纯化茶氨酸的方法.pdf

本发明提供了一种从含有主要阳离子并包含杂质的水溶液中纯化茶氨酸的方法。该方法包括步骤：将2-20％柱体积的量的所述水溶液添加到柱上，其中，该柱子由阳离子交换树脂装填，所述阳离子交换树脂具有与所述主要阳离子为相同的阳离子型的阳离子交换树脂填装；然后将pH为2.5至8.5的水性流动相添加到柱上，以先洗脱富含杂质的带，再洗脱富含茶氨酸的带；然后回收所述富含茶氨酸带的至少一个洗脱份。

1.  一种从含有主要阳离子并包含杂质的水溶液中纯化茶氨酸的方法，该方法包括以下步骤：
a.将2-20％柱体积(V_c)量(V_a)的所述水溶液添加到柱上，其中该柱子由阳离子交换树脂装填，所述阳离子交换树脂具有与所述主要阳离子相同的阳离子；然后
b.将pH为2.5至8.5的水性流动相添加到柱上，以先洗脱富含杂质的带，再洗脱富含茶氨酸的带；然后
c.回收所述富含茶氨酸带的至少一个洗脱份。

2.  根据权利要求1所述的方法，其中，所述水溶液的总固体含量为该溶液的至少2％重量，优选为至少5％，更优选为至少10％。

3.  根据权利要求2所述的方法，其中，所述总固体包含茶氨酸的量至少为该固体的1％重量。

4.  根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述杂质包括糖类、氨基酸或其混合物。

5.  根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述流动相的pH为4至7。

6.  根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，V_a为V_c的3-15％。

7.  根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述流动相为去离子水。

8.  根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述主要阳离子为钾(K⁺)。

9.  根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述水溶液为茶的水提取物。

10.  根据前述任一项权利要求所述的方法，包括以下附加步骤：
d.浓缩和/或干燥所述富含茶氨酸的带的至少一个洗脱份。

11.  根据权利要求10所述的方法，其中，所述至少一个洗脱份在步骤c和步骤d之间不经过膜过滤。

12.  根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述树脂为磺酸化聚苯乙烯树脂。

纯化茶氨酸的方法
技术领域
本发明涉及纯化氨基酸茶氨酸的方法。
背景技术
能够增强人体精神和身体方面的食物和饮料产品逐渐受到欢迎。特别地，能够增强精神敏锐状态的产品尤其具有商业价值。
茶氨酸是一种在植物界中仅在茶叶(茶树(Camellia sinensis))中被发现的氨基酸。已发现茶氨酸具有多种对人体和精神有益的效果。例如，据报道茶氨酸刺激哺乳动物大脑的α-波，使得个体在放松的情况下还能保持灵敏的精神状态。在特定的剂量水平下，这些生理效果尤其明显。例如，国际专利申请PCT/EP2005/012464(Unilever PLC等)描述了包含特定水平的茶氨酸和咖啡因的可食用的组合物，其显示出使得服用该组合物的个体的专注度、精神集中和/或灵敏性明显改善。
尽管茶叶中相对富含茶氨酸，事实上，茶氨酸仅占茶树材料中可提取的茶固体的大约2％重量。因此，已经研发出合成的茶氨酸(例如TaiyoKagaku生产的Suntheanine^TM)来满足对于具有增强的茶氨酸水平的产品的日益增长的需求。
但是，现代的消费者特别喜欢天然健康的饮料，这已经成为了现代健康生活方式的一部分。茶特别符合这种观念，尤其是考虑到其天然抗氧化剂的含量。因此，需要提供在不添加合成化合物的情况下浓缩天然存在的茶氨酸的方法。
在为了实现这种需求的尝试中，已经发展了使用膜过滤来浓缩茶提取物中的茶氨酸的方法。例如，国际专利申请PCT/EP2005/010376公开了提供富含茶氨酸的茶提取物的方法，包括以下步骤：使用冷水提取茶树材料，然后对提取物进行纳米过滤步骤。该方法产生了包含富含茶氨酸的茶固体的透过液(permeate)。
但是我们发现，即使是这样的透过液也包含相当大量的杂质。特别地，例如糖类和氨基酸的杂质被证明难于从透过液中去除，这是由于它们在物理化学性质上与茶氨酸相似。此外，一些杂质的存在使得常规的透过液的常规干燥(例如喷雾干燥)变得特别困难。
美国专利申请公布US 2005/0084544(Procter&Gamble Co.Inc.)描述了将茶提取物与吸收多酚材料的材料相接触的方法。这个方法产生的富含茶氨酸的提取物基本上不含多酚。但是，在这种情况下，提取物中仍然存在许多需要通过进一步的过滤步骤来去除的杂质。
美国专利5,922,380(Ito En Ltd.)公开了将茶提取物与阳离子交换树脂相接触的方法，该阳离子交换树脂与钾离子通过离子键合。该方法的目的在于从茶提取物中去除二价金属离子，同时保留对茶的香味有贡献的其它组分。因此，该方法包括在唯一的分离机制为阳离子交换的条件下使提取物流过由树脂装填的柱子。因此，US 5,922,380中的方法将不会使得茶氨酸与非多价金属离子的任何杂质分离开。
因此，我们认识到需要提供一种从包含杂质(包括一些中性和/或阴离子杂质)的混合物中纯化茶氨酸的简单的方法。我们还认识到需要提供一种不需要使用合成化合物和/或有机溶剂的这样的方法。
定义
杂质
此处所使用的术语“杂质”是指除茶氨酸或水以外的物质。
主要阳离子
溶液中的主要阳离子是指比溶液中其它任何阳离子的摩尔浓度高的溶液中存在的阳离子。
富含杂质的带
富含杂质的带是指一种色谱带，其中，杂质的浓度(表示为带中总固体的百分比)比此方法刚开始时水溶液中杂质的浓度(表示为水溶液中总固体的百分比)高。
富含茶氨酸的带
富含茶氨酸的带是指一种色谱带，其中，茶氨酸的浓度(表示为带中总固体的百分比)比此方法刚开始时水溶液中茶氨酸的浓度(表示为水溶液中总固体的百分比)高。
茶提取物
此处所使用的术语“茶提取物”是指来自中国茶(Camellia sinensisvar.sinensis)和/或普洱茶(Camellia sinensis var.assamica)的叶和/或茎的干物质。叶和/或茎可以经过了所谓的“发酵”步骤，其中，它们被某些在生产“红茶”的早期阶段释放的内源性酶氧化。该氧化甚至还可以通过外源性酶(例如氧化酶、漆酶和过氧化物酶)的作用进行补充。可选地，茶叶可以是经过部分发酵的(“乌龙”茶)或者基本上不发酵的(“绿茶”)。
色谱术语
术语“流动相”、“柱子”、“柱体积”、“洗脱”和“带(zone)”为《Compendium of Analytical Nomenclature：Definitive Rules 1997》IUPAC第三版第九章中定义的标准色谱术语。
发明内容
本发明提供了一种从含有主要阳离子并包含杂质的水溶液中纯化茶氨酸的方法，该方法包括以下步骤：
a.将2-20％柱体积(V_c)的量(V_a)的所述水溶液添加到柱上，其中，该柱子由阳离子交换树脂装填，所述阳离子交换树脂具有与所述主要阳离子相同的阳离子；然后
b.将pH为2.5至8.5的水性流动相添加到柱上，以先洗脱富含杂质的带，再洗脱富含茶氨酸的带；然后
c.回收所述富含茶氨酸带的至少一个洗脱份(fraction)；然后
d.任选地浓缩和/或干燥所述富含茶氨酸带的至少一个洗脱份。
按照描述进行该方法的操作确保了主要的分离机理为离子排斥分离机理，并使得茶氨酸和杂质分离在实质上不同的带中。
具体实施方式
用于纯化茶氨酸的水溶液包含杂质。杂质可以包括阳离子、阴离子、中性分子或其混合物。典型地，杂质将包括糖类、氨基酸或其混合物。糖类可以为单糖、二糖、寡糖、多糖或其混合物。杂质还可以另外地或可选地包含多酚、咖啡因或其混合物。
茶氨酸优选来自天然来源。最优选的茶氨酸来源为茶叶。因此，在一个优选实施方式中，水溶液为茶的水提取物。特别优选的是，茶提取物为红茶提取物。可以通过使用水直接提取茶叶来提供茶的水提取物。可选地，茶的水提取物在提取之后可以经过一个或更多个纯化和/或浓缩步骤。例如，茶提取物可以使用PCT/EP2005/010376中的方法进行纳米过滤，在此引入PCT/EP2005/010376作为参考。
所述水溶液将包含一种或多种阳离子。在大多数情况下(特别是如果水溶液是茶的水提取物)，主要阳离子是钾(K⁺)。
优选地，所述水溶液基本上不含多价阳离子。多价阳离子很难从树脂上去除，因此污染了柱子，使得树脂的寿命变短。因此，所述水溶液优选包含多于溶液中阳离子的80％重量的单价阳离子，更优选多于90％，最优选为95％至99.99％。
因为添加到柱上的水溶液的量相对较小，所述溶液优选包含高固体含量，以使分离效率最大化，并使待去除的水的量最小化-如果步骤c之后需要干燥洗脱份的话。因此，水溶液包含的总固体含量优选为溶液的至少2％重量，更优选为至少5％，最优选为至少10％。但是，固体含量不应该太高，否则样品会变得太粘，以及/或者在分离过程中，可能会产生不溶物形成的问题。因此，固体含量优选小于溶液的50％重量，更优选小于40％，最优选小于30％。
为了使茶氨酸的产率最大化，总固体包含的茶氨酸的量优选为固体的至少1％重量，更优选为至少2％，更优选为至少4％，最优选为至少6％。典型地，总固体包含小于固体的80％重量的茶氨酸。该方法特别适于从水溶液中纯化茶氨酸，其中，总固体包含小于总固体的60％重量或者甚至小于40％的茶氨酸。
为了确保分离机理为离子排斥分离机理，茶氨酸在接近其pI的pH下洗脱。因此水溶液的pH范围优选为2.5至8.5，更优选为3.5至7.5，更优选为4至7，最优选为5至6。尤其重要的是，如果流动相不是缓冲的，溶液的pH在这些范围内。
将2-20％柱体积(V_c)的量(V_a)的所述水溶液添加到柱上。这确保了水溶液仅占柱子的一小部分，因此使得在洗脱时茶氨酸和杂质分离开。但是，该量也不应该太小，否则会损害该方法的效率。V_a优选为V_c的3-15％，更优选为5-10％。
柱子由具有与主要阳离子相同阳离子的阳离子交换树脂装填。通常这意味着树脂为钾(K⁺)形式。
合适的树脂包括那些包含用于阳离子交换的官能团的树脂，该官能团例如磺酸基(-SO₃M)、磷酸基(-PO(OM)₂)或羧基(-COOM)；其中，M为主要阳离子。特别优选的是包含磺酸基的树脂，例如磺酸化聚苯乙烯树脂。这样的树脂包括苯乙烯-二乙烯苯共聚物树脂。合适的市售树脂包括Diaion^TM UBK系列，包括UBK530、UBK535、UBK550和OBK555(由Mitsubishi Kagaku Co.制造)。
一旦添加水溶液到柱上之后，接着添加水性流动相来洗脱该溶液。为了将茶氨酸和杂质进行分离，需要流动相的组成不同于所述水溶液的组成。特别地，流动相应该基本上不含茶氨酸。优选地，流动相包含的茶氨酸应该小于流动相的0.01％重量，更优选小于0.001％，最优选小于0.0001％。
水性流动相的pH为2.5至8.5，以保证茶氨酸为中性形式。流动相的pH优选为3.5至7.5，更优选为4至7，最优选为5至6。如果水溶液是强酸性或碱性(例如pH在2.5至8.5的范围之外)，那么可能需要流动相是缓冲的。在这种情况下，流动相将会包含缓冲盐。例如，流动相可以包含磷酸盐缓冲液。
但是，优选避免使用任何化学添加剂。因此，在一个优选实施方式中，流动相是基本上纯的水。例如，流动相可以包含小于1000ppm的总固体，更优选小于500ppm，最优选为1ppm至100ppm。在一个特别优选的实施方式中，流动相为去离子水。
流动相还优选基本上不含多价阳离子。多价阳离子难于从树脂上去除，因此污染了柱子，使得树脂的寿命变短。因此，流动相包含的单价阳离子优选多于流动相中阳离子的80％重量，更优选多于90％，最优选为95-99.99％。
为了避免柱中形成可能干扰分离的空气气泡，在加到柱之前，流动相优选经过除气处理。可以使用任何已知的除气方式，包括超声处理或使用水不溶性气体(例如氮气)进行鼓泡处理。
当流动相沿着柱子向下流动时，中性的茶氨酸流动缓慢，以及/或者较弱地吸附在树脂上，而其它不同大小和/或电荷的分子从树脂上流出。因此，富含杂质的带在富含茶氨酸的带之前形成。
优选在较高温度下洗脱这些带，以降低相对浓缩的带的粘性对流速的影响。典型地，温度的范围为45至90℃，更优选为55至80℃。
使用高温还降低了微生物污染柱子的危险。
该方法的下一步涉及回收富含茶氨酸的带的至少一个洗脱份。典型地，这是通过收集从柱上流出的洗脱液的份并保留那些包含显著量的茶氨酸的洗脱份实现的。当收集多个洗脱份时，它们可以被集中在一起。
通常弃去富含杂质的带的洗脱份。但是，如果这个带富含有价值的杂质，例如多酚类，那么该方法可以包括一个附加步骤来回收富含杂质的带的至少一个洗脱份。
在c步骤中回收的富含茶氨酸的带的至少一个洗脱份可以直接使用，无需进一步处理。例如，它可被直接添加到食物或饮料产品中。特别地，由于高效的分离，在使用和/或干燥之前通常不需要进一步纯化洗脱份，例如无需使用膜过滤步骤纯化。
在一个优选实施方式中，所述富含茶氨酸带的至少一个洗脱份被浓缩和/或干燥。这使得洗脱份可被长期稳定地储存。典型地，干燥洗脱份到湿度小于20％重量，更优选小于10％和最优选为1-7％的湿度。
实施例
实施例1
该实施例显示了从浓缩的茶的水提取物中纯化茶氨酸。
茶的水提取物的制备：
用水提取红茶的碎混合茶末(Broken mixed fannings，BMF)。离心、纳米过滤和干燥产生的提取物来产生茶提取物，其包含6wt％茶氨酸、16wt％单糖和二糖、15wt％灰分、6wt％多酚、6wt％茶氨酸以外的氨基酸和4wt％咖啡因。
然后将茶提取物重新溶于水中，使用5μm滤纸进行过滤，产生的茶的水提取物的总固体含量为20wt％和pH为4.85。
柱制备：
使用的树脂为K⁺形式的Diaion^TM UBK550。这种树脂为一种珠子形式的磺酸化聚苯乙烯聚合物，具有窄的大小分布，平均直径为220μm。
柱子半装有除气的去离子水。然后添加树脂，使用热水通过柱子循环30分钟来调节树脂水平。
然后填装柱子。这是通过两次洗脱实现的，无需任何采样或数据记录，使用的流速为每小时4V_c。在注射产品然后再注射水之后，由于树脂的膨胀和收缩造成了紧压状态。在两次洗脱之后，通过调节柱塞来调节树脂水平达到柱顶部。
填装的柱子的高度为113cm，直径为1.5cm。因此柱体积(V_c)为200ml。柱子配有一个水套，并维持在60℃的温度。
提取物的分离：
将9ml(0.05V_c)量的茶提取物注射到柱上。然后以每分钟5ml的速率(每小时1.5V_c)泵送流动相(除气的去离子水)使其通过柱子。柱子的输出端与一个分部收集器相连，每分钟(相当于每0.025V_c的洗脱产物)收集一个新鲜的洗脱份。分析每个洗脱份的总固体(使用Bellingham&Stanley RFM 3000折射计的Brix测量仪)和茶氨酸(使用高效液相色谱法)含量。结果示于表1。
表1