ML00253764作为制备治疗由黑素皮质素受体4突变体引起的肥胖症药物的应用.pdf

本发明涉及一种ML00253764作为制备治疗由黑素皮质素受体-4突变体引起的肥胖症药物的应用。所述化合物ML00253764作为制备治疗由人黑素皮质素受体-4突变而引发的早发性肥胖的药物。本发明首次发现ML00253764(2-[2-[2-(5-溴-2-甲氧基苯基)-乙基]-3-氟苯基]-4,5-二氢-1H-咪唑)为人黑素皮质素受体-4的药学伴侣分子。具有较好的恢复细胞膜定位缺陷的人黑素皮质素受体-4突变体的细胞膜表达能力和恢复突变体信号分子的产生能力，可应用于制备个性化抗肥胖药物用以治疗由MC4R突变引起的早发性肥胖。

1.  ML00253764作为制备治疗由黑素皮质素受体-4突变体引起的肥胖症药物的应用。

2.  根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述化合物ML00253764作为制备治疗由人黑素皮质素受体-4突变而引发的早发性肥胖的药物。

3.  根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述ML00253764的化学学名为2-[2-[2-(5-溴-2-甲氧基苯基)-乙基]-3-氟苯基]-4,5-二氢-1H-咪唑；所述ML00253764的化学结构式为：


4.  根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述ML00253764在制备治疗细胞内运送缺陷的人黑素皮质素受体-4突变体引发的早发性肥胖药物中的应用。

ML00253764作为制备治疗由黑素皮质素受体-4突变体引起的肥胖症药物的应用
技术领域
本发明涉及药物领域，具体是一种小分子咪唑衍生物ML00253764作为药学伴侣分子功能拯救黑素皮质素受体-4突变体及其在制备抗肥胖药物中的应用，即ML00253764作为制备治疗由黑素皮质素受体-4突变体引起的肥胖症药物的应用。 
背景技术
肥胖作为一种营养代谢病可引发诸如高血压、Ⅱ型糖尿病、中风、冠状动脉病甚至癌症等，业已成为全世界最显著的公共健康问题之一。证据表明瘦素-赤黑素通路(Leptin-melanocortinpathway)在控制体重中起着关键的作用。其中，黑素皮质素受体-4(Melanocortin-4receptor，MC4R)作为一个典型的G蛋白偶联受体(Gprotein-coupledreceptor，GPCR)，为该信号通路中的下游关键调控因子。目前，人类遗传学研究表明MC4R基因编码区突变代表了最频繁出现的单基因突变导致早发性肥胖的病例。据估算，人类约有6％的早发性肥胖病例是由MC4R突变引起的。MC4R和刺激性G蛋白(StimulatoryGprotein，G_S)耦合，在激素作用下激活腺苷酸环化酶，从而增加胞内环化腺苷酸(cAMP)的水平，且其活性受内源激动剂(Agonist)α-黑素细胞刺激素(α-MSH)和内源拮抗剂(Antagonist)刺鼠相关蛋白(AgRP)之间微妙的平衡调节。迄今为止，在具有不同种族背景的肥胖患者中已临床鉴定出超过150个突变MC4R。其中，70％的突变受体胞内运送功能发生异常，其结果是突变受体不能或不能高效率地运送到其功能位点-细胞膜。 
人类的许多疾病包括色素性视网膜炎，肾性尿崩症，性腺功能减退症，先天性巨结肠病以及肥胖等[1,2,3]都可能是由突变导致的G蛋白耦联受体产生胞内滞留而引起。正因为许多突变受体可能不影响受/配体结合、信号分子产生和信号传导，一旦被成功运送到细胞膜上，它们就可能顺利的结合配体并传导信号。目前，药理伴侣分子(Pharmacologicalchaperone)，通常是G蛋白耦联受体的非肽类小分子拮抗剂，已被作为一种可能的选择性药物来治疗许多遗传性疾病。这些分子可以辅助G蛋白耦联受体突变体折叠形成正确的构象，从而使它们顺利运送到细胞膜。到目前为止，人们发现药理伴侣分子可以功能拯救视紫红质受体(Rhodopsinreceptor)突变体、促性腺激素释放激素受体(GnRHR)突变体[4,5,6,7,8]、黑色素浓集激素1型受体(MCHR1)突变体、V1a、V1b和V2R加压素受 体(Vasopressinreceptor)突变体以及实验室产生的μ-和δ-阿片受体(Opioidreceptor)突变体等[5,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]。值得一提的是，非肽类小分子拮抗剂SR49059已经临床证明能减少由V2R突变体导致的肾性尿崩症病人的尿量和饮水量，从而表明了药理伴侣分子的药物效用。 
非肽类小分子2-[2-[2-(5-溴-2-甲氧基苯基)-乙基]-3-氟苯基]-4,5-二氢-1H-咪唑(ML00253764)是专门针对MC4R开发的受体拮抗剂。后来的研究证明ML00253764实际上是MC4R的逆激动剂(inverseagonist)。2009年，我们首次报道了ML00253764作为MC4R受体的药理伴侣分子，可以拯救两个MC4R突变体(包括C84R和W174C)的细胞表面表达和信号传导[19]。2010年，其他研究组利用免疫荧光显微镜检测法发现ML00253764还能够部分恢复其它六个MC4R突变体(包括S58C，N62S，P78L，G98R，C271Y和F261S)的细胞表面表达[20]。然而，这些研究并没有进行ML00253764恢复MC4R突变体细胞膜表面表达的药理学特性分析和获得拯救的突变受体的功能及药理学分析。2010年，另外两个研究小组报道了其它六个非肽类小分子(包括APB[21]，MTHP，PPPone，MPCI，DCPMP和NBP[22])也可充当MC4R突变体的药理伴侣分子，从而恢复了MC4R突变体(包括P78L，R165W，I316S，I317T[21]及S58C，E61K，N62S，I69T，I125K，T162I，R165Q，R165W，C271Y和P99H[22])的细胞膜表达及信号分子的产生。然而，这两项研究同样只提供了一个并不完整的针对药学伴侣分子和获拯救受体突变体的药理学和功能分析。因此，进行一个全面的针对MC4R药理伴侣分子本身和被拯救受体突变体的功能和药理特性研究，从而确定其在以MC4R突变体为靶点的个性化抗肥胖药物的开发中就变得非常重要。 
发明内容
本发明的目的是提供一种ML00253764作为制备治疗由黑素皮质素受体-4突变体引起的肥胖症药物的应用，其中ML00253764(2-[2-[2-(5-溴-2-甲氧基苯基)-乙基]-3-氟苯基]-4,5-二氢-1H-咪唑)特异性恢复黑素皮质素受体-4突变体细胞表面表达及激活信号分子产生的功能依据及其在制备以MC4R突变体为靶点的个性化抗肥胖药物中的应用。 
本发明的目的通过以下技术方案实现的： 
ML00253764作为制备治疗由黑素皮质素受体-4突变体引起的肥胖症药物的应用。 
而且，所述化合物ML00253764作为制备治疗由人黑素皮质素受体-4突变而引发的早发性肥胖的药物。 
而且，所述ML00253764的化学学名为2-[2-[2-(5-溴-2-甲氧基苯基)-乙基]-3-氟苯基]-4,5-二氢-1H-咪唑；所述ML00253764的化学结构式为： 

而且，所述ML00253764在制备治疗细胞内运送缺陷的人黑素皮质素受体-4突变体引发的早发性肥胖药物中的应用。 
本发明的优点和积极效果： 
1、本发明首次发现ML00253764(2-[2-[2-(5-溴-2-甲氧基苯基)-乙基]-3-氟苯基]-4,5-二氢-1H-咪唑)为人黑素皮质素受体-4的药学伴侣分子。具有较好的恢复细胞膜定位缺陷的人黑素皮质素受体-4突变体的细胞膜表达能力和恢复突变体信号分子的产生能力，可应用于制备个性化抗肥胖药物用以治疗由MC4R突变引起的早发性肥胖。 
2、本申请所述ML00253764(2-[2-[2-(5-溴-2-甲氧基苯基)-乙基]-3-氟苯基]-4,5-二氢-1H-咪唑)对6种人黑素皮质素受体-4突变体(包括N62S[23]，P78L[24]，C84R[25]，G98R[26]，W174C[27]和C271Y[28])细胞膜表达拯救测试结果表明该小分子的EC₅₀<10μM。拯救后的5种受体突变体(包括N62S，P78L，C84R，W174C和C271Y)的信号分子产生EC₅₀<0.1μM。因此，ML00253764(2-[2-[2-(5-溴-2-甲氧基苯基)-乙基]-3-氟苯基]-4,5-二氢-1H-咪唑)在治疗由于人黑素皮质素受体-4突变体细胞膜表达缺陷所引发的早发性肥胖的药物开发与应用方面具有广阔的前景。 
3、本发明利用ML00253764(2-[2-[2-(5-溴-2-甲氧基苯基)-乙基]-3-氟苯基]-4,5-二氢-1H-咪唑)，在人肾胚胎细胞HEK293中功能拯救6种不同细胞膜表达缺陷的人黑素皮质素受体-4，该小分子药理伴侣分子拯救黑素皮质素受体-4突变体的细胞膜表达EC₅₀小于10μM，其中5种细胞膜表达被拯救的黑素皮质素受体-4突变体的信号分子产生能力EC₅₀小于0.1μM。 
具体实施方式
为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。 
ML00253764(2-[2-[2-(5-溴-2-甲氧基苯基)-乙基]-3-氟苯基]-4,5-二氢-1H-咪唑)的结构通式如下： 

本发明选取商用质粒pcDNA3.1(+)作为表达载体，构建了野生型(WT)人黑素皮质素受体-4(MC4R)的表达载体：pcDNA3.1-HA-MC4R。即在pcDNA3.1(+)的多克隆位点插入了一个N端HA标记的人黑素皮质素受体-4基因编码区的表达序列，其中HA为流感病毒血凝素序列。 
本发明以构建好的野生型pcDNA3.1-HA-MC4R为模板，利用点突变技术构建了6个(N62S，P78L，C84R，G98R，W174C和C271Y)已经临床鉴定的细胞膜表达缺陷黑素皮质素受体-4突变体表达载体。 
本发明将空载体pcDNA3.1(+)、野生型人黑素皮质素受体-4表达载体(WT)及构建好的6个黑素皮质素受体-4突变体的表达载体采用磷酸钙法转染人肾胚胎细胞(HEK293)，筛选出8个稳定表达的混合细胞系。 
本发明ML00253764对突变受体的细胞膜表达恢复和信号分子产生的试验分析方法包括以下步骤： 
⑴稳定细胞系的药物处理：于6孔或96孔平板中培养稳定细胞系细胞，加入所需浓度的ML00253764处理后，37℃，5％CO₂培养箱中继续培养细胞。 
⑵受体细胞膜表达定量分析：稳定细胞系细胞用ML00253764处理后进行免疫标记，选用Sigma的FITC偶联的抗HA抗体，其荧光强度采用FACS(流式细胞术)法进行量化测定。 
⑶受体细胞膜表达的药理学分析：利用ML00253764处理稳定细胞系细胞，并取不同处理时间段的细胞进行FITC偶联的抗HA抗体免疫标记，其细胞膜表达的剂量和时间依赖性曲线用流式细胞仪进行量化检测，并利用GraphPadPrism5软件计算其有效中浓度(EC₅₀)，最大浓度值(Emax)和有效中时间(T_1/2)。 
⑷受体激活信号分子的药理学分析：将ML00253764处理后的稳定细胞系细胞进行α-MSH刺激处理，然后利用AppliedBiosystems公司的96孔环腺苷酸免疫分析系统和其cAMPHiRangekit进行信号分子cAMP产生的剂量依赖性曲线测定，并利用GraphPadPrism5软件计算其有效中浓度(EC₅₀)和最大浓度值(Emax)。 
实施例1： 
本发明人黑素皮质素受体-4及其突变体表达载体的构建： 
根据人黑素皮质素受体-4基因的DNA序列(NCBI参考序列：NM_005912.2)，设计引物，上游引入EcoRI限制性酶切位点和HA标记序列，下游引入XbaI限制性 酶切位点，通过PCR扩增得到EcoRI-HA-MC4R-XbaI核酸序列，并通过两个限制性酶切位点克隆到pcDNA3.1(+)上，得到野生型表达载体pcDNA3.1-hMC4R。以pcDNA3.1-hMC4R为模板，设计点突变所需引物，通过PCR引入突变位点，产物去甲基化后转化进入大肠杆菌扩增，抽提质粒，测序得到突变表达载体。 
⑴实验材料 
引物合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，dNTPs，pfuDNApolymerase，EcoRI，XbaI，DpnⅠ，T4连接酶(Fermentas)，质粒抽提试剂盒(Solarbio)，PCR扩增仪(BIO-Rad)，凝胶成像仪(美国BIO-Rad)，水平电泳仪(北京六一仪器厂)。 
⑵实验方法： 
野生型表达载体及其突变表达载体的构建包括如下步骤： 
S1：以人MC4R基因组DNA为模板，设计PCR扩增所需引物。上游引物：5’-AAGAATTCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTCTCGAGATGGTGAACTCCACCCACCGTG-3’(引入EcoRI酶切位点和HA标记序列)，下游引物：5’-CCTCTAGATTAATATCTGCTAGACAAGTC-3’(引入XbaI酶切位点)。 
S2：通过PCR扩增hMC4R基因编码区序列。反应体系内包含MC4RDNA模板100ng，0.25mMdNTPs，0.4μM上引，0.4μM下引，5μl10×pfuDNApolymerase buffer，1.5mMMgCl₂和2.5UpfuDNApolymerase，用ddH2O补足扩增体系至50μl。设置PCR反应程序为：95℃模板预变性2min；95℃模板变性1min，56℃引物退火45s，72℃引物延伸90s(35个循环)；最后72℃再延伸10min。 
S3:PCR产物进行切胶回收纯化，用限制性内切酶EcoRI和XbaI切割EcoRI-HA-MC4R-XbaI及pcDNA3.1(+)，并用T4连接酶连接，挑取转化子测序，获得EcoRI-HA-MC4R-XbaI-pcDNA3.1序列，命名为pcDNA3.1-hMC4R。 
S4：以pcDNA3.1-hMC4R为模板，分别设计不同突变受体的扩增引物： 
N62S：上引：5’-GCTTGTTGGAGAGTATCTTAGTGAT-3’ 
下引：5’-ATCACTAAGATACTCTCCAACAAGC-3’ 
P78L：上引：5’-ATCTGCATTCACTCATGTACTTTTT-3’ 
下引：5’-AAAAAGTACATGAGTGAATGCAGAT-3’ 
C84R：上引：5’-TACTTTTTCATCCGCAGCTTGGCTG-3’ 
下引：5’-CAGCCAAGCTGCGGATGAAAAAGTA-3’ 
G98R：上引：5’-AGCGTTTCAAATAGATCAGAAACCA-3’ 
下引：5’-TGGTTTCTGATCTATTTGAAACGCT-3’ 
W174C：上引：5’-AAGTTGTATCTGTGCAGCTTGCACG-3’ 
下引：5’-CGTGCAAGCTGCACAGATACAACTT-3’ 
C271Y：上引：5’-TCTACATCTCTTATCCTCAGAATCC-3’ 
下引：5’-GGATTCTGAGGATAAGAGATGTAGA-3’ 
S5：PCR扩增带有突变位点的pcDNA3.1-hMC4RDNA片段，50μlPCR体系(终浓度)中包括模板pCDNA3.1-hMC4R25ng，0.5mMdNTPs，125ng上引，125ng下引，1×pfuDNApolymerasebuffer，1.5mMMgCl₂和2.5UpfuDNApolymerase。PCR反应程序为：95℃模板预变性30s；95℃模板变性30s，55℃引物退火1min，68℃引物延伸13min(15个循环)；最后68℃再延伸10min。 
S6：PCR扩增产物中加入1μlDpnⅠ酶，37℃孵育2～3h，取5μl进行大肠杆菌(XL1-blue)感受态转化实验，挑取单克隆，送样测序，并对正确的突变载体进行质粒大提，测定质粒浓度及纯度存于-80℃备用。 
实施例2： 
黑素皮质素受体-4及其突变体表达选择HEK293细胞作为宿主，本发明中采用磷酸钙转染法筛选稳定表达的细胞系，并用含G418的筛选培养基进行筛选。 
⑴实验材料 
高糖DMEM(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，青链霉素(Gbico)，Gelatin(Sigma)，PBS(Solarbio)，CaCl₂·2H₂O(Sigma)，胰酶(Gibco)，BES(Sigma)，庆大霉素(Solarbio)，HEPES(Sigma)，G418(Solarbio)，WaymouthMB752/1(sigma)，BSA(Roche)。0.22μm滤膜(Milipore)，培养瓶、培养皿等细胞培养耗材均为NEST品牌。二氧化碳培养箱(ThermoHERAcell150i)，洁净工作台(苏净安泰)，电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)。 
⑵试剂配方 
完全培养基配方(DMEM)：10％的胎牛血清，1％双抗-青链霉素。 
0.1％Gelatin包被液：1gGelatin溶解于1L1×PBS中，高温灭菌，4℃贮藏。 
转染试剂：2.5MCaCl₂：18.38gCaCl₂·2H₂O溶于30mL三蒸水中，过滤除菌； 
2×BSS：280mMNaCl，1.5mMNa₂HPO₃，50mMBES，pH6.95，过滤除菌，-20℃贮藏。 
生长培养基(500mL)：50mL胎牛血清，500μl庆大霉素(40mg/mL)，2.5mLHEPES(1M)，447mLDMEM，4℃贮藏。 
筛选培养基(500mL)：50mL胎牛血清，500μl庆大霉素(40mg/mL)，5mLHEPES(1M)，500μlG418(250mg/mL)，444mLDMEM，4℃贮藏。 
Wa/BSA：14.1gWaymouthMB752/1，4.77gHEPES，2.24gNaHCO₃，加入约1L双蒸水，调节pH至7.7，定容至1L，加入1gBSA，室温溶解，过滤除菌，4℃贮藏。 
⑶实验方法 
人肾胚胎细胞(HEK293)转染野生型pcDNA3.1-hMC4R(WT)，空载体pcDNA3.1及8种突变表达载体，筛选出稳定表达的细胞系。包括步骤S1-S4，具体如下： 
S1：0.1％的Gelatin室温下包被100mm细胞培养皿，约45min，每个平板内铺5×10⁷个细胞，加入完全培养基进行培养，当细胞贴壁覆盖50％-80％平皿底面积时开始转染操作。 
S2：准备转染试剂：440μl无菌三蒸水，50μl2.5MCaCl₂，10μl质粒DNA(1mg/mL)，混匀，加入500μl的2×BSS，混匀，室温放置15min，逐滴加入至准备好的9mL生长培养基中，摇匀。 
S3：弃掉培养皿中的培养液，加入S2步骤中已混匀好的含转染体系的生长培养基。 
S4：平皿放入培养箱中过夜，37℃，5％CO₂条件下培养24h，加入5mLWa/BSA洗培养皿，重复两次，加入适量胰酶消化，转移至T75培养瓶中，加入含G418的筛选培养基，进行培养。 
S5：定期换液，筛选时间约4周。得到的稳定细胞系可进行传代培养，并进行实验。 
实施例3： 
野生型WT与各突变表达载体在HEK293中细胞表面表达的定量分析测定采用FACS。即测定分析构建好的稳定表达的混合细胞系在药学伴侣分子ML00253764处理与不处理两种情况下细胞膜表达量的差异。 
(1)实验材料 
ML00253764纯度98％，由申请人合成；α-MSH纯度95％，上海强耀生物科技有限公司。多聚甲醛(Solarbio)，FITC标记的Anti-HA抗体(Sigma)，六孔板品牌(NEST)，高速流式细胞仪(BDFACSAria，BD公司)。 
(2)实验方法 
培养完成后的整个实验操作均在冰上进行，见S1-S5： 
S1：WT、突变受体及空载体pcDNA3.1稳定细胞系以1×10⁴个细胞/孔的密度铺六孔板，培养24h。WT或突变hMC4R表达细胞系加入对照buffer或特定浓度的化合物ML00253764，继续培养12h。 
S2：细胞转移至1.5mL离心管中，用无菌的PBS洗三遍，5％的多聚甲醛室温固定30min，PBS洗三遍，加入5％(w/v)BSA/PBS封闭1h，终止非特异性反应。 
S3：弃掉废液，FITC标记的Anti-HA抗体用0.5％(w/v)BSA/PBS稀释1000倍，孵育细胞1h。然后用PBS轻柔的冲洗五遍。 
S4：利用BDFACSAria流式细胞术进行实验测定。 
S5：以稳定表达空载体pcDNA3.1的细胞系为阴性对照，计算公式为：[mutant-pcDNA3.1]/[WT-pcDNA3.1]×100％。每个实验三个重复，需要至少三次独立实验所得的数据分析才有效。 
实施例4： 
(1)实验材料 
多聚赖氨酸(BBI)，96孔板为NEST品牌，96孔环腺苷酸免疫分析系统与cAMP HiRangekit(AppliedBiosystems)公司。 
(2)实验方法 
激动剂诱导下受体激活信号分子cAMP水平的测定，见S1-S4： 
S1：提前用0.1mg/ml多聚赖氨酸包被96孔板，WT、突变受体及空载体pcDNA3.1稳定细胞系细胞计数，并以1×10³细胞/孔的密度铺96孔板，培养24h。WT或突变hMC4R表达细胞系加入buffer或化合物ML00253764，继续培养12h。 
S2：用DMEM培养基洗五次，加入含特定浓度α-MSH的DMEM培养基，继续培养45min。 
S3：利用AppliedBiosystems公司的96孔环腺苷酸免疫分析系统和其cAMP HiRangekit进行细胞内cAMP水平的测定。 
S4：利用GraphPadPrism5软件分析实验数据作出非线性回归S型曲线，得到cAMP产生水平的Emax及基础活性值，并计算得到EC₅₀。 
结果及分析 
1.表1为本发明实施例3中人MC4R野生型(WT)及突变受体在ML00253764处理后细胞表面表达水平的测定。利用10μM的ML00253764处理MC4R野生型(WT)受体或突变(包括N62S，P78L，C84R，G98R，W174C和C271Y)受体24h，结果发现处理后的受体表面表达水平都有不同程度的提高，其表面表达水平高低顺序为：C271Y>G98R>N62S>W174C>P78L>C84R。设定未用ML00253764处理的MC4R野生型(WT)的表达水平为100％，发现MC4R突变体的细胞表面表达效率具有较强的突变体特异性，其表达水平变化范围为8％-22％，然而用ML00253764处理后，所有突变受体的细胞表面表达效率升高到36％-74％。即使对于野生型(WT)受体，ML00253764处理后的细胞表面表达效率也从100％升高到156％。综上可知ML00253764可以显著的提高MC4R六个胞内留存型突变体的细胞表面表达。 
表1ML00253764处理后人MC4R突变受体细胞膜表面表达水平的测定 


备注：*表示与未用ML00235764处理的MC4R野生型(WT)受体对照相比，突变受体的细胞膜表达水平具有显著性差异，p<0.05。数据以多次实验(n)的±S.E.M.方式表示，未用ML00235764处理的MC4R野生型(WT)受体的细胞膜表达水平设为100％。 
2.表2为本发明实施例3中ML00235764作为MC4R的药理伴侣分子的药理学特性研究。利用不同浓度的ML00235764(10^-3M-10^-8M)处理MC4R突变体，作用24h，以未用ML00235764处理的WT表达水平为参照，结果发现，处理后的突变体表面表达水平都有所提高，且在ML00235764浓度为10^-4M时达到最大表面表达水平，表明ML00235764的拯救能力具有明显的剂量依赖型特征。MC4R六个突变体对于ML00235764作用浓度的EC₅₀值并不相同，其大小顺序为：P78L>C84R>N62S>W174C>G98R>C271Y，表明ML00235764对MC4R突变体的拯救能力具有突变体特异性特征。此外，利用10^-4M的ML00235764作用于突变体，分别处理不同的时间，通过FACS测定细胞表面表达发现六种突变体的有效中时间(T_1/2)的大小顺序为：N62S>C271Y>P78L>C84R>G98R>W174C，即ML00235764对MC4R突变体的拯救能力还具有时间依赖型特征。综上，ML00235764介导的MC4R突变体细胞表面表达恢复能力同时具有时间依赖型和剂量依赖型特征。 
表2ML00235764介导的MC4R突变体细胞表面表达水平的恢复 

备注：数据以多次实验(n)的±S.E.M.方式表示，EC₅₀代表每种突变受体的细胞表面表达水平达到最大值的50％时，ML00235764的浓度。T_1/2表示每种突变受体的细胞表面表达水平达到最大值的50％时的速率。 
3.表3为本发明实施例4中ML00235764介导的MC4R突变体激活信号分子进行功能拯救及药理学分析结果。为了解ML00235764处理后，MC4R突变受体(包括N62S，P78L，C84R，G98R，W174C和C271Y)能否对受体激动剂α-MSH的刺激做出响应，本发明中以10μM的ML00253764作用WT或突变受体12h，再加入1μM的α-MSH，测定其细胞内信号分子cAMP的积累水平。结果显示，与未用ML00253764处理的野生型WT受体相比，除G98R外的所有突变受体的最大信号能力(Emax)都增强到80％左右。利用ML00253764处理后的WT及突变受体之间的组成活性，即基础的cAMP积累水平并无显著性差异，但是与未用ML00253764处理的MC4RWT相比，其基础活性都有所降低，证明ML00253764是作为MC4R的反向激动剂发挥作用。综上：除G98R外，其余五个MC4R突变受体均未影响配体结合率或信号传导功能，在被ML00253764拯救后，受体能成功运送到细胞膜上，对受体激动剂α-MSH刺激做出响应，使信号传导功能恢复到不同的水平。研究中进一步用不同浓度的α-MSH(10^-5M-10^-11M)处理，测定cAMP的积累量，以更好的了解ML00253764作用下(10μM，12h)突变受体(包括N62S，P78L，C84R，W174C和C271Y)的药理学特性。结果显示与未用ML00253764处理的WT相比，处理后的WT与突变体的剂量响应曲线都发生了右移，EC₅₀的值提高10-20倍，且W174C>P78L>C84R>C271Y>N62S>WT。这是在加入α-MSH前清洗5次后的测定结果，进一步证明ML00253764和α-MSH与MC4R受体的结合位点相同，即二者是竞争性关系。 
表3ML00253764处理MC4RWT及突变体的药理学分析 

备注：*表示以未用ML00253764处理的MC4R野生型(WT)为对照，突变受体的cAMP产生水平具有显著性差异，p<0.05。表示以未用ML00253764处理的MC4R野生型(WT)为对照，突变受体的cAMP产生水平具有显著性差异，p<0.01。数据以多次实验(n)的±S.E.M.方式表示，以未用ML00253764处理的MC4R野生型(WT)的Emax为 对照，以9次实验结果计算所得。EC₅₀代表每种受体cAMP水平达到最大值的50％时，α-MSH的浓度。未用ML00253764处理的MC4R野生型(WT)的Emax和基础活性都设为100％。