水稻DREB类转录因子及其编码基因与应用 【技术领域】
本发明涉及水稻DREB类转录因子及其编码基因与应用，特别是涉及水稻DREB类耐寒和耐旱转录因子及其编码基因与应用。
背景技术
植物在生长过程中会受到诸多环境因素的影响，冷害和干旱会导致农作物的大规模减产。培育耐逆性的作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。生物体能感受细胞外环境条件的变化并通过多种途径将其传递到细胞内，从而对外界的变化做出相应的反应。转录因子作为一种调控基因，当生物体感受逆境胁迫时，能调控一系列下游基因的表达，从而增强生物体对逆境的耐受力，达到抵抗不良环境条件胁迫地效果。在植物中，AP2/EREBP家族中的DREB类转录因子能够接受环境胁迫信号并且启动逆境应答基因的表达。
水稻(Oryza Sativa)是最重要的粮食作物之一，培育耐寒，耐旱的品种对提高水稻产量具有重要意义。
【发明内容】
本发明的目的是提供具有较强抗逆特性的DREB类转录因子及其编码基因，该转录因子在植物抗寒和抗旱反应中具有调控作用。
本发明所提供的抗逆转录因子来源于水稻，名称为OsDREB，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
序列表中序列2氨基酸残基序列是由281个氨基酸残基组成的蛋白质，其保守的AP2/EREBP结构域序列为自氮端到碳端第82-138位氨基酸残基。
抗逆转录因子OsDREB的编码基因，是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中序列1的DNA序列；
2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1169个碱基组成，该基因的读码框为自3’端第91到第936位碱基，其表达主要受低温和干旱的诱导。
本发明所提供的类转录因子OsDREB具有与DRE顺式作用元件结合的能力，并能激活下游基因的表达。其编码基因都含有保守的AP2/EREBP结构域序列。
用本发明所提供的编码转录因子OsDREB的基因，使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体(这些植物表达载体包括双元农杆菌载体以及用于单子叶植物微弹轰击的载体)转化植株，可获得对低温和干旱胁迫耐受力得到增强的转基因植株。载体还可包括3’非翻译区域，包含聚腺苷酸信号和任何其它的可效应mRNA加工或基因表达的DNA片段。聚腺苷酸信号引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。3’区域的例子有农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’转录的非翻译区等。本发明的OsDREB基因的3’非翻译区域可被用于在植物中表达。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种强启动子或诱导型启动子。这些启动子很多，如花椰菜花叶病毒(CAMV 35S)和Ubiqutin启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可以是天然或合成等多种不同来源的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，包括加入植物可选择性标记。使用的选择性标记可以是编码对抗生素抗性酶的基因，抗生素包括庆大霉素、潮霉素、卡那霉素等。也可以是产生颜色变化的酶或发光化合物的基因，如GUS、荧光酶，还可以是抗化学试剂(例如除莠剂)的基因。当然，也可以不用任何筛选标记。
携带有本发明OsDREB基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，Now York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，Plant Molecular Biology(2nd Edition)。
可使用包括本发明的OsDREB基因的植物表达载体转化植物宿主(既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等)，培育抗寒和抗旱的植物品种。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
【附图说明】
图1为OsDREB基因转化酵母双报道子细胞后，在0mM 3-AT SD/-His-Ura-Trp平板和30mM 3-AT SD/-His-Ura-Trp平板上的生长情况。
图2为OsDREB基因转化酵母双报道子细胞后，B-半乳糖苷酶活力的测定来检测LacZ报道基因的表达强度的情况。
图3为Southern杂交分析OsDREB基因在水稻基因组中组成的结果。
图4为OsDREB基因在低温、干旱诱导条件下表达状态的RT-PCR检测结果。
【具体实施方式】
实施例1、水稻cDNA文库的构建
水稻(Oryza Sativa)品种旱稻502植株栽培在1/2MS固体培养基上，置于光照培养箱中(28℃，12小时光照，12小时黑暗)培养10-14天，取全株于液氮中速冻、研磨，悬于TRIzole(Gibco)中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入异丙醇沉淀总RNA，溶于水中。经mRNA纯化试剂盒处理得到mRNA。取1ug mRNA进行逆转录反应，然后再合成第二链。双链cDNA与EcoRI-NotI-BamHI接头连接后磷酸化，经制备离心柱(Sephacryl-400)去除多余的接头，然后与pAD-GAL4载体连接(具体步骤详见Stratagene HybriZAP-1.1 XR Library Construction Kit)。
实施例2、含有DRE顺式作用元件的酵母双报道子细胞的获得
将从rd29A启动子区分离的由75bp组成的DRE顺式作用元件通过HindIII酶切位点将其串联成4个重复，获得含有4个串联重复的DRE元件的DNA片段。将所得到的DNA片段插入pHISi-1载体的PminHIS3启动子的上游，并获得能在缺乏组氨酸的SD培养基上正常生长的酵母转化体。同时将这个DNA片段构建到pLacZi载体的PCYC1启动子的上游，然后将载体转化到含有pHISi-1载体的酵母转化体中。这样，在同时缺乏组氨酸和尿嘧啶的培养基上，选择获得含有pHISi-1和pLacZi载体的酵母转化体。以同样的方法获得含有突变型DRE顺式作用元件的酵母双报导子细胞。HIS和LacZ基因作为2个报告基因，当其上游的DRE元件被DREB转录因子识别后，其表达强度会显著增强。通过3-AT(组氨酸合成酶竞争性抑制剂)来检测HIS基因的表达强度，同时通过B-半乳糖苷酶活力的测定来检测LacZ基因的表达强度。图1显示了本发明编码DREB类转录因子OsDREB转化酵母双报导子细胞后在含3-AT的SD/-His-Ura-Trp平板上的生长情况。其中A表示yepGAP空载体转化wDRE酵母双报道子；B表示yepGAP空载体转化mDRE酵母双报道子；C表示OsDREB基因转化wDRE酵母双报道子；D表示OsDREB基因转化mDRE酵母双报道子。图2是半乳糖苷酶活力检测的结果。从图中可以看出，当上游为wDRE元件时，酵母转化体半乳糖苷酶活力明显增强；若其上游为mDRE顺式作用元件，则其表达将无法得到增强。
实施例3、水稻cDNA文库的筛选和编码转录因子OsDREB基因的克隆
利用含有DRE顺式作用元件的酵母双报导子细胞，在含30mM 3-AT的SD/-His-Ura-Leu的平板上筛选水稻cDNA文库，(具体操作步骤见Clontech Mathchmakerone-hybrid system)。所得到的阳性克隆在YPD液体培养基中培养，提取质粒转化大肠杆菌。将所插入的cDNA片段从载体上切下，构建到YepGAP酵母表达载体中。由于此载体上无GAL4转录激活区域，因此只有既能与DRE元件结合又能激活下游报导基因表达的蛋白才能在30mM 3-AT的SD/-His-Ura-Leu的平板上生长。对于这样的阳性克隆，将其cDNA片段再构建到SK+载体上，经过测序获得了编码转录因子OsDREB基因的核苷酸序列。OsDREB基因包括846bp的开放读码框架，编码由281个氨基酸组成的多肽，其5’端为90bp，3’端为233bp，为序列表中的序列1。
实施例4、OsDREB基因在水稻基因组中的分析
提取水稻品种旱稻502的基因组总DNA，分别用EcoRI、NotI、XbaI、XhoI 4种限制性内切酶进行消化。将消化后的DNA转到N+Hybond膜上，用部分全长的OsDREB作探针，进行Southern杂交分析。在高严谨度条件下洗膜(65℃，0.1×SSC，0.1％SDS)得到1-2杂交条带，如图3所示，图中E代表EcoRI、N代表NotI、Xb代表XbaI、Xh代表XhoI，结果表明OsDREB基因在水稻基因组中以低拷贝形式存在。
实施例5、水稻OsDREB基因在逆境中的表达特征
对在1/2MS培养基上生长10-14天的水稻植株，在4℃下低温处理6小时，或在干旱条件下处理6小时，经液氮速冻，提取RNA作RT-PCR分析。RT-PCR反应中以水稻rRNA为对照，以控制PCR反应中模板cDNA浓度的一致。结果如图4所示，M为C表示样品未经逆境处理、L表示样品经低温处理6小时、D表示样品经干旱处理6小时，表明OsDREB的转录受到低温和干旱的诱导。
序列表
<160> 2
<210> 1
<211> 1169
<212> DNA
<213> 水稻属水稻(Oryza sativa L.)
<220>
<221> CDS
<222> (91)..(936)
<223>
<400> 1
cttaccgttg attgctgata gcctccttga tttttggaca aatgaaaagg attccgcttt 60
tggtttgttg tttttcataa tttcaattgc atg ctg ttt cga ttt gtg tct tgc 114
Met Leu Phe Arg Phe Val Ser Cys
1 5
aat gtt cag ctt tgt gga att att gag tta cct cat tgg gtc agg aag 162
Asn Val Gln Leu Cys Gly Ile Ile Glu Leu Pro His Trp Val Arg Lys
10 15 20
aag aga acg cga agg aaa agc gat ggc cct gat tca atc gct gaa acc 210
Lys Arg Thr Arg Arg Lys Ser Asp Gly Pro Asp Ser Ile Ala Glu Thr
25 30 35 40
atc aag tgg tgg aag gag caa aac cag aag ctc cag gag gag aat agc 258
Ile Lys Trp Trp Lys Glu Gln Asn Gln Lys Leu Gln Glu Glu Asn Ser
45 50 55
tcc agg aaa gcg cca gcc aag ggg tcc aag aaa ggg tgc atg gct ggg 306
Ser Arg Lys Ala Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys Met Ala Gly
60 65 70
aaa gga ggt ccg gaa aat tca aat tgt gct tac cgc ggt gtc agg caa 354
Lys Gly Gly Pro Glu Asn Ser Asn Cys Ala Tyr Arg Gly Val Arg Gln
75 80 85
cgg aca tgg ggt aag tgg gtg gct gag atc cgt gaa cca aac cgt gga 402
Arg Thr Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn Arg Gly
90 95 100
agg cgc cta tgg cta gga tca ttt cct act gcg ctg gag gct gcg cat 450
Arg Arg Leu Trp Leu Gly Ser Phe Pro Thr Ala Leu Glu Ala Ala His
105 110 115 120
gca tac gat gag gcg gca agg gca atg tat ggt ccc aca gca cgt gtc 498
Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Arg Ala Met Tyr Gly Pro Thr Ala Arg Val
125 130 135
aat ttt gca gat aat tcc aca gat gcc aac tct ggc tgc aca tca gca 546
Asn Phe Ala Asp Asn Ser Thr Asp Ala Asn Ser Gly Cys Thr Ser Ala
140 145 150
cct tca ttg atg atg tct aat ggg ccg gcc act ata cct tct gat gag 594
Pro Ser Leu Met Met Ser Asn Gly Pro Ala Thr Ile Pro Ser Asp Glu
155 160 165
aag gat gag ctg gaa tct cct cct ttc atc gtg gct aat ggg cca gct 642
Lys Asp Glu Leu Glu Ser Pro Pro Phe Ile Val Ala Asn Gly Pro Ala
170 175 180
gtg ttg tat cag cct gat aag aag gat gtg ttg gaa cgt gta gtc cct 690
Val Leu Tyr Gln Pro Asp Lys Lys Asp Val Leu Glu Arg Val Val Pro
185 190 195 200
gag gtg cag gat gtt aaa aca gaa ggg agc aat ggc ttg aaa cgt gtt 738
Glu Val Gln Asp Val Lys Thr Glu Gly Ser Asn Gly Leu Lys Arg Val
205 210 215
tgt cag gag cgg aag aat atg gag gta tgt gaa tca gaa ggg atc gtt 786
Cys Gln Glu Arg Lys Asn Met Glu Val Cys Glu Ser Glu Gly Ile Val
220 225 230
tta cac aaa gaa gtg aac ata agt tat gat tat ttc aat gtc cat gaa 834
Leu His Lys Glu Val Asn Ile Ser Tyr Asp Tyr Phe Asn Val His Glu
235 240 245
gtt gtt gag atg ata att gtt gaa tta agt gct gat cag aaa acg gaa 882
Val Val Glu Met Ile Ile Val Glu Leu Ser Ala Asp Gln Lys Thr Glu
250 255 260
gta cat gaa gag tac caa gag gga gat gat ggg ttt agc ctt ttc tcc 930
Val His Glu Glu Tyr Gln Glu Gly Asp Asp Gly Phe Ser Leu Phe Ser
265 270 275 280
tat tag agtagtagtc atgctgcggg tcaataggaa tatttcattc tagctgctag 986
Tyr
gggatacttc aaatatctgc aacctgaagc tttgtagtca tttacggttt tcgtcttact 1046
gggtaatagc tttatatata ctataagcca actggtacaa gaagttgtac tgtgtgttga 1106
gtgcactgtg gtaaaaatga atctatattt aatgagctta ctctgtcaaa aaaaaaaaaa 1166
aaa 1169
<210>2
<211>281
<212>PRT
<213>水稻属水稻(Oryza sativa L.)
<400>2
Met Leu Phe Arg Phe Val Ser Cys Asn Val Gln Leu Cys Gly Ile Ile
1 5 10 15
Glu Leu Pro His Trp Val Arg Lys Lys Arg Thr Arg Arg Lys Ser Asp
20 25 30
Gly Pro Asp Ser Ile Ala Glu Thr Ile Lys Trp Trp Lys Glu Gln Asn
35 40 45
Gln Lys Leu Gln Glu Glu Asn Ser Ser Arg Lys Ala Pro Ala Lys Gly
50 55 60
Ser Lys Lys Gly Cys Met Ala Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn Ser Asn
65 70 75 80
Cys Ala Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg Thr Trp Gly Lys Trp Val Ala
85 90 95
Glu Ile Arg Glu Pro Asn Arg Gly Arg Arg Leu Trp Leu Gly Ser Phe
100 105 110
Pro Thr Ala Leu Glu Ala Ala His Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Arg Ala
115 120 125
Met Tyr Gly Pro Thr Ala Arg Val Asn Phe Ala Asp Asn Ser Thr Asp
130 135 140
Ala Asn Ser Gly Cys Thr Ser Ala Pro Ser Leu Met Met Ser Asn Gly
145 150 155 160
Pro Ala Thr Ile Pro Ser Asp Glu Lys Asp Glu Leu Glu Ser Pro Pro
165 170 175
Phe Ile Val Ala Asn Gly Pro Ala Val Leu Tyr Gln Pro Asp Lys Lys
180 185 190
Asp Val Leu Glu Arg Val Val Pro Glu Val Gln Asp Val Lys Thr Glu
195 200 205
Gly Ser Asn Gly Leu Lys Arg Val Cys Gln Glu Arg Lys Asn Met Glu
210 215 220
Val Cys Glu Ser Glu Gly Ile Val Leu His Lys Glu Val Asn Ile Ser
225 230 235 240
Tyr Asp Tyr Phe Asn Val His Glu Val Val Glu Met Ile Ile Val Glu
245 250 255
Leu Ser Ala Asp Gln Lys Thr Glu Val His Glu Glu Tyr Gln Glu Gly
260 265 270
Asp Asp Gly Phe Ser Leu Phe Ser Tyr
275 280