一种喹诺里西啶类生物碱的抗柯萨奇病毒作用 【技术领域】
本发明涉及一种喹诺里西啶类生物碱，更具体指槐定碱(Sophoridine)，经药理试验证明对病毒性心肌炎治疗有效，，它可在制备治疗病毒性心肌炎药物中应用。
背景技术
病毒性心肌炎是由多种病毒(如柯萨奇B族病毒)引起的，以心肌细胞变性坏死、间质单个核细胞浸润为主要病变的一种临床常见病，严重危害人类健康。
目前，西医临床治疗病毒性心肌炎的主要方法是使用普通抗病毒药、免疫抑制剂、干扰素及心肌细胞营养剂等，但疗效并不理想。
近年来，药理研究和临床试验表明，中药在病毒性心肌炎的临床治疗中显示出极大优势。目前临床上针对病毒性心肌炎的中成药只有个别品种，且为粗提物制剂(如芪冬颐心口服液)，大多为医生自拟的处方汤药，急需开发出疗效确切，有效成分和药理作用清楚，剂型先进，服用方便，质量稳定可控的中药制剂。
槐定碱(Sophoridine)可从苦参、苦豆子等植物中提取得到，文献报道有镇痛、抗肿瘤、抗心律失常等药理作用，但未见抗柯萨奇B族病毒(CoxsackieGroup B Virus)及治疗病毒性心肌炎的报道。
【发明内容】
本发明的目的是克服常规多味汤药存在的不足之处，采用化学方法从苦参等植物中提取分离出一种喹诺里西啶类生物碱——槐定碱，经药理试验，证实该化合物可在制备治疗病毒性心肌炎的药物中应用。
槐定碱的提取方法如下(以苦参为例)：
中药苦参粗粉用甲醇室温浸渍3次，每次24h。甲醇提取液浓缩后加水稀释，用稀HCl调PH3～4，乙醚洗2次，所得酸水液浓缩后加NaOH调至pH3，加入二氯甲烷提取生物碱，所得二氯甲烷提取液回收后的残留物溶于氯仿中，然后加入适量乙醚，将溶液浓缩，残留液采用氧化铝柱层析，用石油醚-丙酮洗脱，分离获得纯化合物槐定碱(Sophoridine)。它的分子式为C15H24ON2，分子量为248。
它的化学结构式如下：
槐定碱提取工艺参考“中药化学成分提取分离手册”，杨云主编，中国中医药出版社，1998年第一版。
本发明采用上述方法提取获得的槐定碱首先进行药效试验。
将槐定碱分成两个剂量组，Balb/c小鼠随机分为4组。
1、正常对照组：不给槐定碱，不接种病毒，只给等量蒸馏水；
2、病毒对照组：每只腹腔接种0.1mlCVB3病毒液(TCID50＝10-7.5，105倍稀释)。
3、给药组I-高剂量：同上法接种CVB3病毒液，同日灌胃槐定碱0.15mmol/kg·d(槐定碱用生理盐水配制成2.85mg/ml)，连续给药7天，观察15天；
4、给药组II-低剂量：灌胃槐定碱，剂量为0.075mmol/kg·d；
结果病毒组死亡80％，本发明药物能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的死亡率，高剂量组可降低到35％，低剂量组可降低到50％。
本发明采用上述试验的剂量分组，连续给药7天，观察15天，然后将小鼠解剖，在解剖前秤小鼠体重，解剖后再秤取其心脏重量，然后计算出它的心指数。计算方法为：
心指数＝心重/体重
当动物被病毒感染后，摄食量减少，体重降低，而心脏却因此膨大，发生纤维化而变重，所以可以用心指数来衡量心脏的病变程度，心指数越大，心脏病变越严重。
结果显示，本发明药物的高剂量组能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的心指数。
本发明采用上述试验地剂量、分组，连续给药7天，观察15天，然后将小鼠解剖，心肌标本置于反复冻融使病毒颗粒释放，取病毒稀释液将心肌标本病毒悬液连续做10倍稀释，将其接种于Hep-2细胞上(96孔板)，测定心肌样本的病毒滴度。
实验结果表明，本发明药物的高剂量组能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的心脏病毒滴度。
注：以上药理试验方法参考《现代药理实验方法》(下册，P1425，张均田主编，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998年版)。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但不对其有任何限制。
实施例1：本发明药物对病毒性心肌炎小鼠死亡率的影响试验
取Balb/c小鼠56只，随机分为4组。
正常对照组：6只，不给本发明药物，也不接种病毒，只给等量蒸馏水。
病毒对照组：10只，每只腹腔接种0.1mlCVB3病毒液(TCID50＝10-7.5，105倍稀释)。
给药组：高剂量：20只，接种CVB3病毒液，同日按0.15mmol/kg·d灌胃给予本发明药物，连续给药7天，观察至第15天。
低剂量：20只，接种病毒及给予本发明药物，剂量为0.075mmol/kg·d
观察记录给药(饲养)期间动物的精神状态、饮食、毛色及死亡等情况。
结果：本发明药物两个剂量组均能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的死亡率，见表1。
表1 本发明药物对病毒性心肌炎小鼠死亡率的影响
组别 动物数(只) 死亡率(例数)
正常对照组 6 0(0)
病毒对照组 10 80％(8)
给药高剂量组 20 35％(7)**
给药低剂量组 20 50％(10)*
注：采用卡方检验，给药组与病毒组比较，*有统计意义。
实施例2：本发明药物对病毒性心肌炎小鼠心指数的影响试验
Balb/c小鼠分组及给药剂量同实施例1。连续给药7天，观察到第15天，将所有小鼠全部解剖。在解剖前秤小鼠的体重，解剖后再秤取其心脏重量。
心指数＝心重/体重
当动物被病毒感染后，摄食量减少，体重降低，而心脏却因此膨大、发生纤维化而变重，所以可以用心指数来衡量心脏的病变程度，心指数越大，心脏病变越严重。
结果：本发明药物的高剂量组能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的心指数，见表2。
表2本发明药物对病毒性心肌炎小鼠心指数的影响
组别 心指数(×10-3)
正常对照组 5.80±0.60
病毒对照组 6.56±1.33
给药高剂量组 6.08±1.17*
给药低剂量组 6.40±0.84
注：给药组与病毒组比较：*p＜0.05，**p＜0.01
实施例3：本发明药物对病毒性心肌炎小鼠心脏病毒滴度的影响试验
Balb/c小鼠分组及给药剂量同实施例1。连续给药7天，观察到第15天，将所有小鼠全部解剖。将心肌标本置于0.5ml无菌水中反复冻融三次后，病毒颗粒将从心肌中释放出来，取病毒稀释液将心肌标本病毒悬液连续做101-105倍稀释，将其接种于Hep-2细胞上(96孔板)，每个样本接种3个孔，连续观察5天，观察细胞的TCID50，记录最后一天细胞出现TCID50病毒稀释度。记录方法：如出现50％以上细胞病变的冻融病毒液的最低稀释度为10-5，即为TCID50＝10-5，为便于统计，取负对数将其换算，即-LgTCID50＝5。取3个孔的平均值即为该样品的病毒中和指数。
中和指数的大小与病毒毒力成正比，指数越大则毒力越强；指数小则毒力弱，提示药物的抗病毒药效。
结果：本发明药物的高剂量组能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的心脏病毒滴度，结果见表3。
表3 本发明药物对病毒性心肌炎小鼠心脏病毒滴度的影响
病毒滴度
正常对照 0
病毒对照 1.26
给药高剂量组 0.67*
给药低剂量组 1.2
注：给药组与病毒组比较：*p＜0.05，**p＜0.01
注：以上药理试验方法参考《现代药理实验方法》(下册，P1425，张均田主编，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998年版)。