过氧化物酶体增殖剂应答性受体配体剂及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及过氧化物酶体增殖剂应答性受体配体剂(增殖剤応答性受容体リガンド剤)及其制备方法，进一步讲本发明涉及含有以过氧化物酶体增殖剂应答性受体配体剂为有效成分的、用于改善胰岛素抗性或，预防和/或改善胰岛素抗性综合征(2型糖尿病、高胰岛素血症、脂肪代谢异常、肥胖、高血压、动脉硬化性疾病)的组合物。
技术背景
过氧化物酶体增殖剂应答性受体配体剂(peroxisomeproliferator-activated receptor，PPAR)是属于核内受体家族的配体依赖性转录调控因子，作为对维持脂肪代谢的基因组表达起调控作用的转录调控因子被鉴定出的。已知哺乳动物中存在PPARα、PPARδ(PPARβ、NUC-1、FAAR)、PPARγ3种亚型，PPARα主要在肝脏中表达，PPARδ普遍存在。PPARγ存在PPARγ1和PPARγ2两种isoform，PPARγ1除在脂肪组织表达外，还在免疫器官、副肾、小肠等组织表达。PPARγ2在脂肪组织特异表达，是调控脂肪细胞分化、成熟的主要调控子(河田照雄，医学のぁゆみ，184，519-523，1998)。
作为PPAR γ配体，合成化合物已知有トロゲリタゾン、ピオゲリタゾン、ロシゲリタゾン等四氢噻唑衍生物。天然化合物已知有15-脱氧-Δ12，14-前列腺素J2和Δ12-前列腺素J2等花生四烯酸代谢物，ω-3多价不饱和脂肪酸，α-亚麻酸，二十碳五烯酸(EPA)、二十碳六烯酸(DHA)等不饱和脂肪酸，9-羟基十ハデカジエン酸和13-羟基十ハデカジエン酸等二十烷类等(J.Auwerx，Diabetologia，42，1033-1049，1999)。特开2000-355538中公开了具有共价トリエン结构或共价四烯化物结构的碳数为10-26的共价不饱和脂肪酸。另外，有这样的报道，黄酮类化合物中黄酮衍生物白杨黄素(chrysin)和芹黄素(apigenin)，黄酮醇衍生物4，5，7-三羟基黄酮(kaempferol)为PPARγ配体(Y.C.Liang，et al.，FEBS Letters，496，12-18，2001)。黄酮类是植物中广泛存在的成分，具有抗氧化作用。但是，到目前为止尚不知仅在特定植物中含有的异戊二烯类黄酮为PPARγ配体。
PPARγ配体四氢噻唑衍生物，由于其激动剂活性和血糖降低作用相关，所以人们关注其与胰岛素抗性改善作用的关系，作为2型糖尿病(胰岛素非依赖性糖尿病，NIDDM)的胰岛素抗性改善药进行开发。也就是说，PPARγ配体四氢噻唑衍生物通过活化PPARγ而使从前体脂肪细胞分化而来的具有正常功能的小型脂肪细胞增加，通过诱导引发胰岛素抗性地、TNFα和游离脂肪酸产生和分泌亢进的肥大脂肪细胞的凋亡而使之减少，从而改善胰岛素抗性(A.Okuno，et al.，Journal of Clinical Investigation，101，1354-1361，1998)。另外，由于PPARγ配体改善胰岛素抗性，所以它不仅对2型糖尿病有效，而且对预防、改善高胰岛素血症、脂肪代谢异常、肥胖(特别是内脏脂肪型肥胖)、高血压、动脉硬化性疾病等胰岛素抗性综合征(R.A.DeFronzo&E.Ferrannini，Diabetes Care，14，173-194，1991)有效。与胰岛素抗性综合征同样的疾病概念包括综合征X(G.M.Reaven，Diabetes，37，1595-1607，1988)、致命四重奏(N.M.Kaplan，Archives of Internal Medicine，149，1514-1520，1989)、内脏脂肪综合征(Y.Matsuzawa，Diabetes/MetabolismReviews，13，3-13，1997)。
再者，由于PPARγ配体可抑制炎症性细胞因子的产生(C.Jiang，et al.，Nature，391，82-86，1998)，通过诱导凋亡而抑制肿瘤细胞的增殖(Y.Tsubouchi，et al.，BiOCHemical and Biophysical Research Communications，270，400-405，2000)，所以对炎症和癌症的预防和改善也有效。
发明概述
鉴于上述，PPARγ配体具有改善胰岛素抗性，预防和/或改善以2型糖尿病为首的、高胰岛素血症、脂肪代谢异常、肥胖(特别是内脏脂肪型肥胖)、高血压、动脉硬化性疾病等胰岛素抗性综合征有效。本发明的课题是提供源自天然产物的PPAR配体剂，及其简便且高效的制备方法，还提供含有以此为有效成分的、用于改善胰岛素抗性或，预防和/或改善胰岛素抗性综合征的组合物。
本发明者们从具有食用经验的天然物中探索具有PPARγ配体活性的物质，结果发现以甘草为代表的植物提取物中具有PPARγ配体活性。本发明者们对其活性成分进行了深入研究，结果发现该提取物中的特定成分具有PPARγ配体活性。本发明者们还发现，从甘草中提取这些有效成分时，用有机溶剂，优选脂肪酸酯和水溶性有机溶剂，なかんずく尤其是用水溶性有机溶剂可高效抽提。由此，完成了本发明。
即，本发明的第1方面涉及过氧化物酶体增殖剂应答性受体配体剂，它由异戊二烯类黄酮化合物(prenylflavonoid)、非异戊二烯类黄酮的黄酮醇衍生物、非异戊二烯类黄酮的查耳酮衍生物、医药上或饮食上许可的其盐类、糖苷和/或酯化体构成的。
第2方面涉及植物来源的提取物，它含有由异戊二烯类黄酮化合物、非异戊二烯类黄酮的黄酮醇衍生物、非异戊二烯类黄酮的查耳酮衍生物、医药上或饮食上许可的其盐类、糖苷和/或酯化体构成的过氧化物酶体增殖剂应答性受体配体剂。
第3方面涉及用于改善胰岛素抗性或，预防和/或改善胰岛素抗性综合征的组合物，它以异戊二烯类黄酮化合物、非异戊二烯类黄酮的黄酮醇衍生物、非异戊二烯类黄酮的查耳酮衍生物、医药上或饮食上许可的其盐类、糖苷和/或酯化体作有效成分，该有效成分具有与过氧化物酶体增殖剂应答性受体的配体结合区域结合的能力。
第4方面涉及用于预防和/或改善炎症或癌症的组合物，它以异戊二烯类黄酮化合物、非异戊二烯类黄酮的黄酮醇衍生物、非异戊二烯类黄酮的查耳酮衍生物、医药上或饮食上许可的其盐类、糖苷和/或酯化体作有效成分，该有效成分具有与过氧化物酶体增殖剂应答性受体的配体结合区域结合的能力。
第5方面涉及上述提取物的制备方法，它用皮面积的比例占总表面积3成以上的甘草抽提。
第6方面涉及上述提取物的制备方法，它用脂肪酸酯或水溶性有机溶剂从甘草中抽提。
第7方面涉及上述提取物的制备方法，它用含水率在30％(体积比)以下的有机溶剂从甘草中抽提。
发明详述
以下，详细说明本发明的实施方案。
PPAR配体剂(优选PPARγ配体剂)是具有PPAR配体活性(优选PPARγ配体活性)的化合物，即具有与PPAR(优选PPARγ)的配体结合区域结合的能力。PPARγ配体活性的检测，例如可以用报告子测定法，该法利用荧光素酶的表达来评价PPARγ配体结合区域与GAL4的融合蛋白的结合(B.M.Forman，et al.，Cell，83，803-812，1995)；也可利用应用包含PPARγ配体结合区域的蛋白的竞争性结合测定法(S.A.Kliewer，et al.，Cell，83，813-819，1995)等进行测定。这些测定法中，将样品的活性与一般的溶剂对照相比较，显示活性比溶剂对照高，且呈现用量依赖性的样品评价为“具有PPARγ配体活性”。
本发明的PPAR配体剂，优选PPARγ配体剂，是选自异戊二烯类黄酮化合物、非异戊二烯类黄酮的黄酮醇衍生物、非异戊二烯类黄酮的查耳酮衍生物、医药上或饮食上许可的其盐类、糖苷和/或酯化体的至少一种化合物。
对医药上或饮食上许可的盐类无特殊限定，例如钠盐、钾盐、镁盐、钙盐等。
对医药上或饮食上许可的糖苷无特殊限定，例如葡萄糖、半乳糖等单糖的糖苷，或二糖和寡糖的糖苷等。
对医药上或饮食上许可的酯化体无特殊限定，例如醋酸酯、丙酸酯、磷酸酯、硫酸酯等。
含有以上述化合物中的至少一种作有效成分的本发明的组合物，由于能改善胰岛素抗性，所以可作为以糖尿病为代表的胰岛素抗性综合征的预防和/或改善剂应用。
对本发明的PPAR配体，异戊二烯类黄酮化合物无特殊限定，但优选选自3-芳基香豆素(arylcoumarin)衍生物、イソフラブ-3-ニン衍生物、异黄烷(isoflavan)衍生物、异黄烷酮(isoflavanon)衍生物、异黄酮(isoflavone)衍生物、黄酮醇衍生物、黄烷酮(flavanone)衍生物、查耳酮衍生物、二苯甲酰甲烷衍生物中的至少一种化合物。
这里所讲的异戊二烯类黄酮化合物是指黄酮类的侧链具有下述(A)或(B)的化合物中至少一个：(A)：异戊二烯基；(B)异戊二烯基与与之邻位的羟基结合通过[-CH＝CHC(CH3)2O-]形成6元环结构。类黄酮化合物是2个苯基靠3个碳原子结合而成的物质的总称，例如黄酮、黄酮醇、黄烷酮、黄烷酮醇(flavanonol)、异黄酮、异黄酮醇、异黄烷酮、异黄烷(isoflavan)、イソフラブ-3-ニン(isoflav-3-ene)、3-芳基香豆素、查耳酮、二氢查耳酮、二苯甲酰甲烷、クメスタン(coumestan)、紫檀素(pterocarpan)、儿茶素(catechin)、花青素等(anthocyanidin)。
对本发明中应用的异戊二烯类黄酮化合物3-芳基香豆素衍生物无特殊限定，但优选下列普通结构式(1)中代表的化合物，例如グリシクマリン(glycycoumarin)、グリシリン(glycyrin)、(gancaonin W)、glyasperin L、(kanzonol W)等表1中所示的化合物。也可以是其盐、糖苷和酯化物。其中，优选リシクマリン(glycycoumarin)或グリシリン(glycyrin)。
[R1-R7含有异戊二烯基或邻近的2个R通过-CH＝CHC(CH3)2O-形成6元环结构中的至少一个，此外为H、OH或OCH3]。
表1R1 R2 R3 R4 R5 R6 R73-芳基香豆素OCH3 异戊二烯基 OH H OH H OHglycycoumarinOCH3 异戊二烯基 OCH3 H OH H OHglycyrinOCH3 H OH H OH 异戊二烯基 OHgancaonin WOCH3 H OH H OH-CH＝CHC(CH3)2O-glyasperin LH H-OC(CH3)2CH＝CH-OH H OHkanzonol WH H-OC(CH3)2CH＝CH-OH H OCH3RL-PH H OH H-OC(CH3)2CH＝CH- OHRL-U
对本发明中应用的异戊二烯类黄酮化合物イソフラブ-3-ニン衍生物无特殊限定，但优选下列普通结构式(2)中代表的化合物，例如デヒドログリアスプリンC(dehydroglyasperin C)、デヒドログリアスプリンD(dehydroglyasperin D)、グラブレン(glabrene)、RL-S等表2中所示的化合物。还包括这些化合物的盐、糖苷、酯化体等衍生物。其中，更优选デヒドログリアスプリンC或デヒドログリアスプリンD或グラブレン。另外，デヒドログリアスプリンD是本发明首次发现的新型化合物。
[R1-R7含有一个以上异戊二烯基或邻近的2个R通过-CH＝CHC(CH3)2O-形成6元环结构，此外为H、OH或OCH3]。
表2 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 Isoflav-3-ene OCH3 异戊二烯基 OH H OH H OH dehydroglyasperin C OCH3 异戊二烯基 OCH3 H OH H OH dehydroglyasperin D H H OH H-OC(CH3)2CH＝CH- OH glabrene H H -OC(CH3)2CH＝CH- OH H OH RL-S
对本发明中应用的异戊二烯类黄酮化合物异黄烷衍生物无特殊限定，但优选下列普通结构式(3)中代表的化合物，例如グリアスプリンC(glyasperin C)、グリアスプリンD(glyasperin D)、グリアスプリンI(glyasperin I)、licoricidin、licorisoflavan A等表3中所示的化合物。还包括这些化合物的盐、糖苷、酯化体等衍生物。其中，更优选グリアスプリンD、グラブリジン(glabridin)、ヒスパグラブリジン B(hispaglabridin B)、4’-O-甲基グラブリジン(4’-O-methylglabridin)、3’羟基-4’-O-甲基グラブリジン(3’-hydroxy-4’-O-methylglabridin)。
[R1-R7含有一个以上异戊二烯基或邻近的2个R通过-CH＝CHC(CH3)2O-形成的6元环结构，此外为H、OH或OCH3]。
表3 R1R2 R3 R4 R5R6 R7 Isoflavan(s) OCH3异戊二烯基 OH H OHH OH glyasperin C OCH3异戊二烯基 OCH3 H OHH OH glyasperin D OCH3异戊二烯基 OH H OCH3H OH glyasperin I OCH3异戊二烯基 OH H OH异戊二烯基 OH licoricidin OCH3异戊二烯基 OCH3 H OH异戊二烯基 OH licorisoflavan A OCH3异戊二烯基 OCH3 H-OC(CH3)2CH＝CH- OH kanzonol I H异戊二烯基 OH H-OC(CH3)2CH＝CH- OH glyinflanin I H-CH＝CHC(CH3)2O- H OHH OCH3 gancaonin X OCH3-CH＝CHC(CH3)2x- H OH异戊二烯基 OCH3 kanzonol H OCH3-CH＝CHC(CH3)2O- H-OC(CH3)2CH＝CH- OCH3 kanzonol J H-CH＝CHC(CH3)2O- H-OC(CH3)2CH＝CH- H glyinflanin J HH OH H OH异戊二烯基 OCH3 gancaonin Z OCH3H OH H OH异戊二烯基 OCH3 kanzonol R H H OH异戊二烯基 OH 异戊二烯 基 OH kanzonol X H H-OC(CH3)2CH＝CH- OH H OH glabridin H H-OC(CH3)2CH＝CH- OH H OCH3 4’-O-methylglabridin H H-OC(CH3)2CH＝CH- OH OH OCH3 3’-hydroxy-4’-O-met hyl-glabridin H H-OC(CH3)2CH＝CH- OH OCH3 OH 3’-O-methylglabridin H H-OC(CH3)2CH＝CH- OCH3 OH OCH3 glyasperin H H H-OC(CH3)2CH＝CH- OH 异戊二烯 基 OH hispaglabridin A H H-OC(CH3)2CH＝CH- OH-CH＝CHC(CH3)2O- hispaglabridin B H H-OC(CH3)2CH＝CH- OCH3-CH＝CHC(CH3)2O- methylhispaglabridin B H H-OC(CH3)2CH＝CH--OC(CH3)2CH＝CH- H glyinflanin K H H OH H-OC(CH3)2CH＝CH- OCH3 gancaonin Y H H OH H OH-CH＝CHC(CH3)2O- phaseollinisoflavan H H OH 异戊二 烯基 OH-CH＝CHC(CH3)2O- 8-异戊二烯基 -phaseollinisoflavan
对本发明中应用的异戊二烯类黄酮化合物异黄烷酮衍生物无特殊限定，但优选下列普通结构式(4)中代表的化合物，例如グリアスプリンB(glyasperin B)、グリアスプリンK(glyasperin K)、kanzonol G、3’-prenyl-kievitone、グリアスプリンF(glyasperin F)等表4中所示的化合物。还包括这些化合物的盐、糖苷、酯化体等衍生物。其中，更优选グリアスプリンB、甘草异黄烷酮(glycyrrhisoflavanone)。
[R1-R8含有异戊二烯基或邻近的2个R通过-CH＝CHC(CH3)2O-形成的6元环结构的至少一个，此外为H、OH或OCH3]。
表4 R1 R2R3 R4 R5 R6 R7 R8 Isoflavanone (异黄烷酮) OH 异戊二 烯基OCH3 H OH H OH H glyasperin B OH 异戊二 烯基OCH3 H OH H OCH3 H glyasperin K OH 异戊二 烯基OCH3 H OH 异戊二烯 基 OH H kanzonol G OH HOH 异戊二烯 基 OH 异戊二烯 基 OH H 3’-异戊二烯基 -kievitone (3’，8-diprenyldal bergioidin) OH HOH H-OC-(CH3)2CH＝CH- OH H glyasperin F OH HOH 异戊二烯 基-OC-(CH3)2CH＝CH- OH H glyasperin J OCH3 HOH H H OH-CH＝CHC(CH3) 2O- 甘草异黄烷酮 OCH3 HOH H OH-CH＝CHC(CH3)2O- H glyasperin M OH HOH H OH-CH＝CHC(CH3)2O- H licoisoflavanon e H H-OC-(CH3)2CH＝CH- OH H OH H RL-Q H H-OC-(CH3)2CH＝CH- OH H OCH3 H RL-R OH 异戊二 烯基OH H OH 异戊二烯 基 OH H No Name
对本发明中应用的异戊二烯类黄酮化合物异黄酮衍生物无特殊限定，但优选下列普通结构式(5)中代表的化合物，例如wighteone、gancaonin A、gancaonin B、gancaonin G、gancaonin N等表5中所示的化合物。还包括这些化合物的盐、糖苷、酯化体等衍生物。其中，更优选グリウラリンB(glyurallin B)、ルピヮイテオン(lupiwighteone)、半甘草异黄酮B(semilicoisoflavone B)或甘草异黄酮(glycyrrhisoflavone)。
[R1-R7含有一个以上异戊二烯基或邻近的2个R通过-CH＝CHC(CH3)2O-形成6元环结构至少一个，此外为H、OH或OCH3]。
表5R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 异黄酮 OH 异戊二 烯基OHH H H OH H H wighteone OH 异戊二 烯基OHH H H OCH3 H H gancaonin A OH 异戊二 烯基OHH H OH OCH3 H H gancaonin B OH 异戊二 烯基OCH3H H H OH H H gancaonin G OH 异戊二 烯基OHH OH H OCH3 H H gancaonin N OH 异戊二 烯基OCH3H OH H OH H H 7-O-methyl- luteone OH 异戊二 烯基OCH3H OH 异戊二烯 基 OH H H kanzonol K OH 异戊二 烯基OH异戊二烯基-OC(CH3)2CH＝CH- OH H H kanzonol L OH 异戊二 烯基OHH H OH OH 异戊二烯 基 H isoangustone A OH 异戊二 烯基OHH H OH-OC(CH3)2CH＝CH- H gancaonin H OH HOH异戊二烯基 H H OH H H lupiwighteon e OH HOH异戊二烯基 H OH OH H H gancaonin L OH HOH异戊二烯基 H H OCH3 H H gancaonin M OH HOH异戊二烯基 H OH OH 异戊二烯 基 H glyurallin B OH HOH异戊二烯基-OC(CH3)2CH＝CH- OH H H glyasperin N H HOHH OH 异戊二烯 基 OH H H eurycarpin A OH HOHH OH 异戊二烯 基 OH H H licoisoflavone A OH HOHH OH-CH＝CHC(CH3)2O- H H licoisoflavone B H HOHH OH-CH＝CHC(CH3)2O- H H glabrone OH HOHH H OH OH 异戊二烯 基 H Glycyrrhiso- flavone OCH 3 HOHH H OH OH 异戊二烯 基 H glisoflavone OH HOHH H OH-OC(CH3)2CH＝CH- H Semilicoiso- flavone B H HOHH OH H OH 异戊二烯 基 OCH3 glicoricone H HOHH OH H OCH3 异戊二烯 基 OCH3 licoricone
对本发明中应用的异戊二烯类黄酮化合物黄酮醇衍生物无特殊限定，但优选下列普通结构式(6)中代表的化合物，例如甘草黄酮醇(licoflavonol)、gancaonin P、トパゾリン(topazolin)、グリアスプリン(glyasperin A)、异甘草黄酮醇(isolicoflavonol)等表6中所示的化合物。还包括这些化合物的盐、糖苷、酯化体等衍生物。其中，更优选甘草异黄酮醇、甘草黄酮醇、或トパゾリン。
[R1为OH或OCH3。R2-R9至少含有一个以上异戊二烯基或邻近的2个R通过-CH＝CHC(CH3)2O-形成6元环结构，此外为H、OH或OCH3]。
表6 R1 R2 R3R4R5 R6 R7 R8 R9 黄酮醇 OH OH 异戊二 烯基OHH H H OH H 甘草黄酮醇 OH OH 异戊二 烯基OHH H OH OH H gancaonin P OCH3 OH 异戊二 烯基OHH H H OH H topazolin OH OH 异戊二 烯基OHH H 异戊二 烯基 OH H glyasperin A OH OH HOHH H 异戊二 烯基 OH H 异甘草黄酮醇 OH OH HOH异戊二烯基 H H H H glepidotin A OH H OHOHH 异戊二 烯基 OH OH H neouralenol OH OH HOHH H OH OH 异戊二 烯基 uralenol OCH3 OH H OH H H OH OH异戊二烯基uralenol-3-O-methyl-ether OCH3 OH OH H H H OH OH异戊二烯基uralane
对本发明中应用的异戊二烯类黄酮化合物黄烷酮衍生物无特殊限定，但优选下列普通结构式(7)中代表的化合物，例如6-prenylpinocembrin、6-prenylnaringenin、6-prenyleriodictyol、sinoflavanone B、paratocarpin L等表7中所示的化合物。还包括这些化合物的盐、糖苷、酯化体等衍生物。其中，更优选グラブロ-ル(glabrol)。
[R1-R8含有一个以上异戊二烯基或邻近的2个R通过-CH＝CHC(CH3)2O-形成6元环结构，此外为H、OH或OCH3]。
表7 R1 R2R3R4 R5 R6 R7 R8 黄烷酮 OH 异戊二 烯基OHH H H H H 6-prenylpinocembrin OH 异戊二 烯基OHH H H OH H 6-prenylnaringenin OH 异戊二 烯基OHH H OH OH H 6-prenyleriodictyol OH 异戊二 烯基OH异戊二烯基 H H H H sinoflavanone B OH 异戊二 烯基OHH H 异戊二烯 基 OH H paratocarpin L H HOH异戊二烯基 H H H H ovaliflavanone B H HOH异戊二烯基 H H OH H isobavachin OH HOH异戊二烯基 H H H H glabranin OH HOH异戊二烯基 H H OH H sophoraflavanone B OHH OH 异戊二烯 基 H OH OH H 8-prenyleriodictyol OHH OH 异戊二烯 基 H OCH3 OH H exiguaflavanone K HH OH 异戊二烯 基 H 异戊二烯 基 OH H glabrol OHH OH 异戊二烯 基 H 异戊二烯 基 OH H euchrestaflavanone A OHH OH 异戊二烯 基 H OH OH 异戊二烯 基 gancaonin E OHH-OC(CH3)2CH＝CH- H H OH H citflavanone HH-OC(CH3)2CH＝CH- H 异戊二烯 基 OH H shinflavanone HH-OC(CH3)2CH＝CH- H-CH＝CHC(CH3)2O- H xambioona OHH OH H H 异戊二烯 基 OH H licoflavanone OHH OH H H OH OH 异戊二烯 基 sigmoidin B (uralenin) OHH OH H H H-OC(CH3)2CH＝CH- sigmoidin C H异戊二烯基 OH 异戊二烯 基 H H OH H 无名称
对本发明中应用的异戊二烯类黄酮化合物查耳酮衍生物无特殊限定，但优选下列普通结构式(8)中代表的化合物，例如甘草查耳酮C(licochalconeC)、甘草查耳酮D(licochalcone D)、glyinflanin G、kanzonol B、kanzonol C等表8中所示的化合物。还包括这些化合物的盐、糖苷、酯化体等衍生物。其中，更优选甘草查耳酮C。
[R1-R9含有一个以上异戊二烯基或邻近的2个R通过-CH＝CHC(CH3)2O-形成6元环结构，此外为H、OH或OCH3]。
表8 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9查耳酮(Chalcone) OCH3 异戊二 烯基 OH H H H OH H H甘草查耳酮C OCH3 OH OH H H 异戊二烯 基 OH H H甘草查耳酮D H-CH＝CHC(CH3)2O- OH OH-CH＝CHC(CH3)2O- H Hglyinflanin G H-CH＝CHC(CH3)2O- H OH H OH H Hkanzonol B H 异戊二 烯基 OH H H H OH 异戊二 烯基 OHkanzonol C H H OH H OH H OCH3 异戊二 烯基 Hisobavachalcone H 异戊二 烯基 OH H OH 异戊二烯 基 OH H H无名称 H OH-OC(CH3)2CH＝CH- OH 异戊二烯 基 OH H H无名称 H-CH＝CHC(CH3)2O- OH H H OH 异戊二 烯基 OH无名称
对本发明中应用的异戊二烯类黄酮化合物二苯甲酰甲烷衍生物无特殊限定，但优选下列普通结构式(9)中代表的化合物，例如甘草二酮A(glycyrdione A)、甘草二酮B(glycyrdione B)、甘草二酮C(glycyrdione C)、glyinflanin B、glyinflanin D等表9中所示的化合物。还包括这些化合物的盐、糖苷、酯化体等衍生物。其中，更优选甘草二酮A或甘草二酮C。
[R1-R7含有一个以上异戊二烯基或邻近的2个R通过-CH＝CHC(CH3)2O-形成6元环结构，此外为H、OH或OCH3]。
表9 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 二苯甲酰甲烷 OH H OH 异戊二烯基 H 异戊二烯基 OH glycyrdione A(glyinflanin A) OH H OH 异戊二烯基 H -CH＝CHC(CH3)2O- 甘草二酮B OH H -OC(CH3)2CH＝CH- H 异戊二烯基 OH 甘草二酮C(glyinflanin C) OH H -OC(CH3)2CH＝CH- H H OH glyinflanin B OH H -OC(CH3)2CH＝CH- H -CH＝CHC(CH3)2O- glyinflanin D OH H OH H H 异戊二烯基 OH kanzonol A OH H OH 异戊二烯基 H H OH 5’-异戊二烯基-licondione
对本发明中应用的非异戊二烯类黄酮查耳酮衍生物无特殊限定，如包括刺凌德草碱(echinatin)、イソリクイリチゲニン(isoliquiritigenin)、甘草查耳酮A(licochalconeA)、甘草查耳酮B(licochalconeB)等。还包括这些化合物的盐、糖苷、酯化体等衍生物。
对本发明中应用的非异戊二烯类黄酮黄酮醇无特殊限定，如莰非醇3-O-甲基酯(kaempferol 3-O-methylester)。还包括这些化合物的盐、糖苷、酯化体等衍生物。
此外，这些化合物的名称参照平贺敬夫及梶山喜一郎的报告(明治药科大学纪要，27，9-57，1997)和T.Nomura，T.Fukai的报告(Fortschritte derChemie organischer Naturstoffe，73，1-158，1998)。
本发明的PPAR配体剂若是上述化合物的话，无论是植物等天然来源的，还是化学合成或通过细胞培养等生物合成的化合物均可使用，但优选有食用经验的天然来源的。对获得这些化合物的方法无特殊限定，可从有食用经验的豆科的甘草获得，也可从其它植物获得。对其它植物无特殊限定，只要是含有PPAR配体剂，优选含有PPARγ配体剂的植物即可，除了豆科植物以外，包括如桑树科、杜仲科、大麻科、イラクサ科(Urticaceae family)的植物。
以下，以从甘草中获得为例，对本发明的PPAR配体剂的制备方法进行说明，但并不限定于甘草。
所使用的甘草使用豆科甘草属(Glycyrrhiza属)的植物较好，例如甘草(Glycyrrhizauralensis Fisch.et DC，ウラル甘草)，(G.inflate BAT，胀果甘草)、(G.glabra L.，洋甘草)，(G.glabra L.var glandu rifera Regel et Herder，ナンキン甘草)，(G.echinata L.，シナ甘草)，(G.pallidiflora Maxim，刺果甘草)和其它同属植物(Leguminosae)。产地有，例如新疆产、中国东北产、中国西北产、蒙古产、俄罗斯产、阿富汗产、伊朗产、土耳其产等。尤其优选如上所述的PPAR配体活性成分的含量高的G.ウラレンシス(产地：中国东北、中国西北、蒙古、新疆等)、G.グラブラ(产地：俄罗斯、阿富汗、伊朗、土耳其等)、G.インフラタ((产地：新疆等)，特别优选应用G.ウラレンシス(G.uralensis)。
本发明中优选应用上述甘草的根、根茎或杆，可应用它们的微粉碎品、粉碎品、切断品或上述甘草的周皮。这里所讲的微粉碎品是指所谓的粉末或接近粉末的物品，粉碎品指丝状或纤维状或绵状的物品(例如，长度5mm-10cm的物品)。切断品是指将甘草的根、根茎或杆等切断而形成的物品(例如，切成长度普通情况下1-10cm，优选1-5cm，更优选2-4cm，厚度普通的大约3cm以下，优选2cm以下，更优选1cm以下)，具有普通圆柱状或与之基本上类似的形态。使用普通的机器可获得微粉碎品、粉碎品、切断品。微粉碎品可通过例如，大容量装填粉碎机、石臼式粉碎机等获得粉末或接近粉末的物品；粉碎品可通过例如，锤密耳式粉碎机获得。另外，切断品可利用通常的裁断机将上述甘草的根切成上述长度而获得。
另外，上述甘草其有效成分的组成和含有量会因其种类、产地、采集时间等而有所差异，所以优选使用通过预实验确定出含有效成分多的甘草。
作为提取方法包括用有机溶剂从甘草进行抽提的方法，也可用有机溶剂从预先用水等抽提的水抽提残渣、或使残渣干燥后从中进行抽提。
这里所应用的有机溶剂无特殊限制，但优选医药品和食品、食品添加物等制备、加工中所使用的安全的有机溶剂，例如丙酮、碳原子数1-4个的1元醇、甘油、脂肪酸酯、二乙基乙醚、环己烷、二氧化碳、丙二醇等，也可将这些溶剂中至少2种以上混合使用。其中，适于使用的溶剂为醋酸乙酯等脂肪酸酯和碳原子数1-4个的1元醇、丙酮、丙二醇、甘油等水溶性有机溶剂，特别优选上述水溶性有机溶剂。
抽提后用活性炭和树脂等进行吸附处理，和/或通过分级进行纯化，以使提取物中活性成分含量高。通过硅胶、ODS、离子交换树脂等柱层析法可从提取物浓缩、分级或分离出目的化合物。
当然也可利用其它化学合成的方法得到这些目的化合物。
以下，以用脂肪酸酯或水溶性有机溶剂抽提甘草的方法作为含有本发明中PPAR配体剂的甘草提取物的优选制备方法，对其进行详细说明。用脂肪酸酯或水溶性有机溶剂抽提出的甘草提取物有显示良好的PPAR配体活性的趋势，特别是使用水溶性有机溶剂可有效获得PPAR配体活性物质，所以优选之。
用脂肪酸酯或水溶性有机溶剂从甘草提取目的物质时，可直接从甘草的微粉碎品、粉碎品、切断品或周皮等进行抽提，也可如上所述，预先用其它溶剂(例如，水、碱性水溶液等)进行抽提，然后通过用脂肪酸酯或水溶性有机溶剂从预抽提后的甘草预抽提残渣进行抽提，以除去不纯物等。
用其它溶剂(水、碱性水溶液等)对甘草进行抽提后，通过一般的分离操作(例如，加压过滤、减压过滤、滤器加压、离心、沉降等)可分离出抽提液和甘草预抽提残渣，得到甘草预抽提残渣。在上述分离操作中，必要时可使用活性炭、活性白土等常规使用的过滤辅助剂和吸附剂等。
直接或经过一般的干燥操作(例如，静置干燥、搅拌干燥、混合干燥、流动干燥、气流干燥、喷雾干燥、冷冻干燥、冷冻浓缩等)从所得甘草预抽提残渣中全部或部分除去所使用的其它溶剂(水、碱性水溶液等)，然后用脂肪酸酯或水溶性有机溶剂进行抽提。
对本抽提方法中适于应用的脂肪酸酯或水溶性有机溶剂无特殊限制，如乙酸乙酯等醋酸酯、碳原子数1-4个的1元醇、丙酮、丙二醇、甘油等，或其混合物，优选乙醋酸等醋酸酯、碳原子数1-4个的1元醇、丙酮或其混合物，更优选乙酸乙酯、乙醇、丙酮或其混合物。特别是从溶剂对人体安全的观点出发优选乙醇。从后述降低甘草皂苷等水溶性杂质的混入这一点考虑，优选碳原子数2-4个的1元醇、脂肪酸酯、丙酮，特别优选脂肪酸酯和丙酮，还优选醋酸酯和丙酮，尤其优选乙酸乙酯和丙酮。不用说，在不带来负面影响的范围内，与其它溶剂共存也无妨。
因此，本发明中增加甘草提取物中有效成分的含量，且降低甘草皂苷等水溶性杂质的含量非常重要。
甘草皂苷作为医药利用的话有血压升高作用、心肌障碍、水血症(Harders，H.&Rausch-Stroomann，J.G.，Munch.Med.Wschr.95，580(1953))、低钙血症、血浆肾素活性减少、伪性醛固酮症、四肢迟缓性麻痹(Conn，J.W.，Rovner，D.R.&Cohen，E.L.，J.Am.Med.Assoc.205，492(1968))、尿中醛固酮排泄减少、浮肿、头痛、嗜睡(Epatein，M.T.，et al.，Brit.Med.J.，1，488(1977))等副作用，另外，其甜度是生糖的150倍。混入甘草皂苷后不仅阻碍甘草提取物的各种效果，而且由于其副作用和高甜度不利于作为食品等利用。
为了增加甘草提取物中有效成分的含量，且降低甘草皂苷等水溶性杂质的含量，在用有机溶剂进行抽提时，优选降低共存的水分含量。因此，一般应用极其干燥的甘草，再者使用不含水分的有机溶剂很重要。
但是，不用说甘草是植物体，为了获得极其干燥的甘草，不仅通常进行的太阳晒干十分必要，而且有必要使用干燥器。这在工业规模的生产上是个大难点。
另外，即便使用不含水分的有机溶剂，从所用的甘草和作业环境中完全防止水分混入是很困难的，所以作为水分含量增加了的有机溶剂进行回收。直接将这种有机溶剂进行再循环很难，要么放弃使用，要么要用特殊的高价纯化设备进行无水化处理，无论哪种情况均会升高制备成本。
因此，若能极其简便且廉价地制备有效成分含量高、水溶性杂质含量低的高品质甘草提取物，将是非常大的优点，这是大家所期待的。
为了获得上述高品质的甘草提取物，本发明者们进行了深入研究，结果发现：从甘草的形态讲，使用皮面积占总表面积的比例高的甘草较好，普通在3成(30％)以上，优选使用5成以上，更优选7成以上，尤其优选8成以上，特别是9成以上的甘草(具体而言，上述切断品(cut product)和周皮(periderm)(包括以周皮为主的))。而且，若使用上述形态的甘草，即便使用含水的水溶性有机溶剂也可获得高品质的甘草提取物。
上述切断品和周皮(包括以周皮为主的)中，优选使用加工较容易的切断品，使用切断品时，皮面积占总表面积的比例普通在5成以上，优选使用7成以上，更优选8成以上，尤其优选9成以上的。
依照该方法，特别是使用上述水溶性有机溶剂时，优选使用碳原子数2-4个的1元醇、更优选使用乙醇，可最大限度发挥其效果。
所用有机溶剂的含水率，普通的在30％(体积)以下，优选约20％以下，更优选10％以下，特别优选8％以下的。对其下限无特殊限制，从实用的观点出发，普通的约3％，优选4％。
通过该方法，适宜获得有效成分含量高、水溶性杂质含量低的高品质甘草提取物。所得提取物中甘草皂苷的含量优选最小化到0.5％以下。另外，(不用特别干燥甘草)即便使用廉价地含水的水溶性有机溶剂作抽提溶剂也适宜获得高品质甘草提取物。
用上述脂肪酸酯或水溶性有机溶剂进行抽提时，可按照一般的方法实施，对此无特殊限制。对抽提温度无特殊限制，从系统的固化温度到沸点，一般为-20℃-100℃，普通1-80℃，优选20-60℃。
对上述甘草或甘草预抽提残渣进行抽提操作时，可应用例如1-20倍体积的上述脂肪酸酯或水溶性有机溶剂，优选2-10倍体积(基于甘草体积或预提取残余物体积)，如抽提0.1小时以上，优选0.2小时以上，更优选0.5小时以上。通常，每1次的抽提时间适宜在1-10小时。对上限无特殊限制，可以是1天，或更长时间。必要的情况下可进行1次或数次抽提，或适当组合应用所用的溶剂进行。对抽提的压力无特殊限制，可在常压-加压状态(1-数个大气压)下进行，若希望的话也可在减压下进行。在环流下或加压状态下实施。
上述抽提后，通过一般的分离操作(例如，加压过滤、减压过滤、离心、沉降等)分离抽提液和甘草抽提残渣，根据需要用上述溶剂进行洗涤，可获得甘草抽提液。在上述分离操作中，必要时可使用活性炭、活性土、树脂等常规使用的过滤辅助剂和吸附剂等。
通过一般的溶剂去除操作(例如，常压浓缩、减压浓缩、喷雾干燥、冷冻干燥、冷冻浓缩等)从所得的甘草抽提液中去除所使用的溶剂，获得去除了溶剂的甘草提取物。另外，优选如上抽提后，通过用活性炭和树脂等进行吸附处理和/或分级等进行纯化，以提高提取物中活性成分的含有量。
另外，本发明的制备方法中，从活性成分的稳定性方面考虑，上述的一系列操作，尤其是用溶剂进行抽提，或用溶剂进行抽提及其后面的操作(抽提液的分离、溶剂去除、用活性炭和树脂等进行吸附处理和/或分级等)优选在应用氮气等惰性气体等脱氧氛围下进行。可在抗坏血酸、抗坏血酸钠、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯、维生素E等抗氧化剂共存下实施，达到抑制氧化的目的。
通常，除去溶剂后获得的甘草提取物为褐色(例如，黄褐色到黑褐色)。
用上述方法所得的干甘草提取物与甘草的重量比(干重基准)普通约0.01以上。
本发明的提取物中甘草皂苷的含量通常在0.5％(重量)以下(干体基准)，优选0.3％(重量)以下，更优选0.2％(重量)以下，尤其是0.1％以下的为低含量。事实上，当本发明的提取物中甘草皂苷的含量达0.001-0.5％(干体基准)时，上述副作用和利用上的不利就不成问题。
提取物中甘草皂苷的含量可通过，例如以市售的甘草皂苷或甘草皂苷酸盐作标准物质，经HPLC等分析进行定量。提取物中PPAR配体剂成分的含量可通过，例如以本发明的PPAR配体剂作标准物质，经HPLC等分析进行定量。用作标准物质的PPAR配体剂，可以应用从甘草等植物分离出的化合物，也可应用化学合成的化合物。提取物中PPAR配体剂成分的总量可作为定量的PPAR配体剂成分的含量总合算出来。
本发明的提取物中所含PPAR配体剂成分的总量以干体为基准，通常在0.5％(重量)以上，优选1％以上，更优选2％以上。特别是，用碳原子数为1-4的一元醇抽提时，其总量通常在5％(重量)以上，优选6％以上，更优选7％以上，可高效回收有效成分。另外，本发明的提取物中所含PPAR配体剂成分的总量以干体为基准，通常最大在50％(重量)以下，但抽提后经过用活性炭和树脂等进行吸附处理和/或分级等纯化处理的，可进一步提高其含有量。
本发明的提取物，作为主要成分，如选自グリシクマリン、グリシリン、デヒドログリアスプリンC、デヒドログリアスプリンD、グリアスプリンB和グリアスプリンD中的至少一种成分，在提取物中的含量以干体为基准，通常在0.5％(重量)以上，优选1％以上。再者，优选グリシクマリン、グリシリン、デヒドログリアスプリンC、デヒドログリアスプリンD、及グリアスプリンD在提取物中的含量以干体为基准，通常各在0.5％(重量)以上，优选1％以上。这些成分在甘草尤其是G.ウラレンシス提取物中含有许多。
另外，如选自甘草异黄烷酮(glycyrrhisoflavanone)、甘草异黄酮(glycyrrhisoflavone)、グリウラリンB、セミリコ异黄酮及イソリクイリチゲニン中的至少一种成分，在提取物中的含量以干体为基准，通常在0.01％(重量)以上，优选0.02％以上。优选提取物中包含甘草异黄烷酮(glycyrrhisoflavanone)、甘草异黄酮(glycyrrhisoflavone)、グリウラリンB、セミリコ异黄酮及イソリクイリチゲニンt通常各为0.01％以上，优选0.02％以上，以干重计。
另外，如选自グラブレン、グラブリジン、グラブロ-ル、3’羟基-4’-O-甲基グラブリジン、4’-O-甲基グラブリジン及ヒスパグラブリジンB中的至少一种成分，在提取物中的含量以干体为基准，在0.5％(重量)以上，优选1％以上。更优选グラブレン、グラブリジン、グラブロ-ル、3’羟基-4’-O-甲基グラブリジン、4’-O-甲基グラブリジン及ヒスパグラブリジンB在提取物中的含量以干体为基准，分别在0.5％(重量)以上，优选1％以上。这些成分，尤其是G.ウラレンシス，在甘草提取物中含有许多。
另外，如选自甘草查耳酮A、甘草查耳酮B、甘草查耳酮C、甘草二酮A及甘草二酮C中的至少一种成分，在提取物中的含量以干体为基准，在0.5％(重量)以上，优选1％以上。更优选甘草查耳酮A、甘草查耳酮B、甘草查耳酮C、甘草二酮A及甘草二酮C在提取物中的含量以干体为基准，分别在0.5％(重量)以上，优选1％以上。这些成分在甘草尤其是G.ウラレンシス提取物中含有许多。
本发明的改善胰岛素抗性或，预防和/或改善胰岛素抗性综合征的组合物，以及本发明的预防和/或改善炎症或癌症的组合物，是含有本发明的PPAR配体剂的组合物。即，含有选自异戊二烯类黄酮化合物、非异戊二烯类黄酮的查耳酮衍生物、非异戊二烯类黄酮的黄酮醇衍生物、医药上或饮食上许可的其盐类、糖苷和/或酯化体中的至少一种化合物的组合物。
同样，对异戊二烯类黄酮化合物无特殊限制，但优选选自3-芳基香豆素衍生物、イソフラブ-3-ニン衍生物、异黄烷衍生物、异黄烷酮衍生物、异黄酮衍生物、黄酮醇衍生物、黄烷酮衍生物、查耳酮衍生物、二苯甲酰甲烷衍生物中的至少一种化合物。
这里，上述化合物使用纯的化合物较好，另外，作为医药品和食品也可使用半纯品或粗制品，只要其不含有不适当的不纯物即可。该情况下，既可直接使用上述提取物，又可对其选一步纯化使用。对其形态无限定，例如可作为保健功能食品(特定保健用食品、营养功能食品)和健康食品、营养补助食品等饮食品，医药品，准药品(quasi drug)等使用。
本发明的组合物既可用于人，又可用于狗、猫、牛、马、猪、鸡、羊、山羊、小鼠、大鼠等家畜或宠物。
作为饮食品使用时，可直接摄取，或应用公知的载体和辅助试剂制备成胶囊、片剂、颗粒剂、散剂等易于服用的剂型进行摄取。还可按常规方法适当添加本发明的PPAR配体剂以外的制剂材料进行混合。对此无特殊限制，例如包括赋形剂、崩解剂、润滑剂、结合剂、防氧化剂、着色剂、抗凝剂、促吸收剂、稳定剂等。这些成型剂中，本发明的PPAR配体剂的含有量在0.1-100％(重量)，优选在10-90％。再者，混入饮食原料中，可在口香糖、巧克力、糖果、果子酱、饼干、クラツか等糖果类，冰激凌、冰糕等冷品类，茶、非酒精饮料、营养饮料、美容饮料等饮料，混沌、中华面、通心粉、即席面等面类；鱼酱食品，如鱼肉末，蒸鱼(kamaboko)，鱼肠(chikuwa)，肉末(hannpen)；白色调味料、蛋黄酱、酱油等调味料，人造黄油、奶油、色拉油等油脂类，面包、火腿、汤、甑煮食品、冷冻食品等所有饮食物中使用。摄取这些饮食用组合物时，其摄取量以本发明的PPAR配体剂计，成人每人每日的摄取量为0.1-3000mg/kg体重，优选1-300mg/kg体重。另外，也可作为家畜和宠物用的饲料和宠物食品使用，其摄取量以本发明的PPAR配体剂计，优选0.1-3000mg/kg体重。
作为医药品使用时，对其剂型无特殊限制，例如胶囊、片剂、颗粒剂、散剂、注射剂、坐剂、贴附剂等。在进行剂型制备中可适当添加药剂学上许可的其它制剂材料，如赋形剂、崩解剂、润滑剂、结合剂、防氧化剂、着色剂、抗凝剂、促吸收剂、溶解辅助剂、稳定剂等。这些制剂的施用量，以本发明的PPAR配体剂计，成人每人每日0.1-3000mg/kg体重，优选1-300mg/kg体重，一次或分数次施用。另外，也可作为家畜和宠物用的医药品使用，其施用量以本发明的PPAR配体剂计，优选每日0.1-3000mg/kg体重。
本发明的组合物以片剂、胶囊、或散剂形式存在，且以上述提取物为PPAR配体剂时，优选每剂中含有0.1-1000mg上述提取物。
本发明的PPAR配体剂是植物来源的提取物成分及其类似物，我们认为其毒性低。另外，根据本发明而得的提取物可添加到无糖食品中。并且与已报道的PPARγ配体剂高度不饱和脂肪酸类相比其优点是稳定性高，具有适于食品和医药组合物的性状。
实施发明的最佳方案
以下，列举实施例对本发明进一步进行具体说明，但本发明并不限于这些实施例。
(实施例1)从甘草提取、分离化合物(1)
将1.2kg甘草(G.ウラレンシス：东北甘草)的微粉碎品浸到5.5L醋酸乙酯中，室温、避光抽提7天后，通过过滤获得抽提液。对其抽提液进行减压浓缩除去溶剂，获得74.0g提取物。将提取物加到硅胶色谱柱上(1500ml)，用氯仿∶甲醇＝19∶1(v/v)进行洗脱，得到级分。对洗脱级分进行减压浓缩除去溶剂，获得55.4g粗级分。通过反复进行硅胶柱色谱、ODS硅胶柱色谱、装了ODS柱的高效液相色谱、凝胶过滤色谱、分相薄层色谱，对所得粗级分进行纯化，得到化合物1(225mg)、化合物2(80.7mg)、化合物3(19.6mg)、化合物4(22.2mg)、化合物5(3.9mg)、化合物6(72.8mg)、化合物7(28. mg)、化合物8(12.1mg)、化合物9(6.8mg)、化合物10(8.5mg)、化合物11(58.7mg)、化合物12(10.2mg)。
进行结构分析的结果是，化合物1-3和5-12是已知的化合物，它们分别是：化合物1为グリシクマリン(glycycoumarin)、化合物2为グリシリン(glycyrin)、化合物3为グリウラリンB(glyurallin B)、化合物5为刺凌德草碱(echinatin)、化合物6为异甘草黄酮醇(isolicoflavonol)、化合物7为デヒドログリアスプリンC(dehydroglyasperin C)、化合物8为グリアスプリンB(glyasperin B)、化合物9为甘草异黄烷酮(glycyrrhisoflavanone)、化合物10为ルピヮイテオン(lupiwighteone)、化合物11为グリアスプリンD(glyasperin D)、化合物12为半甘草异黄酮B(semilicoisoflavone B)。这些化合物结构的鉴定过程中，化合物1参考S.Demizu，et al.，Chemical andPharmaceutical Bulletin，36，3474-3479，化合物2参考T.Kinoshita，et al.，Chemical and Pharmaceutical Bulletin，26，135-140(1978)，化合物3及7参考M.Shibano，et al.，Heterocycles，45，2053-2060(1997)，化合物5参考K.Kajiyama，et al.，PhytOCHemistry，31，3229-3232(1992)，化合物6及9参考T.Hatano，et al.，Chemical and Pharmaceutical Bulletin，36，2090-2097((1988)，化合物8及11参考L.Zeng，et al.，Heterocycles，34，575-587(1992)，化合物10参考Y.Hashidoko，et al.，Agricultural and Biological Chemistry，50，1797-1807(1986)，化合物12参考F.Kiuchi，et al.，Heterocycles，31，629-636(1990)中记载的光谱数据。
化合物4是新型化合物，以二元NMR(1H-1HCOSY，HMQC，HMBC，PHNOESY)为中心进行光谱解析，鉴定出其结构为3-(2’，4’-dihydroxyphenyl)-6-(3”，3”-dimethylallyl)5，7-dimethoxy-2H-chromene，将之命名为デヒドログリアスプリンD(dehydroglyasperin D)。
化合物4的性状及光谱数据如下：
Dehydroglyasperin D，褐色粉末状，C22H24O5。
E1-MS m/z：368.1610[M]+(计算值，C22H24O5：368.1624)。
Uvλmax(甲醇)nm：330(logε＝4.25)，243 sh(logε＝4.21)。
IR(KBr片)cm-1：3375，2929，1613，1516，1458，1308，1198，1164，1114，1092，1024，978，837。
1H-NMR(二甲基亚砜)ppm：7.06(1H，d，J＝8.4Hz，H-6’)，6.68(1H，s，H-4)，6.34(1H，d，J＝2.3Hz，H-3’)，6.33(1H，s，H-8)，6.26(1H，dd，J＝8.4，2.3Hz，H-5’)，5.09(1H，br t，J＝6.9Hz，H-10)，4.90(2H，s，H-2)，3.75(3H，s，C-7-Ome)，3.67(3H，s，C-5-Ome)，3.18(2H，br d，J＝6.7Hz，H-9)，1.71(3H，s，Me-13)，1.63(3H，s，Me-12)。
13C-NMR(二甲基亚砜)ppm：67.9(C-2)，128.8(C-3)，114.7(C-4)，110.4(C-4a)，154.9(C-5)，115.6(C-6)，158.0(C-7)，95.8(C-8)，153.2(C-8a)，22.6(C-9)，124.1(C-10)，130.4(C-11)，26.0(C-12)，18.1(C-13)，11.68(C-1’)，156.7(C-2’)，103.3(C-3’)，158.7(C-4’)，107.4(C-5’)，129.2(C-6’)，62.3(C-5-Ome)，56.3(C-7-Ome).
(实施例2)从甘草提取、分离化合物(2)
与实施例1同样，从甘草(G.ウラレンシス)的微粉碎品进行乙醇萃取，进行各种色谱，得到化合物13-17。进行结构分析的结果，鉴定出化合物13是イソリクイリチゲニン(isoliquiritigenin)，化合物14是莰非醇-3-O-甲基酯(kaempferol 3-O-methylester)，化合物15是甘草黄酮醇(licoflavonol)，化合物16是トパゾリン(topazolin)，化合物17是甘草异黄酮。
(实施例3)从甘草提取、分离化合物(3)
与实施例1或实施例2同样，从甘草(G.グラブラ)的微粉碎品进行乙醇萃取，得到化合物18-23，从甘草(G.インフラ-タ)的微粉碎品进行乙醇萃取，得到化合物24-28。进行结构分析的结果，鉴定出化合物18是グラブリジン(glabridin)，化合物19是グラブレン(glabrene)，化合物20是ヒスパグラブリジンB(hispaglabridin B)，化合物21是4’-O-甲基グラブリジン(4’-O-methylglabridin)，化合物22是3羟基-4’-O-甲基グラブリジン(3’-hydroxy-4’-O-methylglabridin)，化合物23是グラブロ-ル(glabrol)，化合物24是甘草查耳酮A(licochalcone A)，化合物25是甘草查耳酮B(licochalcone B)，化合物26是甘草查耳酮C(licochalcone C)，化合物27是甘草二酮A(glycyrdione A)，化合物28是甘草二酮C(glycyrdione C).
化合物1-28的结构式如表10-13所示。
表10
表11
表12
表13
(实施例4)PPARγ配体活性的测定
将CV-1细胞(来源于雄性非洲绿猴肾脏的培养细胞)接种到96孔培养板中，6×103细胞/孔，37℃、5％CO2条件下培养24小时。应用含10％FBS(胎牛血清)、10ml/L青霉素-链霉素溶液(分别为5000IU/ml，5000ug/ml，GIBCO)、37mg/L抗坏血酸(和光纯药工业株式会社)的DMEM(Dulbecco’s ModifiedEagle Medium，GIBCO)培养基。用OPTI-MEM(GIBCO)洗涤细胞后，用lipofectamine plus(GIBCO)转化pM-mPPARγ和4×UASg-luc。pM-mPPARγ是表达结合了酵母来源的转录因子GAL4基因(氨基酸序列1-147)和小鼠PPARγ配体结合部位基因(氨基酸序列174-475)的嵌合蛋白用的质粒。4×UASg-luc是将GAL4的应答序列(UASg)4次插入到荧光素酶基因上游的报告质粒。转染大约24小时后，换成含样品的培养基，培养24小时(n＝4)。将溶解到二甲基亚砜(DMSO)的样品，无处置对照用DMSO，以1/1000量添加到培养基中。用含Ca，Mg的磷酸缓冲生理盐水(PBS+)洗涤细胞后，添加ルツクライト(Packard)，用Topcount-microplate scintillation/luminescenecounter(Packard)测定荧光素酶的荧光强度。
对照组应用pM(去除了PPARγ配体结合部位基因的质粒)代替pM-mPPARγ进行与测定组同样地测定。计算出测定组及对照组的荧光强度的均值(n＝4)的比值(测定组/对照组)，将对无处置对照的比活性作为样品的PPARγ配体活性。
测定实施例1-3中所得化合物1-28的PPARγ配体活性的结果示于表14-17。另外，以甘草成分甘草酸(glycyrrhizic acid：和光纯药工业株式会社)、甘草次酸(glycyrrhetinic acid：和光纯药工业株式会社)、クエルセチン(quercetin：Sigma)作为比较化合物，测定其PPARγ配体活性。
表14添加濃度 PPARγ 配体活性无处置对照 (DMSO)0.1％ 1.00トログリタゾン0.5μM 2.17±0.081μM 3.36±0.242μM 4.60±0.27化合物1(グリシクマリン)2μg/ml(5.4μM) 2.035μg/ml(13.6μM) 2.7910μg/ml(27.2μM) 3.82化合物2(グリシリン)2μg/ml(5.2μM) 2.815μg/ml(13.1μM) 3.3410μg/ml(26.2μM) 3.67化合物3(グリウラリンB)2μg/ml(4.7μM) 1.285μg/ml(11.8μM) 1.9610μg/ml(23.7μM) 2.73化合物4(デヒドログリアスペリンD)2μg/ml(5.4μM) 2.955μg/ml(13.6μM) 3.7210μg/ml(27.2μM) 4.00化合物5(刺凌德草碱)2μg/ml(7.4μM) 1.455μg/ml(18.5μM) 2.3510μg/ml(37.0μM) 2.49
表15 添加濃度 PPARγ 配体活性无处置对照(DMSO) 0.1％ 1.00トログリタゾン 0.5μM 2.44±0.10 1μM 3.99±0.24 2μM 5.74±0.31化合物6(イソリコフラボノ-ル) 2μg/ml(5.6μM) 1.73 5μg/ml(14.1μM) 2.50 10μg/ml(28.2μM) 3.82化合物7(デヒドログリアスペリンC) 2μg/ml(5.6μM) 2.90 5μg/ml(14.1μM) 3.73 10μg/ml(28.2μM) 4.41化合物8(グリアスペリンB) 2μg/ml(5.4μM) 2.60 5μg/ml(13.5μM) 3.53 10μg/ml(27.0μM) 3.02化合物9(甘草异黄酮) 2μg/ml(5.4μM) 2.01 5μg/ml(13.6μM) 3.45 10μg/ml(27.2μM) 4.68化合物10(ルピヮイテオン) 2μg/ml(5.9μM) 1.67 5μg/ml(14.8μM) 2.53 10μg/ml(29.6μM) 3.75化合物11(グリアスペリンD) 2μg/ml(5.4μM) 3.22 5μg/ml(13.5μM) 3.28 10μg/ml(27.0μM) 4.06化合物12(半甘草异黄酮B) 2μg/ml(5.7μM) 1.86 5μg/ml(14.2μM) 2.66 10μg/ml(28.4μM) 3.15グリチルリチン 2μg/ml(2.4μM) 1.21 5μg/ml(6.1μM) 1.10 10μg/ml(12.2μM) 0.75グリチルレチン酸 2μg/ml(4.2μM) 0.97 5μg/ml(10.6μM) 0.95 10μg/ml(21.2μM) 0.97クエルセチン 2μg/ml(5.9μM) 1.15 5μg/ml(14.8μM) 1.72 10μg/ml(29.6μM) 1.70
表16 添加濃度 PPARγ リガンド活性無処置对照(DMSO) 0.1％ 1.00トログリタゾン 0.5μM 2.24±0.56 1μM 3.29±0.60 2μM 4.80±1.30化合物13(イソリクイリチゲニン) 2μg/ml(7.8μM) 1.47 5μg/ml(19.5μM) 2.71 10μg/ml(39.0μM) 3.39化合物14莰非醇3-O-甲基酯 2μg/ml(6.7μM) 1.86 5μg/ml(16.7μM) 2.37 10μg/ml(33.3μM) 3.47化合物15(甘草黄酮醇) 2μg/ml(5.6μM) 1.44 5μg/ml(14.1μM) 2.27 10μg/ml(28.2μM) 4.07化合物16(トパゾリン) 2μg/ml(5.4μM) 2.56 5μg/ml(13.6μM) 3.64 10μg/ml(27.1μM) 5.84化合物17(甘草异黄酮) 2μg/ml(5.6μM) 1.78 5μg/ml(14.1μM) 3.05 10μg/ml(28.2μM) 3.20
表17 添加濃度 PPARγ 配体活性无处置对照(DMSO) 0.1％ 1.00トログリタゾン 0.5μM 2.05±0.35 1μM 3.30±0.43 2μM 5.66±1.06化合物18(グラブリジン) 2μg/ml(6.2μM) 1.64 5μg/ml(15.4μM) 2.15 10μg/ml(30.8μM) 1.98化合物19(グラブレン) 2μg/ml(6.2μM) 1.78 5μg/ml(15.5μM) 3.44 10μg/ml(31.0μM) 2.89化合物20(ヒスパグラブリジンB) 2μg/ml(5.1μM) 1.04 5μg/ml(12.8μM) 1.45 10μg/ml(25.6μM) 1.94化合物21(4’-0-メチルグラブリジン) 2μg/ml(5.9μM) 1.25 5μg/ml(14.8μM) 1.55 10μg/ml(29.6μM) 2.13化合物22(3’-ヒドロキシ-4’-0-メチルグラブリジン) 2μg/ml(5.6μM) 1.61 5μg/ml(14.1μM) 2.46 10μg/ml(28.2μM) 1.69化合物23(グラブロ-ル) 2μg/ml(5.1μM) 1.85 5μg/ml(12.7μM) 3.48 10μg/ml(25.5μM) 3.74化合物24甘草查耳酮A 2μg/ml(5.9μM) 4.02 5μg/ml(14.8μM) 4.14 10μg/ml(29.6μM) 4.16化合物25甘草查耳酮B 2μg/ml(7.0μM) 1.27 5μg/ml(17.5μM) 1.93 10μg/ml(34.9μM) 1.61化合物26(甘草查耳酮C) 2μg/ml(5.9μM) 1.84 5μg/ml(14.8μM) 2.20 10μg/ml(29.6μM) 3.71化合物27(甘草二酮A) 2μg/ml(4.9μM) 1.44 5μg/ml(12.2μM) 2.49 10μg/ml(24.5μM) 3.05化合物28(甘草二酮C) 2μg/ml(4.9μM) 0.96 5μg/ml(12.3μM) 1.48 10μg/ml(24.6μM) 2.04
以トログリタゾン(三共株式会社)作阳性对照，比较各化合物的PPARγ配体活性。结果在化合物1-19、21-24、26和27中可看到比0.5uMトログリタゾン强的PPARγ配体活性。化合物20、25和28中可看到比0.5uMトログリタゾン稍弱的PPARγ配体活性。但甘草的主要成分和亲水成分甘草皂苷(glycyrrhizin)、甘草皂苷糖残基水解的甘草酸及クエルセチン(化合物6的异戊二烯基置换成OH基的黄酮醇衍生物)中未看到PPARγ配体活性。クエルセチン无PPARγ配体活性与文献报道(Liang，Y.C.，et al.，FEBSLetters，496，12-18，2001)一致。
(实施例5)对2型糖尿病模型小鼠的效果
用呈现遗传性肥胖的2型糖尿病发病性模型动物KK-Ay小鼠评价化合物2对2型糖尿病的效果。用胰岛素抗性改善药-2型糖尿病治疗药ピオグリタゾン作为阳性对照。
将KK-Ay小鼠(♀，15周龄)分为3组(每组5只)，以粉末CE-2作为基本饲料(日本クレア)，给予无添加组(对照组)、ピオグリタゾン添加组、化合物2添加组，进行自由摄取。将ピオグリタゾン的アクトス片(每片中含有30mgピオグリタゾン：武田药品工业株式会社)在玛瑙乳钵中粉碎，以0.02％的添加量将ピオグリタゾン添加到基本饲料中。与实施例1同样制备的化合物2，以0.1％的添加量添加到基本饲料中。施用前及施用后4天从小鼠尾静脉少量取血，用简式血糖测定仪ゲルテストエ-ス(株式会社三和化学研究所)测定血糖值。其结果如表18所示。
给予混和饲料一周后，小鼠绝食一晚，进行糖负荷试验。即，给绝食了的小鼠强制经口施用悬浮于0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的ピオグリタゾン，20mg/kg，或给予化合物2,100mg/kg。无添加组(对照组)施用0.5％CMC-Na溶液，5ml/kg。施用30分钟后，以2g/kg的负荷给予小鼠40％蔗糖溶液。糖负荷前、糖负荷后30分钟、1小时、2小时，从小鼠尾静脉少量取血，用简式血糖测定仪ゲルテストエ-ス(株式会社三和化学研究所)测定血糖值。其结果如表19所示。
表18 血糖值(mg/dl) 無添加群 (对照组)ピオグリタゾン添加组 化合物2 (グリシリン) 添加组 给药前 476±22 486±26 474±27 给药后4日 420±14 191±6** 278±14**
**(p＜0.01)
表19血糖值(mg/dl) 無添加群 (对照组)ピオグリタゾン添加组 化合物2 (グリシリン) 添加组糖負荷前 80±2 89±3 78±4糖負荷後30分 355±18 158±11** 225±27**糖負荷後1小时 199±11 136±5* 129±8*糖負荷後2小时 100±4 106±4 100±3
*(p＜0.05)，**(p＜0.01)
如表18所示，与ピオグリタゾン同样，给予添加了化合物2的饲料的小鼠的血糖值(均值±SE，n＝5)在施用第4天统计学上显著性降低血糖值。如表19所示，与ピオグリタゾン同样，化合物2可统计学上显著性抑制糖负荷后血糖值的急剧上升。这些结果表明，化合物2具有血糖降低作用和血糖升高抑制作用，提示它具有与ピオグリタゾン同样的胰岛素抗性改善作用。
(实施例6)
将500g甘草(G.ウラレンシス：东北甘草)的微粉碎品浸到5kg(99.5％体积比)乙醇中，25℃、萃取5小时后，过滤残渣获得抽提液。对其抽提液进行减压浓缩除去溶剂，获得45g黄褐色-黑褐色的甘草提取物。该甘草提取物显示良好的PPARγ配体活性。该甘草提取物中所含PPARγ配体活性成分及甘草酸的含量如表20所示。
其活性成分和甘草酸的含量可用下述条件下的HPLC分析求出。
(甘草皂苷分析条件)
柱：J’sphere ODS-H80(ワイエムシン)4.6mm(内径)×250mm(长度)；柱温：40℃；移动相：乙腈∶10mM磷酸水溶液＝33∶67(v/v)；流速：1ml/min；检测波长：254nm；甘草皂苷的保留时间：27.1min。
(活性成分分析条件)
柱：J’sphere ODS-H80(ワイエムシン)4.6mm(内径)×250mm(长度)；柱温：40℃；移动相：乙腈对10mM磷酸水溶液的比率梯度为从分析开始到15min保持在35％，15min-65min后以一定比率上升到70％，65min-70min保持在70％；流速：1ml/min；检测波长：254nm。各成分的保留时间为：甘草查耳酮B 5.2min，甘草异黄烷酮13.3min，イソリクイリチゲニン14.7min，グリシクマリン32.7min，半甘草异黄酮B 34.2min，グラブレン35.9min，甘草异黄酮36.3min，デヒドログリアスプリンC 37.2min，甘草查耳酮C 39.1min，甘草查耳酮A40.2min，グラブリジン44.7min，グリシリン48.1min，グリアスプリン B 51.1min，グラブロ-ル51.8min，グリアスプリンD 52.7min，甘草二酮A 53.4min，3’羟基-4’-O-甲基グラブリジン 53.5min，デヒドログリアスプリン D55.2min，グリウラリンB 58.7min，4’-O-甲基グラブリジン59.8min，甘草二酮C 63.0min，ヒスパグラブリジン B 74.1min。
表20化合物名含量(wt％)甘草皂苷 0.28甘草异黄烷酮イソリクイリチゲニングリシクマリン半甘草异黄酮B甘草异黄酮デヒドログリアスペリンCグリシリングリアスペリンBグリアスペリンDデヒドログリアスペリンDグリウラリンB 0.15 0.19 2.55 0.45 0.50 2.82 1.46 1.12 2.44 1.39 0.03
活性成分 計 13.10％
(实施例7)
除用丙酮代替乙醇进行萃取以外，与实施例6同样进行抽提，得到甘草提取物18g。所得甘草提取物显示良好的PPARγ配体活性。该甘草提取物中所含PPARγ配体活性成分及甘草酸的含量与实施例6同样进行检测，结果如表21所示。
表21化合物名含量(wt％)甘草皂苷 0.06甘草异黄烷酮イソリクイリチゲニングリシクマリン半甘草异黄酮B甘草异黄酮デヒドログリアスペリンCグリシリングリアスペリンBグリアスペリンDデヒドログリアスペリンDグリウラリンB 0.19 0.16 3.50 0.01 0.69 4.09 1.91 1.40 3.38 1.82 0.03
(实施例8) 活性成分 計 17.18％
除用醋酸乙酯代替乙醇进行萃取以外，与实施例6同样进行抽提，得到甘草提取物18g。所得甘草提取物显示良好的PPARγ配体活性。该甘草提取物中所含PPARγ配体活性成分及甘草酸的含量与实施例6同样进行检测，结果如表22所示。
表22化合物名含量(wt％)甘草皂苷 0.05甘草异黄烷酮イソリクイリチゲニングリシクマリン半甘草异黄酮B甘草异黄酮デヒドログリアスペリンCグリシリングリアスペリンBグリアスペリンDデヒドログリアスペリンDグリウラリンB 0.18 0.09 3.44 0.62 0.70 4.09 1.96 1.52 3.41 1.93 0.03
(比较例1)活性成分 計 17.97％
除用水代替乙醇进行萃取以外，与实施例6同样得到甘草提取物。所得甘草提取物不显示PPARγ配体活性。
(实施例9)
将500g甘草(G.ウラレンシス：东北甘草)(株式会社カネカサンスパイス)的微粉碎品浸到5kg水中，60℃、萃取1天后，过滤，获得残渣，对其进行减压干燥。向所得抽提残渣中加入2.5kg乙醇(99.5％体积比)乙醇中，25℃、萃取5小时后，过滤残渣获得抽提液。减压下从抽提液中除去溶剂，获得47g黄褐色-黑褐色的甘草提取物。该甘草提取物显示良好的PPARγ配体活性。甘草提取物中所含PPARγ配体活性成分及甘草酸的含量与实施例6同样进行检测，结果如表23所示。
表23化合物名含量(wt％)甘草皂苷 0.50甘草异黄烷酮イソリクイリチゲニングリシクマリン半甘草异黄酮B甘草异黄酮デヒドログリアスペリンCグリシリングリアスペリンBグリアスペリンDデヒドログリアスペリンDグリウラリンB 0.18 1.93 2.10 0.40 0.44 1.19 1.44 1.19 1.59 1.03 0.03
活性成分 計 11.52％
(实施例10)
与实施例6同样，用99.5％和95％(体积比)的乙醇(含水率0.5％和5.0％)，从甘草(G.ウラレンシス：东北甘草)的切断品(皮面积占总表面积的比例约8成)进行抽提，分别得到25.8g、29.5g甘草提取物。所得甘草提取物显示良好的PPARγ配体活性。甘草提取物中所含PPARγ配体活性成分及甘草酸的含量与实施例6同样进行检测，结果如表24所示。
表24提取时乙醇的水含量 0.5vol％ 5.0vol％化合物名 含量(wt％) 含量(wt％)甘草皂苷 0.02 0.26甘草异黄烷酮イソリクイリチゲニングリシクマリン半甘草异黄酮B甘草异黄酮デヒドログリアスペリンCグリシリングリアスペリンBグリアスペリンDデヒドログリアスペリンDグリウラリンB 0.14 0.03 3.12 0.42 0.65 7.53 1.95 3.92 6.48 4.43 0.12 0.03 0.05 2.85 0.41 0.54 4.50 1.92 3.62 4.23 3.63 0.11
活性成分 計 28.79％ 21.89％
(实施例11)
与实施例6同样，从甘草(G.グラブラ)的微粉碎品中获得甘草提取物。所得甘草提取物显示良好的PPARγ配体活性。甘草提取物中所含PPARγ配体活性成分及甘草酸的含量与实施例6同样进行检测，结果如表25所示。
表25 化合物名 含量(wt％)甘草皂苷 0.27甘草异黄烷酮インリクイリチゲニングラブレングラブリジングラブロ-ル3’-ヒドロキシ-4’-0-メチルグラブリジン4’-0-メチルグラブリジンヒスパグラブリジンB 0.09 0.12 3.14 22.08 4.33 2.19 3.03 1.14
活性成分 計 36.12％
(实施例12)
与实施例6同样，从甘草(G.インフラ-タ)的微粉碎品中获得甘草提取物。所得甘草提取物显示良好的PPARγ配体活性。甘草提取物中所含PPARγ配体活性成分及甘草酸的含量与实施例6同样进行检测，结果如表26所
表26化合物名含量(wt％)甘草皂苷 0.17イソリクイリチゲニン甘草查耳酮B甘草查耳酮C甘草查耳酮A甘草二酮A甘草二酮C 0.19 2.57 3.61 20.34 1.91 0.94
(实施例13)
将玉米淀粉、乳糖、羧甲基纤维素、硬脂酸镁混和到实施例6中所得的甘草提取物中，再加入聚乙烯吡咯烷酮的水溶液作为结合剂，按常规方法使之颗粒化。向其中加入滑石后，打片，获得如下组成的片剂。
甘草提取物 10重量份
玉米淀粉 25重量份
乳糖 15重量份
羧甲基纤维素 10重量份
硬脂酸镁 3重量份
聚乙烯吡咯烷酮5重量份
滑石 10重量份
产业上利用的可能性
本发明简便且高效地提供过氧化物酶体增殖剂应答性受体(PPAR)配体剂，及含有此成分的组合物。本发明的组合物作为胰岛素抗性的改善或，胰岛素抗性综合征的预防和/或改善剂有用。