ML00253764作为制备治疗由黑素皮质素受体4突变体引起的肥胖症药物的应用.pdf

1、10申请公布号CN104127411A43申请公布日20141105CN104127411A21申请号201410312016622申请日20140701A61K31/4164200601A61P3/0420060171申请人天津科技大学地址300457天津市滨海新区经济技术开发区十三大街29号72发明人樊振川郁彭王小花王浩猛74专利代理机构天津盛理知识产权代理有限公司12209代理人赵瑶瑶54发明名称ML00253764作为制备治疗由黑素皮质素受体4突变体引起的肥胖症药物的应用57摘要本发明涉及一种ML00253764作为制备治疗由黑素皮质素受体4突变体引起的肥胖症药物的应用。所述化合物ML

2、00253764作为制备治疗由人黑素皮质素受体4突变而引发的早发性肥胖的药物。本发明首次发现ML002537642225溴2甲氧基苯基乙基3氟苯基4,5二氢1H咪唑为人黑素皮质素受体4的药学伴侣分子。具有较好的恢复细胞膜定位缺陷的人黑素皮质素受体4突变体的细胞膜表达能力和恢复突变体信号分子的产生能力，可应用于制备个性化抗肥胖药物用以治疗由MC4R突变引起的早发性肥胖。51INTCL权利要求书1页说明书9页序列表4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书9页序列表4页10申请公布号CN104127411ACN104127411A1/1页21ML00253764作为制

3、备治疗由黑素皮质素受体4突变体引起的肥胖症药物的应用。2根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述化合物ML00253764作为制备治疗由人黑素皮质素受体4突变而引发的早发性肥胖的药物。3根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述ML00253764的化学学名为2225溴2甲氧基苯基乙基3氟苯基4,5二氢1H咪唑；所述ML00253764的化学结构式为4根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述ML00253764在制备治疗细胞内运送缺陷的人黑素皮质素受体4突变体引发的早发性肥胖药物中的应用。权利要求书CN104127411A1/9页3ML00253764作为制备治疗由黑素皮质素受体4突变体引起的肥

4、胖症药物的应用技术领域0001本发明涉及药物领域，具体是一种小分子咪唑衍生物ML00253764作为药学伴侣分子功能拯救黑素皮质素受体4突变体及其在制备抗肥胖药物中的应用，即ML00253764作为制备治疗由黑素皮质素受体4突变体引起的肥胖症药物的应用。背景技术0002肥胖作为一种营养代谢病可引发诸如高血压、型糖尿病、中风、冠状动脉病甚至癌症等，业已成为全世界最显著的公共健康问题之一。证据表明瘦素赤黑素通路LEPTINMELANOCORTINPATHWAY在控制体重中起着关键的作用。其中，黑素皮质素受体4MELANOCORTIN4RECEPTOR，MC4R作为一个典型的G蛋白偶联受体GPROT

5、EINCOUPLEDRECEPTOR，GPCR，为该信号通路中的下游关键调控因子。目前，人类遗传学研究表明MC4R基因编码区突变代表了最频繁出现的单基因突变导致早发性肥胖的病例。据估算，人类约有6的早发性肥胖病例是由MC4R突变引起的。MC4R和刺激性G蛋白STIMULATORYGPROTEIN，GS耦合，在激素作用下激活腺苷酸环化酶，从而增加胞内环化腺苷酸CAMP的水平，且其活性受内源激动剂AGONIST黑素细胞刺激素MSH和内源拮抗剂ANTAGONIST刺鼠相关蛋白AGRP之间微妙的平衡调节。迄今为止，在具有不同种族背景的肥胖患者中已临床鉴定出超过150个突变MC4R。其中，70的突变受体

6、胞内运送功能发生异常，其结果是突变受体不能或不能高效率地运送到其功能位点细胞膜。0003人类的许多疾病包括色素性视网膜炎，肾性尿崩症，性腺功能减退症，先天性巨结肠病以及肥胖等1,2,3都可能是由突变导致的G蛋白耦联受体产生胞内滞留而引起。正因为许多突变受体可能不影响受/配体结合、信号分子产生和信号传导，一旦被成功运送到细胞膜上，它们就可能顺利的结合配体并传导信号。目前，药理伴侣分子PHARMACOLOGICALCHAPERONE，通常是G蛋白耦联受体的非肽类小分子拮抗剂，已被作为一种可能的选择性药物来治疗许多遗传性疾病。这些分子可以辅助G蛋白耦联受体突变体折叠形成正确的构象，从而使它们顺利运送

7、到细胞膜。到目前为止，人们发现药理伴侣分子可以功能拯救视紫红质受体RHODOPSINRECEPTOR突变体、促性腺激素释放激素受体GNRHR突变体4,5,6,7,8、黑色素浓集激素1型受体MCHR1突变体、V1A、V1B和V2R加压素受体VASOPRESSINRECEPTOR突变体以及实验室产生的和阿片受体OPIOIDRECEPTOR突变体等5,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。值得一提的是，非肽类小分子拮抗剂SR49059已经临床证明能减少由V2R突变体导致的肾性尿崩症病人的尿量和饮水量，从而表明了药理伴侣分子的药物效用。0004非肽类小分子2225溴2甲氧基苯基乙基

8、3氟苯基4,5二氢1H咪唑ML00253764是专门针对MC4R开发的受体拮抗剂。后来的研究证明ML00253764实际上是MC4R的逆激动剂INVERSEAGONIST。2009年，我们首次报道了ML00253764作为MC4R受体的药理伴侣分子，可以拯救两个MC4R突变体包括C84R和说明书CN104127411A2/9页4W174C的细胞表面表达和信号传导19。2010年，其他研究组利用免疫荧光显微镜检测法发现ML00253764还能够部分恢复其它六个MC4R突变体包括S58C，N62S，P78L，G98R，C271Y和F261S的细胞表面表达20。然而，这些研究并没有进行ML00253

9、764恢复MC4R突变体细胞膜表面表达的药理学特性分析和获得拯救的突变受体的功能及药理学分析。2010年，另外两个研究小组报道了其它六个非肽类小分子包括APB21，MTHP，PPPONE，MPCI，DCPMP和NBP22也可充当MC4R突变体的药理伴侣分子，从而恢复了MC4R突变体包括P78L，R165W，I316S，I317T21及S58C，E61K，N62S，I69T，I125K，T162I，R165Q，R165W，C271Y和P99H22的细胞膜表达及信号分子的产生。然而，这两项研究同样只提供了一个并不完整的针对药学伴侣分子和获拯救受体突变体的药理学和功能分析。因此，进行一个全面的针对M

10、C4R药理伴侣分子本身和被拯救受体突变体的功能和药理特性研究，从而确定其在以MC4R突变体为靶点的个性化抗肥胖药物的开发中就变得非常重要。发明内容0005本发明的目的是提供一种ML00253764作为制备治疗由黑素皮质素受体4突变体引起的肥胖症药物的应用，其中ML002537642225溴2甲氧基苯基乙基3氟苯基4,5二氢1H咪唑特异性恢复黑素皮质素受体4突变体细胞表面表达及激活信号分子产生的功能依据及其在制备以MC4R突变体为靶点的个性化抗肥胖药物中的应用。0006本发明的目的通过以下技术方案实现的0007ML00253764作为制备治疗由黑素皮质素受体4突变体引起的肥胖症药物的应用。000

11、8而且，所述化合物ML00253764作为制备治疗由人黑素皮质素受体4突变而引发的早发性肥胖的药物。0009而且，所述ML00253764的化学学名为2225溴2甲氧基苯基乙基3氟苯基4,5二氢1H咪唑；所述ML00253764的化学结构式为00100011而且，所述ML00253764在制备治疗细胞内运送缺陷的人黑素皮质素受体4突变体引发的早发性肥胖药物中的应用。0012本发明的优点和积极效果00131、本发明首次发现ML002537642225溴2甲氧基苯基乙基3氟苯基4,5二氢1H咪唑为人黑素皮质素受体4的药学伴侣分子。具有较好的恢复细胞膜定位缺陷的人黑素皮质素受体4突变体的细胞膜表达能

12、力和恢复突变体信号分子的产生能力，可应用于制备个性化抗肥胖药物用以治疗由MC4R突变引起的早发性肥胖。00142、本申请所述ML002537642225溴2甲氧基苯基乙基3氟苯说明书CN104127411A3/9页5基4,5二氢1H咪唑对6种人黑素皮质素受体4突变体包括N62S23，P78L24，C84R25，G98R26，W174C27和C271Y28细胞膜表达拯救测试结果表明该小分子的EC50G98RN62SW174CP78LC84R。设定未用ML00253764处理的MC4R野生型WT的表达水平为100，发现MC4R突变体的细胞表面表达效率具有较强的突变体特异性，其表达水平变化范围为82

13、2，然而用ML00253764处理后，所有突变受体的细胞表面表达效率升高到3674。即使对于野生型WT受体，ML00253764处理后的细胞表面表达效率也从100升高到156。综上可知ML00253764可以显著的提高MC4R六个胞内留存型突变体的细胞表面表达。0093表1ML00253764处理后人MC4R突变受体细胞膜表面表达水平的测定009400950096备注表示与未用ML00235764处理的MC4R野生型WT受体对照相比，突变受体的细胞膜表达水平具有显著性差异，PC84RN62SW174CG98RC271Y，表明ML00235764对MC4R突变体的拯救能力具有突变体特异性特征。此

14、外，利用104M的ML00235764作用于突变体，分别处理不同的时间，通过FACS测定细胞表面表达发现六种突变体的有效中时间T1/2的大小顺序为N62SC271YP78LC84RG98RW174C，即ML00235764对MC4R突变体的拯救能力还具有时间依赖型特征。综上，ML00235764介导的MC4R突变体细胞表面表达恢复能力同时具有时间依赖型和剂量依赖型特征。0098表2ML00235764介导的MC4R突变体细胞表面表达水平的恢复00990100备注数据以多次实验N的SEM方式表示，EC50代表每种突变受体的细胞表面表达水平达到最大值的50时，ML00235764的浓度。T1/2表

15、示每种突变受体的细胞表面表达水平达到最大值的50时的速率。01013表3为本发明实施例4中ML00235764介导的MC4R突变体激活信号分子进行功能拯救及药理学分析结果。为了解ML00235764处理后，MC4R突变受体包括N62S，P78L，C84R，G98R，W174C和C271Y能否对受体激动剂MSH的刺激做出响应，本发明中以10M的ML00253764作用WT或突变受体12H，再加入1M的MSH，测定其细胞内信号分子CAMP的积累水平。结果显示，与未用ML00253764处理的野生型WT受体相比，除G98R外的所有突变受体的最大信号能力EMAX都增强到80左右。利用ML0025376

16、4处理后的WT及突变受体之间的组成活性，即基础的CAMP积累水平并无显著性差异，但是与未用ML00253764处理的MC4RWT相比，其基础活性都有所降低，证明ML00253764是作为MC4R的反向激动剂发挥作用。综上除G98R外，其余五个MC4R突变受体均未影响配体结合率或信号传导功能，在被ML00253764拯救后，受体能成功运送到细胞膜上，对受体激动剂MSH刺激做出响应，使信号传导功能恢复到不同的水平。研究中进一步用不同浓度的MSH105M1011M处理，测定CAMP的积累量，以更好的了解ML00253764作用下10M，12H突变受体包括N62S，P78L，C84R，W174C和C2

17、71Y的药理学特性。结果显示与未用ML00253764处理的WT相比，处理后的WT与突变体的剂量响应曲线都发生了右移，EC50的值提高1020倍，且W174CP78LC84RC271YN62SWT。这是在加入MSH前清洗5次后的测定结果，进一步证明ML00253764和MSH与MC4R受体的结合位点相同，即二者是竞争性关系。0102表3ML00253764处理MC4RWT及突变体的药理学分析说明书CN104127411A109/9页1101030104备注表示以未用ML00253764处理的MC4R野生型WT为对照，突变受体的CAMP产生水平具有显著性差异，P005。表示以未用ML002537

18、64处理的MC4R野生型WT为对照，突变受体的CAMP产生水平具有显著性差异，P001。数据以多次实验N的SEM方式表示，以未用ML00253764处理的MC4R野生型WT的EMAX为对照，以9次实验结果计算所得。EC50代表每种受体CAMP水平达到最大值的50时，MSH的浓度。未用ML00253764处理的MC4R野生型WT的EMAX和基础活性都设为100。说明书CN104127411A111/4页1200010002序列表CN104127411A122/4页130003序列表CN104127411A133/4页140004序列表CN104127411A144/4页15序列表CN104127411A15