到细胞表面；通过将脂质体的脂双层插入质膜，同时将脂质体内含物释放到胞质中而与浆细胞膜融合；和/或将脂质体的脂质转移到细胞膜和/或亚细胞膜，和/或反之亦然，而不与脂质体的内含物发生任何关系。改变脂质体的制剂可改变哪个机制是可行的，尽管同时有多个机制可操作。

    许多疾病治疗采用基于脂质的基因转移方法从而改善常规治疗或建立新的治疗方法，特别是过度增生性疾病的治疗。脂质体制剂的优势在于可以提高体内基因转移的效率(Templeton等，1997)和用这些方法制备脂质体。其他制备脂质制剂进行核酸转移的方法也有描述(WO 99/18933)。

    另外一种脂质体制剂是双亲性的载体，叫溶剂稀释微载体(SDMC)，可以将特定分子整合到脂质载体的脂双层中(美国专利5,879,703号)。SDMC可用于传递脂多糖、多肽、核酸等。当然，其他任何制备脂质体的方法都可以被本领域的技术人员使用以获得期望的本发明的脂质体制剂。

    b.靶向配体

    靶向配体既可以锚定于复合物的疏水性部分或附着在复合物的亲水性部分的活性端基上。靶向配体通过连接于亲水性多聚物的远端上的活性基团附着在脂质体上。优选的活性基团包括氨基、羧基、酰肼基和巯醇基。靶向配体和亲水性多聚物的偶合可以用本领域普通技术人员所熟知的标准有机化学方法完成。在某些实施方式中，靶向配体的总浓度为约0.01mol到约10％mol。

    靶向配体可以是任何具有对靶向区域的特征性组分特异的配体。优选的靶向配体包括蛋白如多克隆或单克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体、酶、或激素、或糖如单糖、寡糖或多糖(见Heath等，Chem.Phys.Lipido 40：347.1986)。例如，二唾酸神经节苷酯GD2是一种肿瘤抗原，该抗原已被证实来源于神经外胚层肿瘤如神经母细胞瘤、黑色素瘤、小细胞肺癌、神经胶质瘤和某些肉瘤(Mujoo等，1986，Schulz等，1984)。含有抗二唾酸神经节苷酯GD2单克隆抗体的脂质体已被用于帮助脂质体靶向表达肿瘤抗原的细胞(Montaldo等，1999；Pagan等，1999)。在例外一个非限制性例子中，乳腺癌和妇科癌抗原特异性抗体被描述在美国专利5,939,277号中，本文已纳入作为参考。还有一个非限制性例子是前列腺癌特异性抗体被描述在美国专利6,107,090号中，本文已纳入作为参考。因此，本文所描述的或本领域普通技术人员所熟知的抗体可以结合本发明的组合物和方法用于靶向特定组织或细胞类型。在本发明的某些实施方式中，所用的靶向配体可与整合素、蛋白聚糖、糖蛋白、受体或转运蛋白相互作用。合适的配体包括任何具有对靶器官的细胞特异的配体，或者对靶器官结构特异的配基，这些靶器官由于局部出现病理状态如肿瘤而暴露于血液循环中。

    在本发明的某些实施方式中，为了增加细胞的转导、增加靶细胞的转导或限制不需要的细胞的转导，将抗体或环肽靶向部分(配体)与脂质复合物相连。这种方法是本领域所熟知的。例如，脂质体已被进一步描述可以特异性地靶向哺乳动物中枢神经系统的细胞(美国专利5,786,214号，本文已纳入作为参考)。脂质体基本由

    N‑戊二酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇和油酸组成，其中神经胶质特异性的单克隆抗体与脂质体相连。需要说明的是，单克隆抗体或抗体片段可用于靶向传递到动物的特定细胞、组织或器官，如脑、心、肺、肝等。

    另外，嵌合多肽也可以通过受体介导的传递和/或含有脂质或脂质体的靶向载体传递到靶细胞。这是利用发生在靶细胞上的受体介导的内吞作用选择性摄取大分子。由于各种受体的细胞类型特异性的分布，因此这种传递方法为本发明添加了另一种程度的特异性。

    因此在本发明的某些方面，可以根据特异性表达于靶细胞群上的受体来选择配体。细胞特异性嵌合多肽传递和/或靶向载体可以含有与脂质体结合的特异性结合配体。待传递的嵌合多肽被包裹在脂质体中，特异性结合配体被功能性地掺入到脂质体膜内。因而脂质体可以特异性地结合靶细胞的受体并把脂质体内容物传递到细胞。这种系统已被证实是具有功能的，例如，含有表皮生长因子(EGF)的系统被用于将核酸通过受体介导的方式传递到显示EGF受体的上调的细胞。

    在某些实施方式中，受体介导的传递和/或靶向载体含有细胞受体特异性配体和嵌合的多肽结合药物。其他含有细胞受体特异性配体的待传递的嵌合多肽已操作性地附着在配体上。例如，几种配体已被用于受体介导的基因转移(Wu和Wu，1987；Wagner等，1990；Perales等，1994；Myers，EPO 0273085)，上述文献确立了该技术的可操作性。在另外一个实施例中，描述了在另外一种哺乳动物细胞类型中的特异性传递方法(Wu和Wu，1993，本文已纳入作为参考)。

    在更进一步的实施方式中，特异性结合配体含有一种或多种直接与细胞特异性结合的脂质或糖蛋白。例如，乳糖基神经酰胺是一种半乳糖末端的唾酸神经节苷酯，被掺入到脂质体中，且发现增加肝细胞对胰岛素基团的摄取(Nicolau等，1987)。唾酸糖蛋白、唾酸胎球蛋白含有末端半乳糖残基，也被证实可以引导脂质体靶向到肝脏(Spanjer和Scherphof，1983；Hara等，1996)。连接于多肽主链的甘露糖基、岩藻糖基或N‑乙酰基葡糖胺结合高亲和性manose受体(美国专利5,432,260号，本文特地完整纳入作为参考)。需要说明的是，本发明的细胞或组织特异性转化构建物也可以以类似的方式特异性地传递到靶细胞或组织中。

    在另外一个实施例中，乳糖基神经酰胺和针对LDL受体相关蛋白的肽如载脂蛋白E3(“Apo E”)已用于将脂质体靶向到肝脏(Spanjer和Scherphof，1983；WO98/0748)。

    也描述了叶酸盐和叶酸盐受体可用作细胞靶向物(美国专利5,871,727号)。在这个实施例中，维生素叶酸盐与复合物偶联。叶酸盐受体对其配体具有高亲和力并在几种恶性细胞系的表面上过度表达，包括肺、乳腺和脑肿瘤。抗叶酸物质如氨甲蝶呤也可用作靶向配体。运铁蛋白介导的传递系统靶向大量的表达运铁蛋白受体的复制细胞(Gilliland等，1980)。

    c.脂质体/核酸结合物

    在某些实施方式中，脂质体/嵌合多肽可包含核酸，如寡核苷酸、核苷酸或核酸构建物(如表达载体)。在细菌启动子用于DNA构建物(即被转染入真核(细胞的构建物)时，还需要在脂质体内包括合适的细长聚合物。

    需要说明的是，脂质体/嵌合多肽组合物含有细胞或组织特异性核酸时，这一技术可适用于本发明。在某些实施方式中，基于脂质的非病毒制剂提供了一种病毒基因疗法的替代方法。尽管许多细胞培养研究证实基于脂质的非病毒基因转移、通过基于脂质的制剂进行系统基因传递有限制。基于脂质的非病毒基因传递的主要限制是组成非病毒传递载体的阳离子脂质的毒性。脂质体的体内毒性可以部分解释体外和体内基因转移结果的差异。造成这种矛盾数据的其他因素是在血清蛋白的存在和不存在时脂质体稳定性中的差异。脂质体与血清蛋白之间的相互作用严重影响脂质体的稳定性(Yang和Huang，1997)。阳离子脂质体吸引和结合带负电荷的血清蛋白。被血清蛋白包被的脂质体被溶解或被巨噬细胞吸收，导致脂质体从循环中清除。现在的脂质体体内传递方法用雾化、皮下注射、皮内注射、瘤内注射或颅内注射以避免出现与循环中阳离子脂质相关的毒性和稳定性问题。脂质体和血浆蛋白的相互作用是引起体外(Felgner等，1987)和体内(Zhu等，1993；Philip等，1993；Solodin等，1995；Liu等，1995；Thierry等，1995；Tsukamoto等，1995；Aksentijevich等，1996)基因转移的效率之间差异的主要原因。

    已描述将病毒颗粒靶向缺乏单个细胞特异性标记的细胞的示范性方法(美国专利5,849,718)。在此方法中，如抗体A是肿瘤特异性的，但是对正常的心、肺组织也有特异性，抗体B是肿瘤特异性的，但是对正常的肝细胞也有特异性。如果单独使用抗体A或抗体B传递抗增殖性核酸到肿瘤就可能使正常的心和肺或肝细胞受到损伤。但是可以将抗体A和抗体B结合使用以改善细胞靶向性。因此，抗体A连接一个编码抗增殖性核酸的基因，通过受体介导的摄取系统被传递到肿瘤以及心和肺组织中。但是基因在这些细胞内不转录因为缺乏必需的转录因子。抗体B连接一个编码转录因子的通用活性基因，该转录因子可以使抗增殖性核酸转录，且被传递到肿瘤和肝细胞中。所以心和肺细胞中只有失活的抗增殖性核酸被传递，由于其不能被转录故不会产生不利影响。在肝细胞中，编码转录因子的基因被传递和转录，但是由于没有抗增殖性核酸基因存在故也不会产生不利影响。在肿瘤细胞中，两个基因被传递且转录因子可以活化抗增殖性核酸的转录，产生肿瘤特异性的毒性效应。

    添加用于基因传递治疗过度增殖性疾病的靶向配体可以传递基因，这些基因产物的毒性比非靶向系统要大。这种可传递的毒性基因的例子包括促凋亡基因如Bax和Bak，来源于病毒和其他病原体的基因如腺病毒E4或f4、大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶即所谓的“自杀基因”，该基因可以将前药6‑甲基嘌呤脱氧核苷转化成毒性嘌呤6‑甲基嘌呤。用前药治疗的其他自杀基因的例子有大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因和HSV胸腺嘧啶激酶基因。

    还可能利用非靶向性或靶向性的脂质复合物在体内产生重组或修饰蛋白。例如，两个或多个质粒可用于引导逆转录病毒序列加上治疗基因进入过度增殖性细胞内。来源于一个质粒转运形式提供的逆转录病毒蛋白可以包装第二携带基因的治疗质粒。因此转导的细胞成为携带治疗基因的非复制逆转录病毒的产生位点。这些逆转录病毒然后可以感染邻近的细胞。治疗基因的启动子可以是或可以不是可诱导的或组织特异性的。

    同样，被转移的核酸可以代表一个有复制能力或条件复制型病毒基因组，如缺乏全部或部分腺病毒E1a或E2b区，或者有一个或多个转录自E1a和/或E1b区转录的组织特异性或可诱导启动子的腺病毒基因组。这种有复制型或条件复制型核酸可以含有或不含有附加的治疗基因，如肿瘤抑制基因或抗癌基因。

    d.脂质给药

    给予病人的脂质组合物(如脂质体‑嵌合多肽)的实际剂量要根据病人的身体或生理因素决定，如体重、病情严重程度、病人的特发病以及药要途径。考虑到这些因素，给予特定病人的脂质组合物的剂量和/或疗程就很容易确定。

    本发明可以通过下列途径给药：静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠、表面、瘤内、肌肉内、腹膜内、皮下、囊内、粘膜、心包内、口腔、局部、和/或采用气雾剂、注射、输注、连续输注、局部灌注直接冲洗靶细胞或通过导管和/或灌洗。

    X.抗体制备

    A.多克隆抗体

    多克隆抗体在本发明的多个实施方案中对嵌合多肽都是有用的。嵌合多肽的多克隆抗体通常被饲养在动物中，通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射嵌合多肽和佐剂。可用双功能试剂或衍生剂，例如马来酰亚氨苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基结合)、N‑羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基结合)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl₂或R¹N＝C‑NR，其中R和R¹是不同的烷基，将嵌合多肽或含有靶氨基酸序列的片段与在被免疫的物种中呈免疫原性的蛋白质如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂结合。

    用免疫原性结合物免疫动物，将1mg的1μg结合物(分别对兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混合并将此溶液在多个位点皮内注射。一个月后在多个位点皮下注射占原始量1/5至1/10的溶于弗氏完全佐剂的结合物。7‑14天后抽取动物血样并测定血清抗嵌合多肽的抗体效价。对动物加强注射直至效价平稳定。优选用相同嵌合多肽但与不同蛋白质结合和/或通过不同交联剂结合的结合物注射动物。还可在重组细胞培养物中制备结合物以作为蛋白质融合物。还使用了明矾等凝聚剂以增强免疫应答。

    B.单克隆抗体

    单克隆抗体获得自一群大体同质的抗体，即除了可能存在少量天然产生的突变外，个体的抗体所含的种群是相同的。因此，修饰剂“单克隆”指明抗体的特征不是离散抗体的混合物。

    例如，本发明的抗‑嵌合多肽的单克隆抗体可用杂交瘤方法制备，该方法首先由Kohler和Milstein描述(1975)，或用重组DNA法[Cabilly等，美国专利号4,816,567]制备。

    在杂交瘤法中，小鼠或其它合适的宿主动物，如仓鼠按上述方法免疫以取出淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能产生与用来免疫的蛋白质特异性结合的抗体。或者，可在体外免疫淋巴细胞。然后用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞[Goding，《单克隆抗体：原则与实践》(MonoclonalAntibodies：Principles和Practice)，59‑103页(学院出版社，1986)。

    将这样制得的杂交瘤细胞接种到合适的培养基上并使其生长，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常含有次黄嘌呤、氨基蝶岭和胸苷(HAT培养基)，这种物质可防止HGPRT‑缺陷型细胞的生长。

    优选的骨髓瘤细胞是有效融合、支持经过选择的抗体产生细胞稳定地以高水平表达抗体，且对HAT培养基敏感。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，如来源于Salk研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center，圣迭戈，加利福尼亚，USA)的MOPC‑21和MPC‑11小鼠肿瘤细胞系和获得自美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection，Rockville，马里兰州，USA)的SP‑2细胞。

    测定生长有杂交瘤细胞的培养基产生抗嵌合多肽的单克隆抗体的能力。优选地，杂交瘤细胞产生的对单克隆抗体的结合特异性是通过免疫沉淀或体外结合测定如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)确定的。

    例如，对单克隆抗体的结合亲和力可用Munson和Pollard(1980)的Scatchard分析确定。

    鉴定杂交瘤细胞产生的抗体具有所需的特异性、亲和力和/或活性后，通过有限稀释过程克隆可亚克隆并用标准方法培养。Goding，单克隆抗体：原则与实践(Monoclonal Antibodies：Principles和Practice)，59‑104页(学院出版社，1986)。用于此目的的合适培养基包括，例如Dulbecco改进的Eagle培养基或RPMI‑1640培养基。此外，所述杂交瘤细胞可作为动物的腹水瘤在体内生长。

    用适当的方法将通过亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水液或血清中分离，可用常规的免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白质A‑琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透性或亲和层析。

    用常规的方法(例如，用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易分离并测序编码本发明单克隆抗体的DNA。本发明的杂交瘤细胞是优选的这类DNA的来源。一旦分离，此DNA可放入表达载体中，然后转染入宿主细胞，如猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以在重组的宿主细胞中合成单克隆抗体。DNA还可被修饰，例如用编码序列代替人重链和轻链恒定区来代替同源的鼠序列(Morrison等，1984)或将免疫球蛋白编码序列与全部或部分非免疫球蛋白多肽的编码序列共价结合。用那种方法，制备了具有这里所述抗‑嵌合多肽单克隆抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂交”抗体。

    通常，这种非‑免疫球蛋白多肽适合作为本发明抗体的恒定区，或者它们代替了本发明抗体的抗原结合位点的可变区，以产生嵌合的二价抗体，该抗体含有一个对嵌合多肽具有特异性的抗原‑结合位点和另一个对不同抗原具有特异性的抗原‑结合位点。

    还可用合成蛋白质化学领域中已知的方法在体外制备嵌合或杂交抗体，包括使用交联剂的方法。例如，可用二硫化物交换反应或通过形成硫酯键构建免疫毒素。用于此目的的合适试剂的例子包括亚氨基硫醇盐和甲基‑4‑巯基丁酰亚胺酸盐。

    为用于诊断，本发明的抗体通常用可检测的部分标记。所述可检测的部分可以是能够直接或间接产生可检测信号的任何部分。例如，可检测的部分可以是放射性同位素，如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S或¹²⁵I，荧光或化学发光化合物，如异硫氰酸荧光素、罗丹明或荧光素；生物素；放射性同位素标记，如¹²⁵I、³²P、¹⁴C或³H，或酶，如碱性磷酸酶、β‑半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。

    可采用此领域已知的用来将抗体与可检测的部分分别结合的任何方法，包括Hunter等(1962)；David等(1974)；Pain等(1981)和Nygren(1982)描述的方法。

    本发明的抗体可用于任何已知的测定方法，如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定以及免疫沉淀测定。Zola，《单克隆抗体：技术手册》(MonoclonalAntibodies：A Manual of Techniques)，147‑158页，(CRC出版社有限公司，1987)。

    竞争性结合测定取决于标记的标准物(它可以是嵌合多肽或其免疫反应部分)与试验样品分析物(嵌合多肽)竞争用于与有限量的抗体结合。试验样品中嵌合多肽的量与抗体结合的标准物的量成反比。为便于确定结合的标准物的量，抗体在竞争前或竞争后通常是不溶的，这样，与抗体结合的标准物或分析物就可与未结合的标准物和分析物分离。

    夹心测定要使用两种抗体，每种都能结合被测蛋白质的不同免疫原性部分或表位。在夹心测定中，试验样品分析物被固定在固体支持物上的第一抗体结合，此后第二抗体与分析物结合，这样就形成了一种不溶的由三部分构成的复合物(美国专利号4,376,110)。第二抗体本身可被可检测的部分标记(直接夹心测定)，或可采用被可检测测的部分标记的抗免疫球蛋白抗体进行测量(间接夹心测定)。例如，一种类型的夹心测定是ELISA测定，其中可检测的部分是酶。

    C.人源化抗体

    将非人抗体人源化的方法是此领域熟知的。人源化抗体通常从非人来源引入了一个或多个氨基酸残基。这些非人的氨基酸残基通常被称为“输入”残基，它通常来自“输入”可变区。人源化实质上可按Winter及其同事的方法(Jones等(1986)；Riechmann等(1988)；Verhoeyen等(1988))，用啮鼠类动物CDRs或CDR序列代替人抗体的相应序列进行。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(Cabilly，同上)，其中，实质上至少有一个完整的人可变区被非人种类的相应序列代替。实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和一些可能的FR残基被啮鼠类动物抗体中类似位点的残基替代。

    重要的是，被人源化的抗体保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物特性。为实现这一目的，根据优选的方法，人源化抗体是用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念的人源化产物的方法制备的。三维免疫球蛋白模型通常是商业上可获得的，且是精通此领域的技术人员熟知的。可获得能说明并展示所选候选免疫球蛋白序列的大致三维构象结构的计算机程序。检测这些展示可分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析这些残基影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力。用这种方法，可选择FR残基并结合共有和输入序列，这样就可得到所需的抗体特征，如提高了对靶抗原的亲和力。通常，CDR残基直接并最显著地参与影响抗原的结合。为了解更多的细节可参见提交于1992年8月21日的美国专利申请序列号07/934,373，它是1991年1月14日提交的部分继续申请序列号07/715,272。

    D.人抗体

    可用杂交瘤法制造人单克隆抗体。Kozbor(1984)和Brodeur等描述了用来产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠‑人杂交骨髓瘤细胞系，《单克隆抗体生产技术和应用》(Monoclonal Antibody Production Techniques和Applications)，第51‑63页，(Marcel Dekker有限公司，纽约，1987)。

    现在可能生产转基因动物(如小鼠)，免疫接种后，这种动物在没有内源免疫球蛋白产生时能产生人抗体的所有组成成分。例如，已经描述在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链结合区(J_H)基因的纯合缺失会导致完全抑制内源抗体产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这种种系的突变小鼠中将产生对抗原攻击的人抗体。例如参见Jakobovits等，(1993)。

    或者，可采用噬菌体展示技术(McCafferty等，(1990)，从未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因在体外产生人抗体和抗体片段。根据这种技术，抗体V区基因被框内克隆进丝状噬菌体如M13或fd的主要外被蛋白基因或次要外被蛋白基因，并作为功能抗体片段在噬菌体颗粒的表面上展示。

    由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体的功能特性的选择还可选择编码具有这些特性的抗体的基因。因此，噬菌体模拟B细胞的一些特征。噬菌体展示可用各种模式进行；为了解这些模式可参见Johnson和Chiswell(1993)。一些来源的V‑基因片段可用于噬菌体展示。Clackson等(1991)从来耗于自免疫小鼠脾脏的小的V基因随机组合文库分离了各种抗噁唑酮的抗体阵列。可按Marks等(1991)或Griffith等(1993)描述的技术构建未免疫人供体的V基因的所有组成成分，并分离抗各种抗原阵列(包括自身抗原)的抗体。在天然免疫应答中，抗体基因以高速率积累突变(体细胞高变)。一些引入的变化会赋于高亲和力，展示高亲合表面免疫球蛋白的B细胞被优先复制并在随后的抗原攻击中分化。采用称为“链改组”(Marks等，1992)的技术可模拟这种天然的过程。在这种方法中，通过噬菌体展示获得的“主要”人抗体的亲和力可通过用获得自未免疫供体的V区基因的天然产生的变体(所有组成成分)替换重链和轻链V区基因来改进。这种技术可产生在具有nM范围亲和力的抗体和抗体片段。制备非常大的噬菌体抗体所有组成成分(也称为“所有母体文库(the mother‑of‑all libraries)”的方法由Waterhouse等(1993)描述，Griffith等(1994)报道了从这种大噬菌体文库直接分离高亲和人抗体的方法。也可用基因改组从啮鼠类抗体获得人抗体，这里的人抗体与起始的啮鼠类抗体具有类似的亲和力和特异性。根据这种方法(也被称为“表位印记”)，通过噬菌体展示技术获得的啮鼠类抗体的重链或轻链V区基因被人类V区基因的所有组成成分替代，产生啮鼠‑人嵌合体。筛选抗原导致能够恢复功能性抗原结合位点的人可变区的分离，即表位控制(印记)对伙伴的选择。当重复这一过程以替代其余的啮鼠V区时获得了人抗体(参见PCT专利申请WO 93/06213，公布于1993年4月1日)。不同于传统的通过CDR移植获得的啮鼠抗体，这种技术提供了完全没有啮鼠的构架或CDR残基的人抗体。

    E.双特异性抗体

    双特异性抗体是单克隆的，优选是对至少两个不同抗原有结合特异性的人抗体或人源化抗体。此时，一种结合特异性是对嵌合多肽的，另一种是对另一种抗原的，优选是对另一种受体或受体亚基的。例如，特异性结合一种嵌合多肽和神经营养因子或两种不同的嵌合多肽的双特异性抗体在本发明的范围之内。

    F.制备双特异性抗体的方法是此领域已知的

    通常，双特异性抗体的重组生产基于两个免疫球蛋白重链‑轻链对的共表达，这里的两个重链有不同的特异性(Milstein和Cuello(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，这些杂交瘤(quadromas)产生10种不同抗体分子的混合物，其中仅有一种有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常是通过亲和层析步骤完成的，颇为麻烦，产量低。类似的方法描述在PCT申请公布号WO 93/08829(公布于1993年5月13日)和Traunecker等(1991)。

    根据一种不同且更优选的方法，具有所需结合特异性(抗体‑抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白的恒定区序列融合。优选与含有至少部分绞链CH₂和CH₃区的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选第一个重链恒定区(CH1)包含轻链结合所需的位点，出现在至少一个融合物中。编码免疫球蛋白重链融合物和，如果需要的话，免疫球蛋白轻链的DNA被插入单独的表达载体，并被共转染入合适的宿主生物。当构建中所用的三种多肽链比例不相等时，这样可得到调节实施方案中三种多肽片段相互比例的最大灵活性，从而得到最佳产量。然而，当至少两种多肽链以相同比例表达或当这些比例不是特别显著时，也可以将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一种表达载体，这样也可得到高产量。在这一方法的优选实施方案中，所述双特异性抗体的一个臂是具有第一中结合特异性的杂交免疫球蛋白重链，另一个臂是杂交免疫球蛋白重链‑轻链对(提供第二个结合特异性)。发现这种不对称的结构有利于所需的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链结合物分离，这是因为免疫球蛋白轻链只出现在一半的双特异性分子中，这样就提供了简便的分离途径。这一方法描述在1992年8月17日提交的待审批申请07/931,811中。

    为了解产生双特异性抗体的细节可参见Suresh等，(1986)。

    G.异结合抗体(Heteroconjugate antibodies)

    异结合抗体也在本发明范围之内。异结合抗体由两个共价连接的抗体组成。例如，已提出这种抗体将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利号4,676,980)，以及用于治疗HIV感染(PCT申请公布号WO 91/00360和WO 92/200373；EP 03089)。异结合抗体可用任何简便的交联法制备。合适的交联剂是此领域熟知的，并描述在美国专利号4,676,980中，其中还描述了许多交联技术。

    实施例

    以下例举了实践本发明的优先实施方案。然而，它们是非限制性的实施例。其它实施例和方法也可实践本发明。

    实施例1

    材料

    以下材料被用于本文描述的多个实施例。PCR试剂获得自FisherScientific(匹兹堡，PA)，分子生物酶购自Boehringer Mannheim(印第安纳波利斯，IN)或New England Biolabs(贝弗利，MA)。细菌菌株、pET细菌表达质粒和重组型肠激酶获得自Novagen(麦迪逊，WI)。所有化学制品来自Sigma化学制品公司(圣路易斯，MO)或Fisher Scientific(匹兹堡，PA)。金属亲合树脂(Talon或Nichelagrose)获得自Clontech(帕洛阿托CA)。组织培养试剂来自Gibco BRL(盖瑟斯堡MD)。

    来自美国模式培养物保藏所(ATCC，马纳萨斯，VA)的人皮肤T细胞淋巴瘤(Hut78)培养在含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基中。被flt‑1受体(PAE‑Flt‑1)或flk‑1/KDR受体(PAE‑flk‑1)转染的猪主动脉内皮细胞受赠于J.Waltenberger博士，并培养在加有10％FBS的F12营养混合物(HAM)中。人黑色素瘤A375M细胞系获得自得克萨斯大学MD安德逊癌症中心(休斯顿，TX))的I.J.Fidler博士，并培养在补充有10％FBS的MEM中。

    实施例2

    方法‑克隆人粒酶B基因

    以下方法至少被用于实施例13。用GlassMAX RNA微量分离自旋筒系统(GlassMAX RNA Microisolation Spin Cartridge System(Gibco BRL))分离Hut 78RNA，确定总RNA的量。然后将样品与DNA酶I在室温下培育15分钟以除去基因组DNA。加入EDTA溶液并在65℃加热15分钟将DNA酶I灭活。用RT‑PCR的SUPERSCRIPT第一链合成系统(Gibco BRL)以寡(dT)合成第一链。通过PCR，以NcoIgb(5’到3’)：GGTGGCGGTGGCTCCATGGAACCAATCCTGCTTCTG(SEQ ID NO：1)和CxhoIgb(5’到3’)：GCCACCGCCTCCCTCGAGCTATTAGTAGCGTTTCATGGT(SEQ ID NO：2)作为引物扩增靶cDNA(成熟前人粒酶B cDNA)。PCR条件包括：变性‑95℃5分钟，PCR循环‑94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分钟，共循环30次；延伸‑72℃5分钟。在1％琼脂糖凝胶上跑电泳以确定PCR产物。然后将PCR产物克隆入PCR 2.1 TA载体(Invitrogen；Carlsbad，CA)并称为gbTA。将gbTA转化入INVαF’感受态细胞，并通过蓝/白集落筛选或通过PCR方法筛选阳性克隆。阳性克隆的DNA用QIAprep Spinprep试剂盒(Qiagen；Valencia，CA)分离并测序以确定人粒酶B基因；正确的克隆鉴定为gbTA‑2(2号克隆)。

    实施例3

    方法‑构建粒酶B‑vegf121或粒酶B‑scFvMEL融合基因

    以下融合构建物用于多个所描述的这里实施例。融合构建物粒酶B‑vegf121是Ek‑粒酶B‑G4S接头‑vegf121模式的。构建基于重叠PCR法。简言之，通过PCR，以NgbEK(5’到3’)：GGTACCGACGACGACGACAAGATCATCGGGGGACATGAG、Cgb(5’到3’)(SEQ ID NO：3)和GGAGCCACCGCCACCGTAGCGTTTCATGGT(SEQ ID NO：4)作为引物从gbTA‑2扩增粒酶B编码序列。这是为了删除成熟前粒酶B的信号序列并在N‑末端插入一个肠激酶切割位点，此外还在C末端加入G4S接头序列以与vegf121基因连接。通过PCR，以Nvegf(5’到3’)GGTGGCGGTGGCTCCGCACCCATGGCAGAA(SEQ ID NO：5)和CxhoI veg(5’到3’)AAGGCTCGTGTCGACCTCGAGTCATTACCGCCTCGGCTTGTC(SEQ IDNO：6)作为引物，从质粒pET22‑vegf121(德克萨斯大学西南医学院(Dallas，TX)Phil Thorpe博士的小组馈赠的礼物)扩增vegf121序列。通过PCR，以Nzme2(5’到3’)GGTGGCGGTGGCTCCACGGACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTC(SEQ ID NO：7)和Czme2(5’到3’)GGAGCCACCGCCACCCTCGAGCTATCATGAGGAGACGGTGAGAGTGGT(SEQ IDNO：8)作为引物，从质粒pET32‑scFvMEL/TNF扩增ScFvMEL序列。这些引物在N末端加入G4S接头序列以进行与粒酶B的C末端连接的重叠PCR，并在C末端引入一个Xho I位点以简化随后的克隆步骤。刚好在XhoI位点之前的C末端添加两个终止密码子。以NgbEK和CxhoIveg(对粒酶B‑vegf121)或NgbEK和Czme2(对粒酶B‑scFvMEL)作为引物通过第二次PCR将融合的基因连接在一起。为将融合基因克隆入pET32a(+)载体，该载体在粒酶B的N末端带有一个肠激酶位点，通过PCR以T7启动子(5’到3’)TAATACGACTCACTATAG(SEQ ID NO：9)和CpET32EK](5’到3’)CTTGTCGTCGTCGTCGGTACCCAGATCTGG(SEQ ID NO：10)作为引物扩增来自pET32a(+)的片段。所述引物C末端的肠激酶位点被融合基因的N末端重叠。通过重叠PCR，用引物T7启动子和CxhoIveg构建了融合基因EK‑粒酶B‑vegf121，并用引物T7启动子和Czme2构建了融合基因EK‑粒酶B‑scFvMEL。PCR反应需进行30次循环：94℃ 1分钟，50℃ 1分钟，72℃ 1分钟，延伸反应是在72℃ 5分钟。扩增的片段用1％琼脂糖凝胶电泳分离并用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。在37℃用Xba I和Xho I将纯化的PCR产物消化3小时，然后通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，从凝胶中纯化并克隆入pET32a(+)载体，称为pET32GrB‑vegf121或pET32GrB‑scFvMEL。将连接混合物转化入DH5α感受态细胞，通过PCR筛选阳性克隆，然后测序。选择具有T7启动子、lac操纵子、rbs、Trx.tag、His.tag、S‑tag和粒酶B‑G4S‑vegf121或粒酶B‑G4S‑scFvMEL肠激酶位点，但没有第二个位点突变的克隆，将其转化入AD494(DE3)pLysS感受态细胞以进一步诱导和表达。

    实施例4

    方法‑在大肠杆菌中诱导和表达粒酶B‑vegf121或粒酶B‑scFvMEL融合蛋白

    按这里的描述诱导并表达实施例3的融合构建物，以用于这里的多个实施例，至少包括实施例17和18。用构建的质粒转化的细菌集落在含有200μg/ml氨苄青霉素、70μg/ml氯霉素和15μg/ml卡那霉素的Luria肉汤(LB)培养基中于37℃以240rpm振荡生长过夜。然后以1∶100的比例将培养物稀释到加有抗生素的新鲜LB培养基，并在37℃生长至A₆₀₀达到0.5。然后，在37℃加入最终浓度为0.25mM的IPTG将培养物诱导1.5小时。收获细胞并再悬浮在10mM Tris(pH8.0)，在‑80℃储存供以后纯化。

    实施例5

    方法‑纯化粒酶B‑vegf121或粒酶B‑scFvMEL融合蛋白

    按这里的描述诱导并表达实施例4的融合构建物，以用于这里的多个实施例，至少包括实施例17和18。在4℃加入最终浓度为100μg/ml的溶菌酶并振荡30分钟然后进行超声以将重悬浮培养物裂解。提取物在10,800g离心30分钟，并将上清在40,000rpm再离心1小时。仅含可溶蛋白的上清调节到40mM Tris，pH8.0，10mM咪唑，并用于用相同缓冲液平衡的镍‑NTA琼脂糖。用500mM NaCl和20mM咪唑洗涤镍‑NTA琼脂糖后，用500mM NaCl和500mM咪唑洗脱结合的蛋白质。进行吸光度(280nm)和SDS‑PAGE分析以鉴定聚组胺标记的蛋白质，分别称为前粒酶B‑vegf121或前粒酶B‑scFvMEL。用20mM Tris‑HCl(pH8.0)和50mM NaCl透析洗脱的前粒酶B‑vegf121或前粒酶B‑scFvMEL。按照制造商的说明书(1单位rEK裂解50μg蛋白质，在室温下培育16小时)，加入重组牛肠激酶(rEK)活化粒酶B‑vegf121或粒酶B‑scFvMEL的前粒酶B(progranzyme B)部分以除去聚组胺标记。通过EK捕获琼脂糖除去rEK。用SDS‑PAGE分析最终的蛋白质并在4℃储存。

    实施例6

    方法‑SDS‑PAGE和蛋白质印迹分析

    以下方法用于实施例15描述的实验。还原条件下，在8.5％SDA‑PAGE上进行电泳分析蛋白质样品。凝胶用考马斯蓝染色。为进行蛋白质印迹分析，将蛋白质从凝胶转移入硝酸纤维素膜。用5％脱脂奶封闭此膜，并在室温下和小鼠抗‑粒酶B单克隆抗体(1.0μg/ml)或小鼠抗‑vegf121多克隆抗体(1∶2000稀释)或大鼠抗‑scFvzme多克隆抗体(1∶2000稀释)一起培育1小时。洗涤后，将膜与羊抗小鼠/辣根过氧化物酶结合物(HRP‑GAM，1∶5000稀释)或羊抗兔/辣根过氧化物酶结合物(HRP‑GAR，1∶5000稀释)一起培育。再次洗涤后，用Amersham(Piscataway，NJ)ECL检测系统显影膜并暴露于X‑光胶片。

    实施例7

    方法‑酶测定

    用连续比色测定法确定粒酶B的酶活性，以BAADT(N‑α‑叔‑丁氧羰基‑L‑丙氨酸‑L‑丙氨酸‑L‑天冬氨酰‑硫代苄酯)作为底物。在25℃下，在200μl酶中进行测定，酶含在100mM HEPES，pH7.5，10mM CaCl₂，1mM 5，5’‑二硫代二‑2‑硝基苯甲酸，0.2mM底物中。在Thermomax平板阅读器上测量OD₄₀₅处吸光度的变化。采用消光系数13,100cm^‑1M^‑1(这不同于Ellman报道的常规的412nm处13,600cm^‑1M^‑1的消光系数)将吸光度的增加转变成酶速度。

    实施例8

    方法‑检测粒酶B‑scFvMEL的scFvMEL部分

    基于ELISA法，用PIERCE(罗克福德，IL)的Reacti‑BindTM L蛋白涂布平板来检测粒酶B‑scFvMEL的scFvMEL部分。简言之，用5％BSA封闭预涂布的L蛋白，并分别用各种浓度的粒酶B‑scFvMEL或其它scFvMEL融合蛋白纯化反应物。洗涤后，将此蛋白质和兔抗‑scFvZME抗体一起培育，接着是HRP‑GAR，然后加入含1μg/ml30％H₂O₂的2，2’‑连氮基‑二‑3‑乙苯噻唑啉‑6‑磺酸(ABTS)溶液。30分钟后测量405nm处的吸光度。

    实施例9

    方法‑粒酶B‑vegf121抗PAE‑Flt‑1和PAE‑flk‑1以及粒酶B‑scFvMEL抗A375‑M的体外细胞毒性测定

    将Ham F‑12培养基(含10％FBS)中的PAE细胞或MEM培养基(含10％FBS)中的A375‑M细胞以每孔2.5×10³细胞的密度铺到96孔板中，然后在37℃，5％CO₂下使其贴壁24小时。24小时后，用含有不同浓度的粒酶B‑vegf121或粒酶B‑scFvMEL的培养基替换此培养基。72小时后，用结晶紫染色测定粒酶B‑vegf121或粒酶B‑scFvMEL对培养基中细胞生长的作用。加入100μl结晶紫(0.5％(w∶v)，溶于乙醇)染色存活的贴壁细胞。将染色物在平板上培育0.5小时，除去过量的染色物，并用水洗涤平板然后空气干燥。加入150μl Sornson缓冲液(0.1M柠檬酸钠，pH4.2)溶解剩余的染料。在微型ELISA阅读器上在630nM处阅读平板。

    实施例10

    胱冬酶原3或DFF45的体外转录和翻译以及粒酶B或Bax融合蛋白对胱冬酶原3或DFF45的体外裂解

    含有编码胱冬酶原‑3或DEF45的cDNA的表达质粒通过限制性内切酶消化线性化，并按照制造商的说明书，用体外兔网状细胞TNT试剂盒(Promega)产生³⁵S‑标记的胱冬酶原‑3或DFF45蛋白。简言之，含有编码胱冬酶原‑3或DEF45(1μg)的cDNA的线性质粒与TNT反应混合物在30℃一起培育90分钟，反应混合物中含有25μl兔网状蛋白裂解物、2μl TNT反应缓冲液、1μl T7 RNA聚合酶、1mM无半胱氨酸的氨基酸混合物、2μl[³⁵S]半胱氨酸或2μl[³⁵S]甲硫氨酸(10mCi/ml)和40U RNA酶抑制剂(Amersham Pharmacia生物技术有限公司)，总体积为50μl。为体外裂解，将翻译产物与含有粒酶B融合物或Bax融合蛋白的150mM NaCl一起培育。反应在30℃下进行，各个时间间隔的终体积为10μl。然后加入等体积的2×Laemmli缓冲液终止反应。然后通过15％SDS‑PAGE分离裂解产物，并检测干燥凝胶上的免疫印迹或感光成像。

    实施例11

    细胞凋亡测定

    细胞形态：

    使A375‑M或AAB527细胞(对粒酶B‑scFvMEL)和PAE‑flkl或PAE‑fltl细胞(对粒酶B‑vegf121)生长在合适的细胞培养基上。通过XTT测定监测细胞死亡。为可视监测粒酶B介导的或Bax介导的这些细胞的凋亡，将1×10⁴个细胞铺在12孔显微镜载玻片的各个孔中。48小时后，用PBS洗涤细胞一次，然后用25μl加有1μg/ml DTT和粒酶融合蛋白或Bax融合蛋白的无血清培养基处理。在37℃培育1小时后，除去上清并用50μl完全培养基替代。在37℃培育2小时后，用PBS温和洗涤细胞，并用丙酮∶甲醇(1∶1)在室温下固定2分钟。贴壁细胞的凋亡可通过相差显微镜观测。

    DNA片段化的测定：

    为监测DNA的片段化，将5×10⁵细胞培养在50μl加有1μg/ml DTT和粒酶B融合蛋白或Bax融合蛋白的无血清培养基中。在37℃培育1小时后，用PBS洗涤一次。用苯酚/氯仿提取测定法提取片段化的DNA。简言之，将细胞团再悬浮于25μlPBS，然后加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(1∶1∶0.1)。轻微振荡并离心(10,000×g，2分钟)后，回收片段化的DNA，在37℃用RNA酶A处理1小时，并在含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶上分析。

    FACS分析：

    将细胞(5×10⁵/10ml)在450×g离心6分钟，用冷的PBS洗涤并重悬于300μlPBS。用5ml甲醇固定细胞并于‑20℃放置至少1小时。然后细胞在800×g离心5分钟，重悬于100μl PBS并用PBS稀释至终体积为1ml。将细胞在冰中再培育30分钟，在800×g离心5分钟并重悬于0.5ml PBS。在细胞样品中加入10μl RNA酶(50μg/ml)和碘化丙锭(PI，5μg/ml)，然后用FACS分析DNA含量，所述DNA含量是细胞数的函数。

    用蛋白质印迹分析不同时间过程或剂量内用融合蛋白处理和未用融合蛋白处理的细胞样品中测得的胱冬酶‑3、PARP和DFF的裂解：

    为进行蛋白质印迹，样品用14％SDS‑PAGE电泳分离。将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜。膜用5％脱脂奶封闭，并在室温下和抗‑胱冬酶‑3或切割的胱冬酶‑3、或抗‑PARP或抗‑切割的DFF抗体(获得得自Cell Signaling Technology)培育1小时。洗涤后，将膜与羊抗兔或羊抗鼠/辣根过氧化物酶结合物一起培育。再次洗涤后，将膜置于Amersham ECL检测系统显影并暴露于X光胶片。

    实施例12

    信号转导途径‑非‑细胞凋亡测定

    在以下实施例中，描述了在用含有蛋白激酶B的传递载体处理的细胞中进行的实验以分析胰岛素信号转导途径，该途径是非细胞凋亡途径，它是导致调节糖原合成酶激酶‑3(GSK‑3)的胰岛素信号转导级联的临界点。在本发明中，将产生细胞因子‑人肝细胞生长因子(HCF)和信号转导调节物蛋白激酶B(PKB)的融合构建物。HCF组分与肝细胞结合并将活性PKB输送到细胞质。这样就可按下述方法测定胰岛素信号(GSK‑3)的下游调制剂的活化。

    抗‑GSK3抗体获得自Transduction实验室。磷酸酪氨酸抗体4G10和抗‑PKB抗体获得自Upstate Biotechnology。抗GSK3的Ser‑9的磷酸特异性抗体获得自Quality Controlled Biochemicals。

    用不同剂量的HCF或HCF/PKB融合构建物处理培养基中的肝细胞培养物。在加入药物后的不同时间收获细胞。为制备胞质组分，将细胞洗涤并收集在冰冷的磷酸缓冲盐水中。将细胞团重悬于冰冷的低渗缓冲液(25mM Tris，pH7.5，1mMEDTA，25mM NaF，1mM二硫苏糖醇)，其中含有完全完全蛋白酶抑制剂混合物(RocheMolecular Biochemicals；印第安纳波利斯，IN)。在冰中培育10分钟后将细胞裂解(用显微镜分析检验)。将裂解物在4℃以100,000×g超离心30分钟，收集上清。为进行免疫沉淀，用冰冷的磷酸缓冲盐水洗涤细胞两次，然后置于含有完全蛋白酶抑制剂混合物的IP缓冲液(125mM NaCl，25mM NaF，25mM Tris，pH7.5，1mM EDTA，1mM EGTA，1％Triton X‑100，10mM磷酸甘油，5mM磷酸钠，1mM NaVO₃，200nM冈田酸，1mM二硫苏糖醇)中裂解。加入抗‑GSK3抗体将裂解物在4℃下澄清1小时，然后加入Protein G珠(Sigma)再放置1小时。免疫沉淀物用IP缓冲液洗涤三次。

    为进行GSK3激酶测定，用含有活性蛋白激酶B融合构建物的传递载体处理细胞。GSK3免疫沉淀物先用激酶缓冲液(25mM Tris，pH7.5，10mM MgCl₂)洗涤一次。在含有100μM[γ‑³²P]ATP和100μM 2BSP肽作为底物(由加州大学生物医学资源中心，旧金山，CA合成)的激酶缓冲液中进行激酶反应。2BSP基于eIF2B中的GSK3靶位点。在30℃放置20分钟后，在磷酸纤维素P81纸(Whatman)上终止反应，用100mM磷酸洗涤四次，并在闪烁计数器上计数。

    实施例13

    克隆自HUT78的人粒酶B基因

    天然人粒酶B是由细胞毒T细胞和天然杀伤细胞产生的细胞毒淋巴细胞颗粒丝氨酸蛋白酶。从HL‑60细胞克隆人粒酶B基因的最初尝试没有成功，HL‑60细胞是来自人外周血的前髓细胞白血病细胞。然而，通过分离RNA并使用RT‑PCR，从人皮肤T细胞淋巴瘤Hut78细胞获得了作为成熟前粒酶B基因的靶cDNA。1％琼脂糖凝胶显示，人成熟前粒酶B cDNA约有800bp(图1)。基因序列和氨基酸序列(图2)显示，前20个氨基酸是信号序列。带有信号序列的人粒酶B序列被称为成熟前粒酶B。在细胞毒细胞中，活性粒酶B是由酶原通过二肽苷肽酶I(DPPI)介导的蛋白酶解产生的(smyth等，1995)。这除去了两个残基(Gly¹⁹Glu²⁰)前肽并使Ile²¹暴露以成为成熟的、N末端Ile‑Ile‑Gly‑Gly序列的粒酶B。

    实施例14

    构建粒酶B‑vegf121或粒酶B‑scFvMEL

    用PCR从Ile²¹扩增粒酶B的编码序列，Ile²¹是成熟酶的第一个残基，这样可有效删去信号序列和GlyGlu域。同时，在肠激酶(AspAspAspLys；SEQ ID NO：53)上游和靠近Ile²¹的地方插入一个切割位点。粒酶B通过柔性链(G4S)附着到重组Vegf121或scFvMEL。然后将融合的基因片段引入pET32a(+)的Xba I和Xho I位点以形成表达载体pET32GrB‑vegf121(图3A)和pET32GrB‑scFvMEL(图3B)。该载体含有供高水平表达的T7启动子、一个Trx.tag、一个His.tag、一个凝血酶切割位点和一个用来最后除去蛋白质纯化标记的肠激酶切割位点(图4A和4B)。一旦通过重组肠激酶除去蛋白质标记，成熟粒酶的第一个残基Ile就被暴露，粒酶B‑vegf121或粒酶B‑scFvMEL的粒酶B部分被活化。粒酶B‑vegf121(1059个碱基对，353个氨基酸)(图4C和4D)和粒酶B‑scFvMEL(1440个碱基对，480个氨基酸)(图4E和4F)的核苷酸序列和氨基酸序列被确定。

    实施例15

    粒酶B‑vegf121或粒酶B‑scFvMEL融合蛋白的表达和纯化

    重组蛋白粒酶B‑vegf121或粒酶B‑scFvMEL是作为聚组氨酸标记的蛋白质设计的前粒酶B‑vegf121或前粒酶B‑scFvMEL表达的，然后通过镍‑NTA金属亲和层析纯化。通过加入rEK切割组氨酸标记以形成粒酶B‑vegf121或粒酶B‑scFvMEL。一升培养物通常产生大约100μg最终纯化的粒酶B‑vegf121产物和150μg最终纯化的粒酶B‑scFvMEL产物。

    结果显示了与粒酶B有关的融合构建物的诱导表达。粒酶B‑vegf121在大约55kDa处和粒酶B‑scFvMEL在大约72kDa处的诱导带分别表示含有约18kDa纯化标记的粒酶B‑vegf121或粒酶B‑scFvMEL构建物。用重组肠激酶(rEK)酶消化标记会使粒酶B‑vegf121在约38kDa处和粒酶B‑scFvMEL在约53kDa处出现条带迁移，表示天然蛋白质。因此，SDS‑PAGE显示，最终纯化的粒酶B‑vegf121融合构建物在还原条件下迁移作为在所期望的38kDa分子量处的一个条(图5A)，而粒酶B‑scFvMEL融合构建物在所期待的53kDa分子量处的条带(图5B)。

    采用鼠抗‑粒酶B单克隆抗体、鼠抗‑vegf121多克隆抗体或兔抗‑scFvZEM多克隆抗体通过蛋白质印迹证实了切割的融合蛋白的特异性(图6)。结果显示，粒酶B‑vegf121融合构建物(图6A)可以特异性结合鼠抗‑vegf121抗体(图6A(a))或鼠抗‑粒酶B单隆抗体(图6A(b))。前粒酶B‑vegf121和粒酶B‑vegf121的分子量分别约为55kDa和38kDa。粒酶B‑scFvMEL融合构建物(图6B)可特异性结合鼠抗粒酶B单克隆抗体(图6B(c))或兔抗‑scFvMEL多克隆抗体(图6B(d))。前粒酶B‑scFvMEL和粒酶B‑scFvMEL的分子量分别约为70kDa和53kDa。

    实施例16

    粒酶B‑scFvMEL融合蛋白的scFvMEL部分的结合活性

    测试scFvMEL部分与L蛋白(L蛋白)的结合，L蛋白是来源于大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)的免疫球蛋白结合蛋白。L蛋白有通过λ轻链相互作用而不妨碍与抗体的抗原结合位点进行结合的独特能力。这赋予L蛋白独特的结合单链可变片段(scFv)的能力。结果显示了405nm处的吸收随浓度增加，这说明scFvMEL与L蛋白结合(图7)。粒酶B‑scFvMEL的结合活性与scFvMEL‑TNF相同，scFvMEL‑TNF可特异性结合抗原阳性人黑色素瘤细胞，且对这些黑色素瘤细胞有细胞毒活性。

    实施例17

    粒酶B‑vegf121的体外细胞毒效应

    测定了粒酶B‑vegf121对培养物中对数期PAE‑flk‑1(过度表达flk‑L/KDR受体)和PAE‑flk‑1(过度表达flk‑1受体)的细胞毒性，其中96孔板每个孔中有2.5×10³个细胞。在浓度约为10nM时观测到对PAE‑flk‑1细胞有50％生长抑制作用。然而，未观测到对PAE‑flt‑1细胞的细胞毒效应(图8)。还显示VEGF121可特异性结合VEGF受体flk‑1/KDR但不结合Flt‑1。粒酶B‑vegf121的细胞毒性证明该构建物可特异性杀死PAE‑flk‑1细胞，这说明融合物的Vegf121部分结合到Flk‑1过度表达细胞表面。然后，粒酶B被输送到靶细胞内部，导致对靶细胞的细胞毒性。

    实施例18

    粒酶B‑scFvMEL的体外细胞毒效应

    测试了粒酶B‑scFvMEL对对数期人黑色素瘤A375‑M细胞的细胞毒性。结果显示，粒酶B‑scFvMEL可杀死A375‑M细胞，IC₅₀浓度约为20nM。与未经scFvMEL‑3825预处理相比，当用浓度为178.5nM的scFvMEL‑3825预处理6小时，然后用粒酶B‑scFvMEL处理72小时，需要15倍高的粒酶B‑scFvMEL浓度以显示50％的细胞毒性(图9)。在特定的实施方案中，这是因为细胞表面抗原gp240已被scFvMEL‑3825占据，这使粒酶B‑scFvMEL的scFvMEL部分与gp240抗原结合的机会减少，从而抑制了粒酶B‑scFvMEL对这些细胞的细胞毒性。这一结果至少部分说明细胞毒性是由于抗体与其细胞表面区域的相互作用。

    实施例19

    克隆人Bax基因

    用Glass MAX RNA微量分离自旋筒系统(Gibco BRL)从Namalwa细胞中分离总的RNA。通过加入无RNA酶的DNA酶I同时在室温下培育15分钟来除去基因组DNA。然后加入EDTA溶液并在65℃加入15分钟使DNA酶I失活。SUPERSCRIPT第一链合成系统被用于RT‑PCR(Gibco BRL)。第一链合成采用寡(dT)，然后通过PCR，以NbaxTA(5’到3’)：GGTGATGGACGGGTCCGGGGAGCA(SEQ ID NO：29)和CBaxTA(5’到3’)：GGCCTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTGA(SEQ ID NO：30)作为引物扩增靶cDNA(BaxcDNA)，PCR循环如下：变性‑95℃5分钟，94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分钟，共循环30次；延伸‑72℃5分钟。在1％琼脂糖凝胶上跑电泳以检测PCR产物。将纯化的PCR片段克隆入PCR 2.1TA载体(Invitrogen；Carlsbad，CA)并称为gbTA。将BaxTA转化入INVαF感受态细胞，并通过蓝/白集落筛选或通过PCR方法筛选阳性克隆。阳性克隆的DNA用QIAprep Spin prep试剂盒(Qiagen；Valencia，CA)分离，并测序以确定正确的克隆中的人bax基因(BaxTA‑35(35号克隆)。

    实施例20

    构建Bax相关融合基因

    构建基于重叠PCR法。scFvMEL基因通过G4S链以不同的方向与Bax、截短的Baxl‑5(即含有外显子1‑5)或截短的Bax345(即含有外显子3、4和5)基因融合(分别称为scFvMEL‑bax或Bax‑scFvMEL、scFvMEL‑Baxl‑5或Baxl‑5‑scFvMEL和scFvMEL‑Bax345或Bax345‑scFvMEL)。如图10所示，熟练的技术人员知道人Bax基因(SEQ ID NO：45)，编码SEQ ID NO：46的多肽，包括六个外显子，BH1域(DGNFNWGRVVA；SEQ ID NO：47)位于外显子4，BH2(WIQDQGGWD；SEQ ID NO：48)位于外显子5，BH3(LKRIGDE；SEQ ID NO：49)位于外显子3。在一个特定的实施方案中，Bax嵌合多肽包括BH1、BH2和BH3域或它们的组合。在另一个特定的实施方案中，Bax嵌合多肽实质上由BH1、BH2和BH3域构成。在另一个特定的实施方案中，Bax嵌合多肽包括外显子3、4和5或它们的组合。在另一个特定的实施方案中，Bax嵌合多肽实质上由外显子3、4和5构成。

    简言之，scFvMEL编码序列是通过PCR从pET32a‑scFvMEL/TNF扩增的，并通过PCR从BaxTA‑35扩增出全长的bax或截短的Baxl‑5或截短的Bax345。设计了不同的引物，其中G4S接头序列被加到C末端或N末端以通过第二次PCR将融合基因连接在一起。为将融合基因在Nco I和Xho I位点克隆入pET32a(+)载体，在引物N末端加入Nco I位点和两个终止密码子并在C末端加入Xho I位点。第一次PCR过程如下：95℃5分钟；94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分钟，共循环30次；然后在72℃延伸5分钟。为构建scFvMEL‑bax，用以下引物扩增scFvMEL：NcoIzme(5’到3’)：GGTGGCGGTGGCTCCATGGCGGACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTC(SEQ ID NO：31)和Czme(5’到3’)：CGTCGGAGCCACCGCCACCGCTAGCTGAGGAGACGGTGAGAGT(SEQ ID NO：32)，Bax片段用以下引物扩增：Nbax2(5’到3’)：GGTGGGGTGGCTCCGACGGGTCCGGGGAGCAG(SEQ ID NO：33)和Cbax2(5’到3’)：GGAGCCACCGCCACCCTCGAGCTATCAGCCCATCTTCTTCCAGAT(SEQ ID NO：34)。对于Bax‑scFvMEL构建物的构建，引物是Nbax(5’到3’)：GGTGGCGGTGGCTCCATGGACGGGTCCGGGGAGCAG(SEQ IDNO：35)、Cbax2‑1(5’到3’)：GTCCTGGGAGCCACCGCCACCGCTAGCGCCCATCTTCTTCCA(SEQID NO：36)、Nzme2(5’到3’)：GGTGGCGGTGGCTCCACGGACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTC(SEQ ID NO：37)和Czme2(5’到3’)：GGAGCCACCGCCACCCTCGAGCTATCATGAGGAGACGGTGAGAGTGGT(SEQ ID NO：38)。对于scFvMEL‑Baxl‑5构建物的构建，引物是NcoIzme，Czme，Nbax2和CxhoIbax345(5’到3’)：GGAGCCACCGCCACCCTCGAGCTATCACCAACCACCCTGGTC(SEQ ID NO：39)。对于Baxl‑5‑scFvMEL融合构建物的构建，引物是Nbax，Cbax345(5’到3’)：GGAGCCACCGCCACCCCAACCACCCTGGTC(SEQ IDNO：40)、Nzme2和Czme2。对于scFvMEL‑Bax345融合构建物的构建，引物是NcoIzme，Primer3(5’到3’)：CCGGAGCCACCGCCACCGCTGCTGAGGAGACTGTGA(SEQ ID NO：41)、Nbax345(5’到3’)：GGTGGCGGTGGCTCCTTCATCCAGGATCGAG(SEQ ID NO：42)和CxhoIbax345。对于Bax345‑scFvMEL的构建，使用NcoIBax345(5’到3’)：GGTGGCCGGTGGCTCCATGGTCATCCAGGATCGAG(SEQ ID NO：43)、Cbax345、Nzme2和Czme2。

    然后，进行第二次PCR：94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分钟，循环30次，再在72℃延伸5分钟。扩增的片段通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，用PCR纯化试剂盒(Qiagen；Valencia，CA)纯化。纯化的PCR产物用Nco I和Xho I在37℃消化3小时，然后通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，用geneclean II试剂盒(Quantium生物技术有限公司，Carlsbad，CA)从凝胶纯化。将纯化的基因片段克隆入pET32a(+)载体，将连接混合物转化入DH5α感受态细胞，通过PCR筛选阳性克隆，然后测序。具有正确读框的序列被转化入AD494(DE3)pLysS感受态细胞以进一步诱导和表达。

    为表达全长Bax和Bax‑scFvMEL蛋白，将Bax和Bax‑scFvMEL序列亚克隆入pBAD/His A载体，分别称为pBAD/Hisbax和pBAD/Hisbax‑scFvMEL。简言之，用PCR法扩增全长Bax和Bax‑scFvMEL基因。为扩增全长Bax，以BaxTA‑35作为模板，引物为NBAXHIS(5’到3’)：AAACATGCCATGGCTCACCACCACCACCACCACGACGGGTCCGGGGAGCAGCCCAGA(SEQ ID NO：44)和Cbax。为扩增Bax‑scFvMEL，以pET32‑Bax‑scFvMEL(克隆2)作为模板，引物为NBAXHIS和Czme2。NBAXHIS引物按如下设计：NeoI位点供克隆，聚组胺(6×His)用于纯化和在N末端检测，然后引发ATG；在Cbax和Czme2引物的C末端加入两个终止密码子和一个Xho I位点。用Nco I和Xho I消化纯化的PCR片段并通过基因清除试剂盒纯化，然后连接入用于pBAD/His A载体消化的相同的限制性内切酶。将连接混合物转化入DH5α并通过PCR筛选阳性克隆，分离DNA并核对序列。将确定的序列阳性克隆转化入LMG194感受态细胞以供表达。

    实施例21

    在大肠杆菌中诱导和表达Bax相关融合蛋白

    用构建的质粒转化的细菌克隆在37℃在Luria肉汤(LB)生长培养基中以24rpm振荡培养过夜，培养基中含有200μg/ml氨苄青霉素、70μg/ml氯霉素和15μg/ml卡那霉素。然后以1∶100的比例将培养物稀释到加有抗生素的新鲜LB培养基并在37℃生长到A₆₀₀＝0.6，然后加入IPTG在37℃诱导2小时使最终浓度达到80μM。收获细胞，重悬于10mM Tris(pH8.0)并储藏于‑80℃供进一步纯化。

    实施例22

    诱导和表达全长的Bax和Bax‑scFvMEL

    用质粒pBAD/Hisbax和pBAD/Hisbax‑scFvMEL转化的细菌克隆在37℃在RM培养基中振荡(225rpm)培养过夜，培养基中含有葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素。然后以1∶100的比例将培养物稀释到含有葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的新鲜RM培养基并在37℃振荡生长至OD₆₀₀，然后加入5％阿拉伯糖在37℃诱导4小时。收获细胞，重悬于10mM Tris(pH8.0)并储藏于‑80℃供进一步纯化。

    实施例23

    纯化Bax相关融合蛋白

    加入最终浓度为100μg/ml的溶菌酶，在4℃翻转30分钟，然后超声使重悬物裂解。提取物在10,800g离心30分钟，然后将上清再在40,000rpm离心1小时。将仅含有可溶蛋白的上清调节到40mM Tris，pH8.0，10mM咪唑并加到用相同缓冲液平衡的镍‑NTA琼脂糖上。用500mM NaCl、20mM咪唑洗涤镍‑NTA琼脂糖后，结合的蛋白质用500mM NaCl、500mM咪唑洗脱。进行吸光度(280nm)和SDS‑PAGE分析以确定聚组胺标记的蛋白质。按照制造商的说明加入重组牛肠激酶(rEK)以除去聚组胺标记(l单位rEK裂解50μgD蛋白质，在室温下培育16小时)，从而获得最终的蛋白质。然后通过EK捕获琼脂糖除去rEK。用SDS‑PAGE分析最终的蛋白质并储存在4℃。

    实施例24

    SDS‑PAGE蛋白质印迹分析：

    在还原条件下在8.5％或12％SDS‑PAGE上通过电泳分析蛋白质样品。凝胶用考马斯蓝染色。为进行蛋白质印迹分析，将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜。该膜用5％脱脂奶封闭并与兔抗scFvzme抗体(1∶2000稀释)或兔抗bax抗体(1∶1000稀释)在室温下培育1小时或在4℃下培育过夜。洗涤后，将膜与羊抗兔/辣根过氧化物酶结合物(HRP‑GAR，1∶5000稀释)一起培育。再次洗涤后，用Amersham ECL检测系统显影膜并曝露于X‑光胶片。

    实施例25

    Bax相关融合蛋白的scFvMEL部分的检测：

    基于ELISA法，用PIERCE的Reacti‑Bind TM L蛋白涂布平板(罗克福德，IL)或含有贴壁人黑色素瘤A375‑M细胞的96‑孔板来检测Bax相关融合蛋白的scFvMEL部分。简言之，用5％BSA封闭预涂布的L蛋白，然后和各种浓度的scFvMEL bax相关融合蛋白反应。洗涤后，将其与兔抗scFvZME抗体一起培育，然后和HRP‑GAR(1∶5000稀释)在室温下培育1小时，然后加入含1μg/ml 30％H₂O₂的底物2，2’‑连氮基‑二‑3‑乙苯噻唑啉‑6‑磺酸(ABTS)溶液。30分钟后测量405nm处的吸光度。

    实施例26

    体外细胞毒性测定：

    将培养在含10％FBS的MEM培养基中的人黑色素瘤A375‑M细胞以每孔2.5×10³细胞的密度铺到96‑孔板中，然后在5％CO₂、37℃下使其贴壁生长24小时。24小时后，用含有不同浓度的不同scFvMEL‑bax相关融合蛋白的培养基替换此培养基。72小时后，用结晶紫染色或XTT确定那些融合蛋白对培养基中细胞生长的作用。在微型板ELISA阅读器上在540nm处阅读平板。

    实施例27

    Bax嵌合多肽的细胞毒性

    如图11所示，人bax基因是通过PCR从Namalwa细胞克隆的。1％琼脂糖凝胶电泳证明人Bax cDNA通过RT‑PCR由Namalwa细胞合成。

    图12A和12B说明了scFvMEL Bax相关融合蛋白的构建。Bax基因包括六个外显子，该基因产生了另路转录物，其主要形式编码1.0kb mRNA和称为Bax α的转录物21kDa蛋白质。方框表明通过数字鉴别的外显子。外显子6是跨膜域。scFvMEL基因在两个不同的方向通过G4S链与Bax、截短的Baxl‑5或Bax345融合，称为scFvMEL‑bax、Bax‑scFvMEL、scFvMEL‑baxl‑5、Baxl‑5‑scFvMEL、scFvMEL‑bax345和Bax345‑scFvMEL。融合基因被克隆入pET32a(+)表达载体的Nco I和XhoI位点。然后含有融合基因的质粒被转化入AD494(DE3)pLysS大肠杆菌以进行表达。

    图13说明scFvMEL Bax相关融合蛋白在pET32a(+)载体中表达的蛋白质印迹分析。截短的bax相关蛋白质的SDS‑PAGE考马斯蓝染色发生在还原条件下。结果显示了scFvMEL和截短的bax融合蛋白在pET32a(+)表达载体中的诱导表达。诱导的条带分别在scFvMEL‑bax345和Bax345‑scFvMEL约62kDa处，在scFvMEL‑Baxl‑5和Baxl‑5‑scFvMEL约65kDa处，它还含有一个约20kDa的纯化标记。

    图14显示了转化入AD494(DE3)pLysS大肠杆菌并经IPTG诱导的pET32‑scFvMEL‑bax和pET32‑Bax‑scFvMEL的表达。由于高度疏水域‑外显子6的作用，全长bax融合蛋白对细菌的毒性很大。含有质粒pET32‑scFvMEL‑Bax或pET32‑Bax‑SCFV的细菌在LB培养基中生长至OD₆₀₀＝0.6，培养基中含有200μg/ml氨苄青霉素、70μg/ml氯霉素和15μg/ml卡那霉素，加入最终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，随着D600值降低细菌死亡。

    图15证明了全长bax和Bax‑scFvMEL在pBAD/HisA载体转化的LMG194大肠杆菌中的表达。将全长bax基因和Bax‑scFvMEL基因克隆入pBAD/His A载体的NcoI和Xho I位点。起始密码子ATG之后是聚组胺(6his)标记。含有Bax或Bax‑scFvMEL的质粒被转化入LMG194细胞以进行表达，在不同的细菌生长培养基(含有葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的RM，含有100μg/ml氨苄青霉素的RM和含有100μg/ml氨苄青霉素的LB)中测定Bax和Bax‑scFvMEL蛋白的表达。将LMG194转化的pBAD/HisLacZ作为阳性对照，约120kDa处的表达条带代表LacZ蛋白，它可通过抗bax抗体检测。LMG194转化的pBAD/HisA(空载体)作为阴性对照。用兔抗‑Bax单克隆抗体(1∶1000稀释)作为第一抗体，HRP‑羊‑抗‑兔IgG作为第二抗体进行蛋白质印迹。结果显示约21kDa处的条带代表带有6X His‑tag的Bax，约49kDa处的条带代表带有6X His‑tag的Bax‑scFvMEL。

    在图16A和16B中证实了融合蛋白的scFvMEL部分的结合活性。A375‑M细胞是gp240抗原‑阳性人黑色素瘤细胞系。L蛋白有结合SCFV的独特能力。融合蛋白Bax345‑scFvMEL可结合用抗‑scFvMEL抗体检测的A375‑M(图16A)或L蛋白(图16B)。这种结合活性与其它融合蛋白scFvMEL‑TNF相同。

    图17证实了scFvMEL‑bax345与Bax345‑scFvMEL比较对A375‑M的细胞毒性。评估了scFvMEL‑bax345和Bax345‑scFvMEL抗对数期人抗原阳性黑色素瘤A375‑M细胞的细胞毒效应。A375‑M细胞置于96‑孔板中(每孔2.5×10³细胞)。scFvMEL‑bax345和Bax345‑scFvMEL的IC₅₀浓度分别约为3nM和10nM。

    实施例28

    粒酶B‑vegf121在各种细胞系上的ELISAa(用小鼠抗‑vegf121抗体检测)

    结合活性的ELISA分析用含有贴壁PAE/Flk‑1、PAE/Flt‑1、A375‑M或SKBR3‑HP细胞的96‑孔板进行，平板用5％BSA封闭然后与各种浓度的纯化的粒酶B‑vegf121反应。洗涤后，将它们与鼠抗Vegf抗体一起培育，然后是HRP‑标记的羊抗鼠IgG。然后加入含1μg/ml 30％H₂O₂的底物2，2’‑连氮基‑二‑3‑乙苯噻唑啉‑6‑磺酸(ABTS)溶液。30分钟后测量405nm处的吸光度

    Vegf121可特异性结合血管内皮细胞上的flk‑1/KDR受体(图18)。该试验显示，融合蛋白粒酶B‑vegf121特异性结合过度表达flk‑1受体的PAE/Flk‑1细胞，但对PAE/Flk‑1(过度表达的flk‑1受体)或人黑色素瘤A375‑M细胞和人乳腺癌SKBR3‑HP细胞没有结合活性。即GrB/VEGF121可特异性结合过度表达flk‑1/KDR受体的PAE/Flk‑1细胞，受体可用Vegf121抗体或GrB抗体检测。

    实施例29

    粒酶B/Vegf121对转染的内皮细胞的细胞毒性

    粒酶B‑vegf121对PAE/flk‑1和PAE/flt‑1细胞的细胞毒性通过培养物中抗对数期PAE/Flk‑1(用flk‑L/KDR受体转染)和PAE/Flt‑1(用flk‑1受体转染)而评估。简言之，以每孔2.5×10³细胞的密度将PAE细胞铺到96‑孔板中。24小时后，用含有不同浓度粒酶B‑vegf121的培养基处理细胞。72小时后用XTT确定对细胞生长的作用。在微型板ELISA阅读器上在540nm处阅读平板。

    结果显示在浓度约为10nM时对PAE/flk‑1细胞有50％的生长抑制效果(I.C.₅₀)(图19)。然而，未观察到对PAE/Flt‑1细胞有细胞毒效应。粒酶B‑vegf121对PAE/Flk‑1细胞的细胞毒性说明，融合物的Vegf121部分特异性结合细胞表面上过度表达的flk‑1，然后将粒酶B运送到靶细胞内部并对靶细胞产生细胞毒性。

    实施例30

    粒酶B‑vegf121和Vegf121‑rgel在体外对PAE/flk‑1的细胞毒性测定

    将含有10％FBS的Ham F‑12培养基中的PAE细胞以每孔2.5×10³细胞的密度铺到96‑孔板中，然后在5％CO₂、37℃下使其贴壁生长24小时。24小时后，用含有不同浓度粒酶B‑vegf121或Vegf121‑rGel的培养基替换此培养基。72小时后，用XTT确定粒酶B‑vegf121或Vegf121‑rGel对培养基中细胞生长的作用。在微型板ELISA阅读器上在540nm处阅读平板。

    结果显示Vegf121‑rGel的I.C.₅₀约为1nM(图20)。粒酶B‑vegf121的I.C.₅₀是Vegf121‑rGel的10倍高。

    实施例31

    用粒酶B‑vegf121处理的PAE细胞的胱冬酶活性

    用30μg全细胞裂解产物进行胱冬酶活性的蛋白质印迹分析。SDS‑PAGE后，将蛋白质通过电泳转移到硝酸纤维素膜。用含有5％脱脂奶的磷酸缓冲盐水和0.5％Tween 20(PBST)封闭该膜，然后分别暴露于胱冬酶‑8、胱冬酶‑3、胱冬酶‑6、胱冬酶‑7、切割的胱冬酶‑3、PARP或切割的DFF45抗体。用PBST洗涤此膜并用与辣根过氧化物酶结合的第二抗体处理。采用Amersham ECL展开剂通过增强化学发光(ECL)测定并曝露于胶片可见抗原‑抗体反应。

    结果显示，用粒酶B‑vegf121处理4小时后，在PAE/Flk‑1细胞上观察到切割胱冬酶‑8、切割的胱冬酶‑3、切割的PARP和切割的DFF45，但在PAE‑flt‑1细胞上未观察到(图21)。然而，胱冬酶‑6或胱冬酶‑7未被粒酶B‑vegf121切割，这说明粒酶B‑vegf121仅参与胱冬酶‑8、胱冬酶‑3细胞凋亡途径活化胱冬酶。

    实施例32

    原位细胞死亡检测(TUNEL)

    细胞凋亡时基因组DNA的裂解可产生双链低分子量DNA片段，并在高分子量DNA中产生单链断裂(切口)。那些DNA链断裂可在酶反应中用修饰的核苷酸标记游离3’‑OH末端加以鉴定。此方法采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)来标记DNA链的断裂，该酶催化核苷酸与游离的3’‑OH DNA末端以不依赖模板的方式进行聚合。用和碱性磷酸酶(AP)结合的羊抗荧光素抗体Fab片段检测掺入的荧光素。底物反应后，可在光学显微镜下分析染色的细胞。

    为处理细胞，将细胞铺到16孔腔式载玻片上，每孔2500个细胞，在37℃/5％CO₂的条件下温育过夜。用I.C.₅₀浓度的融合蛋白GrB‑scFvMEL或GrB‑vegf121将细胞处理不同的时间(24、48小时等)，并用PBS短暂洗涤。

    为进行TUNEL测定，在室温下用3.7％甲醛固定细胞20分钟，用PBS冲洗后用0.1％Triton X‑100、0.1％柠檬酸钠在冰上渗透2分钟，然后用PBS洗涤两次。将细胞与TUNEL反应混合物在37℃温育60分钟，然后和Converter‑AP在37℃温育30分钟，最后和Fast Red基质溶液在室温下反应10分钟。最后洗涤步骤后，将载玻片封固在封固剂中并在光学显微镜下分析。

    每个试验步骤中都包括阳性对照。将固定和渗透的细胞与1mg/ml的DNA酶I在37℃温育10分钟以诱导DNA链断裂。

    通过原位细胞死亡检测(TUNEL)测定GrB‑scFvMEL对A375‑M和SKBR3‑HP细胞的作用。在48小时时对用GrB‑scFvMEL处理的抗原阳性人黑色素瘤A375‑M细胞观测到TUNEL阳性结果，但对用GrB‑scFvMEL处理的抗原阴性人乳腺癌SKBR‑3‑HP细胞未观察到阳性结果。这说明GrB‑scFvMEL可特异性靶向抗原阳性黑色素瘤细胞并诱导细胞凋亡。

    通过TUNEL测定确定了GrB‑vegf121对PAE/Flk‑1和PAE/Flt‑1细胞的作用。VEGFR2/KDR在PAE/Flk‑1细胞表面上过度表达，但不在PAE/Flt‑1细胞表面上过度表达。Vegf121特异性靶向VEGFR2/KDR，将GrB输送入PAE/Flk‑1细胞。在24小时和48小时时对用GrB‑vegf121处理的PAE/Flk‑1观测到TUNNEL测定阳性结果，但对GrB‑vegf121处理的PAE/Flt‑1未观察到阳性结果。GrB‑vegf121诱导PAE/Flk‑1细胞凋亡。

    实施例33

    通过免疫荧光显微镜术使GrB/VEGF121内化入PAE细胞

    该实施例涉及通过免疫荧光显微镜术进行GrB/VEGF121的内化分析。按如下方法处理细胞。将细胞铺在16孔腔式载玻片(Nunc)中，每孔1×10⁴个细胞，在37℃/5％CO₂的条件下温育过夜。用200nM的GrB/VEGF121处理细胞4小时并用PBS短暂冲洗。和甘氨酸缓冲液(500mM NaCl，0.1M甘氨酸，pH2.5)一起培育10分钟，用0.5M Tris，pH7.4中和2分钟并用PBS短暂冲洗，从而将细胞表面剥离。

    按如下进行免疫荧光染色。室温下将细胞在3.7％甲醛中固定15分钟，接着用PBS短暂冲洗，然后在含有0.2％Triton X‑100的PBS中渗透10分钟。然后用PBS洗涤三次。样品在室温下用3％BSA培育1小时以封闭非特异性结合位点，然后在室温下和鼠抗粒酶B抗体(1∶100稀释)培育1小时，接着用PBS洗涤三次。将样品在室温下与异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的鼠抗IgG(Sigma)(1∶100稀释)培育1小时，并用PBS洗涤三次。小心除去壁和垫圈。空气干燥后，将载玻片封固并用荧光显微镜分析。

    结果显示，处理4小时后，GrB/VEGF₁₂₁的GrB部分被传递到PAE/Flk‑1的胞质溶胶中，但未被传递到PAE/Flt‑1细胞的胞质溶胶中。

    实施例34

    通过TUNEL测定检测GrB/VEGF121诱导PAE/Flk‑1细胞的细胞凋亡

    细胞凋亡时基因组DNA的裂解可产生双链低分子量DNA片段并在高分子量DNA中产生单链断裂(切口)。那些DNA链断裂可在酶反应中用修饰的核苷酸标记游离3’‑OH末端加以鉴定。此方法采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)来标记DNA链的断裂，该酶催化核苷酸与游离的3’‑OH DNA末端以不依赖模板的方式进行聚合。用和碱性磷酸酶(AP)结合的羊抗荧光素抗体Fab片段检测掺入的荧光素。底物反应后，可在光学显微镜下分析染色的细胞。

    细胞处理如下。将细胞铺到16孔腔式载玻片上，每孔2500个细胞，在37℃/5％CO₂的条件下温育过夜。用I.C.₅₀浓度的融合蛋白GrB‑scFvMEL或GrB‑vegf121将细胞处理不同的时间(24、48小时等)，并用PBS短暂洗涤。

    TUNEL测定如下。在室温下用3.7％的甲醛固定细胞20分钟，接着用PBS冲洗，用0.1％Triton X‑100、0.1％柠檬酸钠在冰上渗透2分钟，然后用PBS洗涤两次。将细胞与TUNEL反应混合物在37℃温育60分钟，然后和Converter‑AP在37℃温育30分钟，最后和Fast Red基质溶液在室温下反应10分钟。最后洗涤步骤后，将载玻片封固在封固剂中并在光学显微镜下分析。

    结果说明，VEGFR2/KDR在PAE/Flk‑1细胞表面上过度表达，但不在PAE/Flt‑1细胞表面上过度表达。VEGF121特异性靶向VEGFR2/KDR，将GrB输送入PAE/Flk‑1细胞。在24小时和48小时时对用GrB/VEGF₁₂₁处理的PAE/Flk‑1观测到TUNNEL测定阳性结果，但对GrB/VEGF121处理的PAE/Flt‑1未观察到阳性结果。因此，GrB/VEGF121诱导PAE/Flk‑1细胞凋亡。

    实施例35

    用GrB/VEGF121处理的PAE细胞释放细胞色素C

    细胞色素c在细胞凋亡中扮演重要角色。这种蛋白质位于线粒体膜内膜和外膜之间。细胞凋亡刺激引起细胞色素c从线粒体释放到胞质溶胶，并在胞质溶胶中与Apaf‑1结合。细胞色素c/Apaf‑1复合物活化胱冬酶‑9，胱冬酶‑9然后活化胱冬酶‑3和其它下游胱冬酶。

    细胞色素c释放细胞凋亡测定的材料和方法：(来自Oncogene ResearchProducts；圣迭戈，CA)如下。用浓度为0.1nM和20nM的GrB/VEGF121处理PAE/Flk‑1细胞和PAE/Flt‑1细胞(5×10⁷)24小时。收集细胞。用10ml冰冷的PBS洗涤细胞后，用0.5ml含有DTT和蛋白酶抑制剂的1×胞质溶胶提取缓冲混合液重悬细胞，并在冰上培育10分钟。用冰冷的玻璃匀浆器匀浆细胞。将匀浆转移到1.5ml的微量离心管中并于4℃、700μg离心10分钟。将上清转移到新鲜的1.5ml管中并于4℃、10,000×g离心30分钟。收集上清作为胞质溶胶组分。将细胞团重悬于含有DTT和蛋白酶抑制剂的0.1ml线粒体提取缓冲混合液，振荡10秒钟并作为线粒体组分保存。用Bio‑Rad实验室有限公司(Hercules，CA)的Bradford蛋白质测定法确定蛋白质浓度。将从未经处理和经处理的细胞中分离得到的各10μg胞质组分和线粒体组分置于15％SDS‑PAGE，然后进行标准蛋白质印迹过程，并用细胞色素c抗体(1μg/ml)进行探测。

    为测定细胞色素c释放细胞凋亡，用不同浓度的GrB/VEGF121处理PAE细胞24小时。从胞质溶胶中分离高度富含线粒体组分。采用细胞色素c抗体，通过蛋白质印迹确定细胞色素c在细胞凋亡时从线粒体转运入胞质溶胶。图22显示，GrB/VEGF121处理后，细胞色素c在PAE/Flk‑1细胞上释放，但不在PAE/Flt‑1细胞上释放。

    实施例36

    GrB/VEGF121处理后PAE细胞的Bax转运

    Bax，一种21kDa的蛋白质，与Bcl‑2有广泛的氨基酸同源性，被不同的细胞可变地表达。Bax作为一种Bcl‑2家族的促凋亡成员显示一些和成孔蛋白的结构类似性。因此，Bax被认为可穿过线粒体外膜形成跨膜孔，这导致膜电位的丧失。在接受细胞凋亡刺激时Bax的定位从胞质溶胶转到线粒体。

    用Oncogene Research Products试剂盒(产品编号QIA87；圣迭戈，CA)分离胞质溶胶组分与线粒体组分。用Bio‑Rad实验室有限公司(Hercules，CA)的Bradford蛋白质测定法确定蛋白质浓度。将从未经处理和经处理的细胞中分离得到的各10μg胞质组分和线粒体组分，置于12％SDS‑PAGE，然后进行标准蛋白质印迹过程，并用Bax抗体(Santa Cruz生物技术有限公司；Santa Cruz，CA；1∶200稀释)进行探测。

    GrB/VEGF121处理24小时后，用蛋白质印迹分析PAE细胞上的Bax表达。结果显示，用浓度为20nM(I.C.₅₀)的GrB/VEGF121处理后，在PAE/Flk‑1细胞中Bax的定位从胞质溶胶转到线粒体，但在PAE/Flt‑1细胞中不是如此。图23显示，用浓度为20nM的GrB/VEGF121处理24小时后，PAE/Flk‑1细胞中Bax在线粒体中增加而在胞质溶胶中减少，这说明在细胞凋亡时Bax从胞质溶胶转到线粒体。

    实施例37

    通过免疫荧光显微镜术使GrB/scFvMEL内化入A375‑M细胞

    该实施例涉及通过免疫荧光显微镜术进行的GrB/scFvMEL的内化分析。按如下方法处理细胞。将细胞铺在16孔腔式载玻片(Nunc)中，每孔1×10⁴个细胞，在37℃/5％CO₂的条件下温育过夜。用200nM的GrB/scFvMEL处理细胞4小时并用PBS短暂冲洗。和甘氨酸缓冲液(500mM NaCl，0.1M甘氨酸，pH2.5)一起培养10分钟，用0.5M Tris，pH7.4中和2分钟并用PBS短暂冲洗，从而将细胞表面剥离。

    按如下进行免疫荧光染色。室温下将细胞在3.7％甲醛中固定15分钟，接着用PBS短暂冲洗，然后在含有0.2％Triton X‑100的PBS中渗透10分钟。然后用PBS洗涤细胞三次。样品在室温下用3％BSA培育1小时以封闭非特异性结合位点，然后在室温下和鼠抗粒酶B抗体(1∶100稀释)培育1小时，接着用PBS洗涤三次。样品在室温下与异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的鼠抗IgG(Sigma)(1∶100稀释)培育1小时并用PBS洗涤三次。小心除去壁和垫圈。空气干燥后，将载玻片封固并用光学显微镜和荧光显微镜分析。

    结果显示，GrB/scFvMEL的GrB部分通过scFvMEL与gp240抗原结合被运送入gp240抗原‑阳性A375‑M细胞。

    实施例38

    通过TUNEL测定检测A375‑M细胞上GrB/scFvMEL诱导的细胞凋亡

    用I.C.₅₀浓度的GrB/scFvMEL将细胞(每孔3000个细胞)处理不同时间(16小时，24小时)并用PBS短暂洗涤。用3.7％的甲醛将细胞在室温下固定20分钟，然后用PBS冲洗并用0.1％Triton X‑100、0.1％柠檬酸钠在冰上渗透2分钟。然后用PBS洗涤两次。将细胞与TUNEL反应混合物在37℃温育60分钟。最后洗涤步骤后，将载玻片封固在封固剂中并在光学显微镜下分析。

    结果证实，处理16和24小时后，GrB/scFvMEL诱导抗原‑阳性A375‑M细胞的细胞凋亡，但不诱导抗原‑阴性SKBR3‑HP细胞的细胞凋亡。

    实施例39

    用GrB/scFvMEL处理的A375‑M和SKBR3‑HP细胞中细胞色素c的释放

    按所述进行细胞色素c释放细胞凋亡测定(Oncogene Research Products；圣迭戈，CA目录号IA87)。材料和方法如下。用浓度为5nM和50nM的GrB/scFvMEL处理人黑色素瘤A375‑M细胞和人乳腺癌SKBR3‑HP细胞(5×10⁷)24小时。收集细胞。用10ml冰冷的PBS洗涤细胞后，用0.5ml含有DTT和蛋白酶抑制剂的1×胞质溶胶提取缓冲混合液重悬细胞，并在冰上培育10分钟。用冰冷的玻璃匀浆器匀浆细胞。将匀浆转移到1.5ml的微量离心管中并于4℃在700×g离心10分钟。将上清转移到新鲜的1.5ml试管中并于4℃、10,000×g离心30分钟。收集上清作为胞质溶胶组分。将细胞团重悬于含有DTT和蛋白酶抑制剂的0.1ml线粒体提取缓冲混合液，振荡10秒钟并作为线粒体组分保存。用Bio‑Rad实验室有限公司(Hercules，CA)的Bradford蛋白质测定法确定蛋白质浓度。将从未经处理和经处理的细胞中分离得到的各10μg胞质组分和线粒体组分置于15％SDS‑PAGE，然后进行标准蛋白质印迹过程，并用细胞色素c抗体(1μg/ml)进行探测。

    细胞色素c释放细胞凋亡测定：用不同浓度的GrB/scFvMEL处理A375‑M和SKBR3‑HP细胞24小时。从胞质溶胶中分离线粒体组分，然后采用细胞色素c抗体，通过蛋白质印迹确定细胞色素c在细胞凋亡时从线粒体迁移入胞质溶胶。图24显示，经GrB/scFvMEL处理后，细胞色素c在A375‑M细胞上释放，但不在SKBR3‑HP细胞上释放。

    实施例40

    GrB/VEGF₁₂₁在PAE/Flk‑1细胞上诱导DNA成梯

    然后进行DNA成梯测定以分析GrB/VEGF121对PAE/FLK‑1细胞的影响。

    用I.C.₅₀浓度的GrB/VEGF121处理PAE细胞(2×10⁶)24小时。用PBS短暂洗涤细胞，然后通过胰蛋白酶消化收获细胞，接着在200×g离心5分钟。将细胞重悬于1ml PBS，转移到10ml冰冷的70％乙醇，并在‑20℃储存24小时或更长时间。固定的细胞在800×g离心5分钟，彻底除去乙醇。将细胞团重悬于40μl磷酸‑柠檬酸缓冲液(PCB)，其中含有192份0.2M的Na₂HPO₄和8份0.1M的柠檬酸(pH7.8)，并在室温下培育至少30分钟。将细胞在1000×g旋转5分钟后，将上清转移到新的管中。在样品中加入3μl 0.25％Nonide NP‑40和3μlRNA酶(1mg/ml)并在37℃温育30分钟，然后加入3μl蛋白酶K(1mg/ml)并在37℃再温育30分钟。在1.5％琼脂糖凝胶上跑电泳并在UV光下用溴化乙锭检测DNA。

    图25显示，GrB/VEGF121在PAE/Flk‑1细胞上诱导DNA成梯，但在PAE/Flt‑1细胞上不诱导DNA成梯。

    实施例41

    通过GRB小鼠单抗检测的GrB/scFvMEL对gp240抗原‑阳性A375‑M和gp240抗原‑阴性T‑24细胞的ELISA

    通过ELISA分析GrB/scFvMEL对gp240抗原‑阳性人黑色素瘤A375‑M和gp240抗原‑阴性人膀胱癌T‑24细胞的结合活性。

    用5％BSA封闭用每孔50,000细胞的A375‑M或T‑24细胞涂布的96‑孔板，然后在室温下使细胞与各种浓度的GrB/scFvMEL反应1小时。洗涤后，样品与GrB鼠单克隆抗体(1μg/ml)在室温下培育1小时，接着是HRP‑羊抗鼠IgG。然后加入含1μg/ml 30％H₂O₂的底物2，2’‑连氮基‑二‑3‑乙苯噻唑啉‑6‑磺酸(ABTS)溶液。30分钟后测量405nm处的吸光度。

    图26显示，GrB/scFvMEL可特异性结合抗原‑阳性A375‑M细胞，但不结合抗原‑阴性T‑24细胞，这证明融合GrB/scFvMEL的scFvMEL部分的结合活性。

    参考资料

    以下参考资料在此特别地纳入以供参考，它们提供的实例过程或其它细节对本文所列内容作了补充。

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    根据本发明的揭示不必过度实验，这里揭示和权利要求的所有方法和组合物都可以制得。尽管已经通过优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法，但精通此领域的技术人员显然知道，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对这里所描述的方法和步骤或步骤的顺序进行修改。更具体地，只要能达到相同或类似的结果，这里所述的试剂显然可被一些与化学和生理有关的试剂替代。所有这种类似的替代和修饰都是精通此领域的技术人员熟知的，并被认为是在附加的权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念之内。