一种四水合辅羧酶的制备方法 【技术领域】
本发明涉及四水合辅羧酶的制备方法。
背景技术
四水合辅羧酶(Cocarboxylase Tetrahydrate)为维生素类药，又名四水合硫胺焦磷酸酯，在体内参与糖代谢中丙酮酸和a-酮戊二酸的氧化脱羧反应，是糖类代谢所必需，缺乏时，氧化受阻形成丙酮酸，乳酸堆积，并影响机体能量供应，其症状主要表现在神经系统、心血管系统和消化系统方面等。临床上常用于脚气病或Wernicke脑病的治疗。亦可用于四水合辅羧酶缺乏引起的周围神经炎、消化不良等的辅助治疗。四水合辅羧酶化学名为4-甲基-3-[(2-甲基-4-氨基-5-嘧啶基)甲基]-5-(2-焦磷酸酰氧乙基)噻唑鎓四水合物。结构为：
1937年，K.Lohmann和Ph.Schuuster从发酵粉中以氯化维生素B1焦磷酸酯的形式分离出辅羧酶。同年，Stern和Hofer利用维生素B1和三氯氧磷反应制备了氯化维生素B1焦磷酸酯[cf.Science，Vol.85，p.483(1937)]。1938年，文献报道了利用维生素B1与焦磷酸钠与磷酸的混合溶液反应制备硫胺焦磷酸酯[cf.Joural of the American ChemicalSociety，Vol.60，p.2263(1938)]，通过利用磷钨酸溶液与大量的有机溶剂处理得到硫胺焦磷酸酯，收率10％左右。1940年，文献报道了利用维生素B1类似物5-溴化乙烯-噻唑和磷酸银反应制备了氯化维生素B1焦磷酸酯[cf.Biochemical Journal，Vol.34，p.980(1940)]，该方法中，硫胺焦磷酸酯以银盐的形式析出，用硫化氢除去银离子，然后用氯化氢处理得到氯化硫胺焦磷酸酯。
US2991284、US5047223公开了维生素B1与磷酸和五氧化二磷混合反应制备得到辅羧酶粗品混合物并使混合物经过弱碱性离子交换树脂和阳离子交换树脂纯化得到四水合辅羧酶的方法；CN1887891A公开了一种以磷酸与五氧化二磷在加热条件下与维生素B1反应得到辅羧酶粗品，粗品再分别通过弱碱性阴离子交换树脂、弱酸性阳离子交换树脂纯化，再经结晶处理制得高纯度四水合辅羧酶(含量大于99％)的方法。
现有技术多以磷酸为起始原料，其纯化工艺多需要大量有机溶剂处理或有毒气体，或反应温度高，不利于环境保护，技术本身生产可行性差，收率较低，产品质量不稳定，成本较高。
JP昭49-14751也公开了一种辅羧酶衍生物的制备方法，即通过维生素B1的盐与焦磷酸在脱水缩合剂无水金属盐，例如Zn、Al和Mg的盐酸盐，Mn和Na的硫酸盐的作用下，在100℃以上搅拌15-10分钟制备辅羧酶。但在实际操作过程中，发现该方法实用性不强，反应几乎无法正常进行。因此寻找一种反应迅速，可重复性强的方法十分必要。
本发明克服了现有技术的不足，反应由焦磷酸代替磷酸参与反应，并且筛选出效果较好的脱水剂，通过该方法的使用降低了反应温度，解决了反应的不可行性，低效率、低收率、产品质量不稳定等，使反应可控性更强，收率更高，纯度更高，HPLC检测含量99％以上，单个杂质0.5％以内，总杂质1.0％以内。并有效降低了对环境的污染。
【发明内容】
本发明的提供了一种简单、经济和技术上操作性强、产率高、纯度高的方法来制备四水合辅羧酶。所述制备方法包括以下步骤：
通过焦磷酸与脱水剂在加热条件下与维生素B1反应，脱水剂为五氧化二磷、三氯氧磷、浓硫酸之一或其任意混合物，优选是五氧化二磷。
该反应中维生素B1、脱水剂、焦磷酸的质量比可以为：1∶0.5～3∶2～10，优选1∶1～3∶3～10。在反应过程中加热条件可以控制在70℃～200℃，优选100℃～160℃。
为了得到纯度比较高的产品，在得到四水合辅羧酶后可进行精制，精制方法可以为：将四水合辅羧酶用水溶解，加入至与水不互溶的有机叔胺溶液，振摇，取水层，加至弱碱性阴离子交换树脂柱，纯化水洗脱，接收洗脱液，洗脱液加至酸性阳离子交换树脂柱，水洗脱，接收洗脱液，合并紫外光检测有荧光部分，浓缩，结晶，得到四水合辅羧酶。其中酸性阳离子交换树脂柱为强酸性阳离子交换树脂柱或弱酸性阳离子交换树脂柱。有机叔胺可为三丁胺、三戊胺、三辛胺之一或其任意混合物，优选三辛胺。有机胺的溶液可为三丁胺、三戊胺、三辛胺之一或其任意混合物与甲基异丁基甲醇的混合溶液，优选三辛胺与甲基异丁基甲醇的混合溶液。
其纯化精制工艺可以为如CN1887891A所公开的纯化精制工艺，即将反应液得到的粗品，先置于大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂中，用纯化水洗脱，洗脱液置于弱酸性阳离子交换树脂中，用纯化水洗脱，收集洗脱液，经后处理结晶纯化得到四水合辅羧酶。
其纯化精制工艺可以为将反应液加入至与水可互溶的非水溶剂-水溶剂系统中使析出固体，取固体用水溶解，置于大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂中，用纯化水洗脱，洗脱液置于弱酸性阳离子交换树脂中，用纯化水洗脱，收集洗脱液，经后处理结晶纯化得到四水合辅羧酶。
所述的弱碱性阴离子交换树脂和酸性阳离子交换树脂为市售的商品树脂，其具体型号可根据生产商的不同而不同，如弱碱性阴离子交换树脂的D301、D303、D315、D335、D311、D85、WA10、IRA-76、IRA-400型号；酸性阳离子交换树脂的732、WK40、HZD-2、HD-8型号。树脂柱的填充、预处理等为现有技术，一般按生产商提供的树脂使用说明书方法处理即可。
为得到更高纯度和质量要求的四水合辅羧酶，尤其是满足某些特定制药的要求，如注射剂与口服剂，即使对原料纯度要求如99％以上，其对原料的有关物质等质量指标有不同的要求，其纯化精制工艺可以重复其中一或多个纯化工艺步骤，如“反应液加入至与水可互溶的非水溶剂-水溶剂系统中使析出固体”、“固体用水溶解，加入至与水不互溶的有机叔胺溶液，振摇，取水层”、“结晶”等工艺步骤可以为重复2次以上或其纯化工艺步骤互相结合多次以达到特定制剂对原料的要求。
所述的四水合辅羧酶的制备方法，如：将焦磷酸加入到反应器中，100℃充分搅拌1～2小时，加入维生素B1，反应0.5～1.5小时，再加热到120℃，加入五氧化二磷或三氯氧磷、浓硫酸等，搅拌反应至薄层色谱法(TLC)检测原料点完全消失(展开剂如：甲醇∶水∶乙酸＝2∶1∶0.5)，冷却至50℃以下，加入纯化水形成透明溶液。搅拌下将此溶液滴入5℃以下无水乙醇或甲醇、丙酮、乙腈、异丙醇、四氢呋喃等溶液中，大量类白色固体析出，过滤，取固体，或取固体溶于纯化水中按以上操作重复一次，将所得固体溶于纯化水中，三辛胺-甲基异丁基甲醇溶液或三丁胺、三戊胺溶液萃取1～2次，取水溶液，装入弱碱性阴离子交换树脂(如D301)柱中，纯化水洗脱，将洗脱液直接引入强酸性阳离子交换树脂(如732)柱，纯化水洗脱，紫外检测洗脱液出现荧光时开始接收洗脱液，接收洗脱液至紫外检测洗脱液没有荧光时停止接收洗脱液。洗脱液减压浓缩(温度不高于35℃)，向浓缩液中滴入1～4倍量的无水乙醇或甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇、四氢呋喃，大量白色固体析出，过滤、干燥得类白色固体，即得，或浓缩液处理析出白色固体适量水溶解，再次加入无水乙醇或甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇、四氢呋喃使白色固体析出，过滤、干燥，即得。
本发明所述焦磷酸与脱水剂在加热条件下与维生素B1反应的反应终点判断，可以为上述的TLC法，也可以为其他合适的方法，如可以为CN1887891A所述的反应至无游离氯离子方法(反应液用0.1M硝酸银溶液检测不再有白色浑浊产生)。
本发明所述的经过弱碱性阴离子交换树脂柱和酸性阳离子交换树脂柱纯化的纯化水洗脱液，其检测方法可以为“紫外光检测有荧光”、高效液相测定法(HPLC)、紫外-可见分光光度法、薄层色谱法等，比较简单的如“紫外光检测有荧光”方法：将洗脱液适量直接点于硅胶G薄层板上，挥干溶剂，紫外灯下观察是否有荧光。
本发明所制得的四水合辅羧酶质量控制方法及要求，可以为：
(1)、含量测定按照高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录VD)测定。
色谱条件与系统适用性试验用氨基硅烷键合硅胶为填充剂，0.1mol/L的磷酸氢二钾水溶液(用磷酸调pH至7.4)-甲醇(57∶43)为流动相，检测波长234nm。理论塔板数按四水合辅羧酶峰计算，应不低于1500。
测定法精密称取本品适量，用流动相制成每1ml中约含四水合辅羧酶200μg的溶液，作为供试品溶液；精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取四水合辅羧酶对照品，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。
按无水物计算，本品含C12H18N4O7P2S应为99.0％～101.0％。
(2)、有关物质取本品，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含四水合辅羧酶1.0mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程地20％～30％。再分别精密量取对照溶液与供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液的色谱图中如显杂质峰，最大杂质的峰面积不得过对照溶液的主峰面积的一半(0.5％)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液的主峰面积(1.0％)。
(3)、氯化物取本品0.25g，依法检查(中国药典2005年版二部附录VIII A)，与标准氯化钠溶液5.0ml制成的对照液比较，不得更浓(0.02％)。
(4)、游离磷酸准确称取本品0.20g，加丙酮10ml，强力振摇2分钟，过滤，滤液置于25ml量瓶中，滤渣用丙酮5ml洗涤，洗液并入上述量瓶中；另取标准磷酸盐溶液[准确称取经105℃干燥2小时的磷酸二氢钾0.42g，置1000ml量瓶中，加硫酸溶液(取3ml浓硫酸用水稀释到10ml溶液)10ml与水适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，临用时用丙酮再稀释10倍]10ml，置另一25ml量瓶中，加丙酮5ml；上述两量瓶中各加钼酸铵硫酸试液2.5ml与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液(取无水亚硫酸钠5g、亚硫酸氢钠94.3g与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸0.7g，充分混合，临用时取此混合物1.5g，加水10ml使溶解，必要时滤过)1ml，加水至刻度，摇匀，在20℃放置30分钟，照紫外-可见分光光度法(中国药典2005年版二部附录IV A)，在740nm的波长处测定吸光度，供试品溶液的吸光度不得大于对照溶液的吸光度(0.15％)。
(5)、水分取本品，按照水分测定法(中国药典2005年版二部附录VIII M第一法A)测定，含水分应为14.0％～16.0％。
【具体实施方式】
以下实施例只是更具体地说明本发明，本发明并不仅限于以下实施例的内容。
实施例1
将60g焦磷酸加入到反应器中，100℃搅拌1小时，加入20g维生素B1，再加热到120℃反应30分钟使固体完全溶解，加入五氧化二磷20g，搅拌反应至TLC检测原料点完全消失(展开剂：甲醇∶水∶乙酸＝2∶1∶0.5)，加水、乙醇溶液沉淀得到大量类白色固体析出，过滤。检测得到辅羧酶与维生素B1单磷酸酯、维生素B1三磷酸酯的混合物，取此混合物固体或溶于50ml纯化水中按以上操作重复一次，将固体溶于100ml纯化水中，2×100ml70％三辛胺甲基异丁基甲醇溶液萃取两次，取水溶液，装入100ml弱碱性阴离子交换树脂(D301)柱中，纯化水洗脱，将洗脱液直接引入1000ml强酸性阳离子交换树脂(732)中，纯化水洗脱，紫外检测洗脱液出现荧光时开始接收洗脱液，接收洗脱液至紫外检测洗脱液没有荧光时停止，洗脱液35℃减压浓缩，干燥得类白色固体14.8g，HPLC检测含量99.68％(按干品计算)，单个杂质0.23％，总杂质0.67％，水分15.04％，氯化物、游离磷酸指标符合质量要求，总收率45％，经1H-NMR、13C-NMR等结构确证与文献报道一致。
1H-NMR(400MHz，D2O)δ2.52(s，3H)，2.58(s，3H)，3.29(m，2H)，4.16(m，2H)，5.52(s，2H)，7.87(s，1H)9.61(s，1H)。13C-NMR(400MHz，D2O)δ10.92，20.77，27.39，49.72，64.48，106.30，135.63，143.09，144.04，154.72，162.75，163.03，mp222～225℃。
实施例2
将90g焦磷酸加入到反应器中，100℃充分搅拌1小时，加入20g维生素B1，加热到120℃反应30分钟，加入五氧化二磷40g，搅拌至TLC检测原料点完全消失，冷却，滴加入纯化水使形成透明溶液，加水、乙醇溶液沉淀得到大量类白色固体析出，过滤，取固体，所得固体溶于纯化水中，50％三辛胺异丙醚溶液萃取两次，取水溶液装入弱碱性阴离子交换树脂(D301)柱中，纯化水洗脱，将洗脱液直接引入强酸性阳离子交换树脂(732)中，纯化水洗脱，紫外检测洗脱液出现荧光时开始接收洗脱液，接收洗脱液至紫外检测洗脱液没有荧光时停止，洗脱液30℃减压浓缩，析出固体，过滤、干燥得类白色固体12.2g，HPLC检测含量99.74％(按干品计算)，单个杂质0.34％，总杂质0.74％，水分15.60％，氯化物、游离磷酸指标符合质量要求。
实施例3
将70g焦磷酸加入到反应器中，130℃充分搅拌1小时，加入20g维生素B1，再加热到140℃反应30分钟，加入三氯氧磷30g，搅拌反应至TLC检测原料点完全消失，冷却，滴加入纯化水使形成透明溶液，加水、乙醇溶液沉淀得到大量类白色固体析出，过滤，取固体，所得固体溶于纯化水中，三辛胺溶液萃取两次，取水溶液装入弱碱性阴离子交换树脂(D301)柱中，纯化水洗脱，将洗脱液直接引入强酸性阳离子交换树脂(732)中，纯化水洗脱，紫外检测洗脱液出现荧光时开始接收洗脱液，接收洗脱液至紫外检测洗脱液没有荧光时停止，洗脱液30℃减压浓缩，析出固体，过滤、干燥得类白色固体9.2g，HPLC检测含量99.54％(按干品计算)，单个杂质0.44％，总杂质0.94％，水分16.60％，氯化物、游离磷酸指标符合质量要求。
实施例4
将60kg焦磷酸加入到反应器中，130℃充分搅拌2小时，分批加入20kg维生素B1，再加热到140℃反应1小时，加入五氧化二磷20kg，搅拌反应至TLC检测原料点完全消失，冷却，加入纯化水使形成透明溶液，沉淀得到固体或溶于适量纯化水中按以上操作重复一次，将固体溶于纯化水中，70％三辛胺-甲基异丁基甲醇溶液萃取两次，取水溶液，装入弱碱性阴离子交换树脂(D301)柱中，纯化水洗脱，将洗脱液直接引入强酸性阳离子交换树脂(732)中，纯化水洗脱，紫外检测洗脱液出现荧光时开始接收洗脱液至紫外检测洗脱液没有荧光时停止，洗脱液35℃减压浓缩，析出固体，过滤、干燥得类白色固体9.5kg，HPLC检测含量99.22％(按干品计算)，单个杂质0.45％，总杂质0.67％，水分16.04％，氯化物、游离磷酸指标符合质量要求。
实施例5
将60g焦磷酸加入到反应器中，140℃充分搅拌1小时，加入20g维生素B1，再加热到160℃反应30分钟，加入三氯氧磷35g，搅拌反应至TLC检测原料点完全消失，冷却，滴加入纯化水使形成透明溶液，加水、乙醇溶液沉淀得到固体，或溶于纯化水中按以上操作重复一次，所得固体溶于纯化水中，80％三丁胺甲基异丁基甲醇溶液萃取1次，取水溶液装入弱碱性阴离子交换树脂(D303)柱中，纯化水洗脱，将洗脱液直接引入强酸性阳离子交换树脂(732)中，纯化水洗脱，紫外检测洗脱液出现荧光时开始接收洗脱液，接收洗脱液至紫外检测洗脱液没有荧光时停止，洗脱液30℃减压浓缩，析出固体，过滤、干燥得类白色固体7.2g，HPLC检测含量99.11％(按干品计算)，单个杂质0.35％，总杂质0.84％，水分16.20％，氯化物、游离磷酸指标符合质量要求。
实施例6
将80g焦磷酸加入到反应器中，130℃充分搅拌1小时，加入20g维生素B1，再加热到140℃反应30分钟，加入五氧化二磷35g，搅拌反应至TLC检测原料点完全消失，冷却，加入纯化水使形成透明溶液，加水、乙醇溶液沉淀得到固体。溶于纯化水中，水溶液用70％三辛胺甲基异丁基甲醇溶液萃取两次，取水溶液，装入弱碱性阴离子交换树脂(D301)柱中，纯化水洗脱，将洗脱液直接引入强酸性阳离子交换树脂(732)中，纯化水洗脱，紫外检测洗脱液出现荧光时开始接收洗脱液，接收洗脱液至紫外检测洗脱液没有荧光时停止，洗脱液35℃减压浓缩，析出固体，过滤、干燥得类白色固体7.5g，HPLC检测含量99.12％(按干品计算)，单个杂质0.46％，总杂质0.87％，水分16.22％，氯化物、游离磷酸指标符合质量要求。
实施例7
将650g焦磷酸加入到反应器中，100℃充分搅拌1小时，分批加入200g维生素B1，再加热到120℃反应30分钟，加入五氧化二磷230g，搅拌反应至TLC检测原料点完全消失，冷却，加入纯化水使形成透明溶液，加水、乙醇溶液沉淀得到固体，产物溶于纯化水中，用75％三辛胺甲基异丁基甲醇溶液萃取，取水溶液，装入弱碱性阴离子交换树脂(D303)柱中，纯化水洗脱，将洗脱液直接引入1000ml强酸性阳离子交换树脂(WK40)中，纯化水洗脱，紫外检测洗脱液出现荧光时开始接收洗脱液，洗脱液至紫外检测洗脱液没有荧光时停止接收，洗脱液30℃减压浓缩，析出固体，过滤，干燥得类白色固体73.6g，HPLC检测含量99.11％(按干品计算)，单个杂质0.43％，总杂质0.75％，水分15.64％，氯化物、游离磷酸指标符合质量要求，经结构确证与文献报道一致。
实施例8
将600g焦磷酸加入到反应器中，100℃充分搅拌1小时，加入200g维生素B1，再加热到120℃反应30分钟，加入五氧化二磷200g，搅拌反应至TLC检测原料点完全消失，冷却至40℃，加入纯化水使形成透明溶液，加水、乙醇溶液沉淀得到析出产物，过滤，取固体溶于纯化水中按以上操作重复一次，将所得固体溶于纯化水中，水溶液装入弱碱性阴离子交换树脂(D315)柱中，纯化水洗脱，将洗脱液减压浓缩后引入弱酸性阳离子交换树脂(HZD-2)中，纯化水洗脱，紫外检测洗脱液出现荧光时开始接收洗脱液至紫外检测洗脱液没有荧光时停止，洗脱液35℃减压浓缩，析出白色固体，过滤，干燥得类白色固体93.7g，HPLC检测含量99.18％(按干品计算)，单个杂质0.53％，总杂质0.87％，水分15.04％，氯化物、游离磷酸指标符合质量要求。
实施例9
将60g焦磷酸加入到反应器中，100℃充分搅拌1小时，加入20g维生素B1，再加热到120℃反应30分钟，加入三氯氧磷20g，搅拌反应至TLC检测原料点完全消失，冷却至30℃，滴加入纯化水使形成透明溶液，加水、乙醇溶液沉淀得到析出产物，过滤，取固体溶于纯化水中，按以上操作重复一次，所得固体溶于纯化水中，装入弱碱性阴离子交换树脂(D315)柱，纯化水洗脱，将洗脱液直接引入弱酸性阳离子交换树脂(HZD-2)，纯化水洗脱，紫外检测洗脱液出现荧光时开始接收洗脱液至紫外检测洗脱液没有荧光时停止，洗脱液35℃减压浓缩，析出固体，过滤，干燥得类白色固体11.3g，HPLC检测含量99.01％(按干品计算)，单个杂质0.66％，总杂质0.85％，水分15.04％，氯化物、游离磷酸指标符合质量要求。