山蜡梅叶片在制备抑制横纹肌肉瘤细胞A204细胞增殖药物中的应用.pdf

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510984154.3 (22)申请日 2015.12.24 A61K 36/185(2006.01) A61K 9/20(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 127/00(2006.01) (71)申请人 济南新时代医药科技有限公司 地址 250200 山东省济南市章丘市唐人中心 A5-125 号 (72)发明人 杨志华 李晶 (54) 发明名称 山蜡梅叶片在制备抑制横纹肌肉瘤细胞 A-204 细胞增殖药物中的应用 (57) 摘要 本发明属于中药技术领域， 具

2、体涉及一种山 蜡梅叶片在制备抑制横纹肌肉瘤细胞 A-204 细胞 增殖药物中的应用及山蜡梅叶片的制备方法。所 述山蜡梅叶片由山蜡梅叶 1500g 作为原料药制 成， 采用超临界萃取制备而成， 使得槲皮素和山柰 素含量有很大提高。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 CN 105412171 A 2016.03.23 CN 105412171 A 1/1 页 2 1.山蜡梅叶片在制备抑制横纹肌肉瘤细胞 A-204 细胞增殖药物中的应用， 所述山蜡梅 叶片由山蜡梅叶 1500g 作为原料药制成， 其特征在于， 所述山蜡梅叶

3、片的制备方法由下列 步骤组成 ： 取山蜡梅叶， 加入到CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂 的体积百分比为 4-6%， 萃取压力 15-30MPa， 温度 30-50， CO2流量 l-3ml/g 生药min， 萃 取时间 700-800min， 得超临界萃取物， 将超临界萃取物加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压 片， 制成 500 片， 每片重 0.35g。 2.根据权利要求 l 所述的山蜡梅叶片在制备抑制横纹肌肉瘤细胞 A-204 细胞增殖药 物中的应用， 其特征在于， 所述山蜡梅叶片的制备方法由下列步骤组成 ： 取山蜡梅叶， 加入 到 CO2超临界萃取器

4、中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 5%， 萃取压 力 25MPa， 温度 40， CO2流量 2ml/g 生药min， 萃取时间 750min， 得超临界萃取物， 将超临 界萃取物加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 500 片， 每片重 0.35g。 权 利 要 求 书 CN 105412171 A 2 1/4 页 3 山蜡梅叶片在制备抑制横纹肌肉瘤细胞 A-204 细胞增殖药 物中的应用 技术领域 0001 本发明属于中药技术领域， 具体涉及一种山蜡梅叶片在制备抑制横纹肌肉瘤细胞 A-204 细胞增殖药物中的应用及山蜡梅叶片的制备方法。 背景技术

5、0002 山蜡梅叶片标准号 WS-11310(ZD-1310)-2002， 记载于国家中成药标准汇编内科内 科肺系 （一） 分册。由山蜡梅叶 1500g 作为原料药制成， 具有辛凉解表， 清热解毒的功效。用 于风热感冒， 发热， 恶寒， 咽痛。 0003 现有技术中， 尚未有山蜡梅叶片在在制备抑制人横纹肌肉瘤细胞 A-204 细胞增殖 药物中的应用的报道， 也未见有山蜡梅叶片提取制备方面采用超临界萃取的报道， 而水煎 煮、 水蒸气蒸馏法提取挥发油的方法， 工艺粗糙、 落后， 杂质多， 导致患者用量过大， 不方便 服用， 严重影响了本品在临床上应用。 发明内容 0004 发明目的 ： 本发明的目

6、的在于提供一种山蜡梅叶片在制备抑制横纹肌肉瘤细胞 A-204 细胞增殖药物中的应用。 0005 本发明的另一个目的在于提供一种山蜡梅叶片的制备方法。 0006 本发明的目的是通过如下的方案实现的 ： 山蜡梅叶片在制备抑制横纹肌肉瘤细胞 A-204 细胞增殖药物中的应用， 所述山蜡梅 叶片由山蜡梅叶 1500g 作为原料药制成， 所述山蜡梅叶片的制备方法由下列步骤组成 ： 取 山蜡梅叶， 加入到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百 分比为 4-6%， 萃取压力 15-30MPa， 温度 30-50， CO2流量 l-3ml/g 生药min， 萃取时间 700-8

7、00min， 得超临界萃取物， 将超临界萃取物加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 500 片， 每片重 0.35g。 0007 优选的， 上述的山蜡梅叶片在制备抑制横纹肌肉瘤细胞 A-204 细胞增殖药物中的 应用， 所述山蜡梅叶片的制备方法由下列步骤组成 ： 取山蜡梅叶， 加入到 CO2超临界萃取器 中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 5%， 萃取压力 25MPa， 温度 40， CO2流量 2ml/g 生药min， 萃取时间 750min， 得超临界萃取物， 将超临界萃取物加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 500 片， 每片重

8、 0.35g。 0008 现有技术中， 山蜡梅叶片口服， 一次67片， 一日3次。 山蜡梅叶片服药量大。 采 用本发明方法制备成的山蜡梅叶片每片重 0.35g， 每次仅需 3 片， 一日服用 3 次。在具有更 多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。 0009 试验一、 不同方法制备的山蜡梅叶片中槲皮素和山柰素含量的比较 l、 仪器及试药本发明山蜡梅叶片 ： 按实施例 1 方法制备， 使用 1500g 原料药， 经提取制 成 500 片， 每片重 0.35g。原山蜡梅叶片， 按照 WS-11310(ZD-1310)-2002 标准方法制备。 说 明 书 CN 10541

9、2171 A 3 2/4 页 4 Agilent1200 高效液相色谱仪 ； METTLER AE240 电子分析天平 ； 槲皮素和山柰素对照品 （中 国药品生物制品检定所） 。 0010 2、 方法 照高效液相色谱法 （中国药典 2010 年版一部附录 D） 测定。 0011 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ； 甲醇 -0.5 磷酸溶液 （45 55） 为流动相 ； 检测波长为 365nm。理论板数分别按槲皮素、 山柰素峰计算 均应不低于 1500。 0012 对照品溶液的制备 精密称取槲皮素、 山柰素对照品适量， 分别加甲醇制成每 1ml 含 6g、 8g 的溶液

10、， 即得。 0013 供试品溶液的制备 取本发明山蜡梅叶片 10 片， 精密称定， 研细， 取 0.60g， 精密 称定， 加甲醇加热回流 2 次 （50ml、 50ml） ， 每次 1 小时， 滤过， 合并滤液， 残渣加甲醇适量洗 涤， 滤过， 洗液并入滤液中， 蒸干， 残渣加水 30ml 使溶解， 用冰醋酸调节 pH 值至 3 4， 加醋 酸乙酯振摇提取 5 次， 每次 30ml， 合并醋酸乙酯液， 蒸干， 残渣加甲醇适量使溶解， 转移至 10ml 量瓶中， 加甲醇至刻度， 摇匀， 即得。 0014 对照产品供试品溶液的制备 取对照的山蜡梅叶片 20 片， 精密称定， 研细， 取 1.2g

11、， 精密称定， 加甲醇加热回流 2 次 （50ml、 50ml） ， 每次 1 小时， 滤过， 合并滤液， 残渣加 甲醇适量洗涤， 滤过， 洗液并入滤液中， 蒸干， 残渣加水 30ml 使溶解， 用冰醋酸调节 pH 值至 3 4， 加醋酸乙酯振摇提取 5 次， 每次 30ml， 合并醋酸乙酯液， 蒸干， 残渣加甲醇适量使溶 解， 转移至 10ml 量瓶中， 加甲醇至刻度， 摇匀， 即得。 0015 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液、 对照产品供试品溶液各 5l， 注入液相色谱仪， 测定， 即得。 0016 3、 结果 结果表明， 本发明山蜡梅叶片中槲皮素和山柰素的含量为 220-36

12、2g / 片 ； 而原山蜡 梅叶片中槲皮素和山柰素的含量为36g /粒， 每次服用量3片的槲皮素和山柰素含量为原 片剂 6 粒含量的 3-5 倍， 在服用量减少的情况下， 槲皮素和山柰素含量有很大提高。 0017 上述研究表明， 采用本发明制备方法制备的山蜡梅叶片， 有效成分含量远远高于 WS-11310(ZD-1310)-2002 标准记载的方法制备的山蜡梅叶片。 具体实施方式 0018 下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明， 以便本领域的技术人员更了解 本发明， 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例， 凡基于本发明上述 内容所实现的技术均属于本发明的范围。 0019

13、实施例 1 取山蜡梅叶 1500g， 加入到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶 剂的体积百分比为 5%， 萃取压力 25MPa， 温度 40， CO2流量 2ml/g 生药min， 萃取时间 750min， 得超临界萃取物， 将超临界萃取物加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 500 片， 每片重 0.35g。 0020 经检测， 成品中槲皮素和山柰素的含量为 362g / 片。 0021 实施例 2 说 明 书 CN 105412171 A 4 3/4 页 5 取山蜡梅叶 1500g， 加入到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃

14、取溶 剂的体积百分比为 4%， 萃取压力 15MPa， 温度 30， CO2流量 1ml/g 生药min， 萃取时间 800min， 得超临界萃取物， 将超临界萃取物加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 500 片， 每片重 0.35g。 0022 经检测， 成品中槲皮素和山柰素的含量为 220g / 片。 0023 实施例 3 取山蜡梅叶 1500g， 加入到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶 剂的体积百分比为 6%， 萃取压力 30MPa， 温度 60， CO2流量 3ml/g 生药min， 萃取时间 700min， 得超临界萃取物， 将超临界萃

15、取物加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 500 片， 每片重 0.35g。 0024 经检测， 成品中槲皮素和山柰素的含量为 308g / 片。 0025 实施例 4 ： 山蜡梅叶片抑制横纹肌肉瘤细胞 A-204 细胞增殖的实验研究资料 1实验材料 1.1 实验用细胞株 人横纹肌肉瘤细胞 A-204 细胞， 山东大学实验室细胞库， DMEM+10%FBS 常规培养。 0026 1.2 实验药物 研究药物 ： 本发明山蜡梅叶片 ： 按实施例 1 方法制备。 0027 药液储液 ： 称取 100mg 山蜡梅叶片， 溶于 5ml 无水乙醇中， 0.2m 滤器过滤， 500ldof

16、f 管分装， -20存储， 同时 0.2m 滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。 0028 1.3 实验试剂 DMEM( GIBCO 公司 Cat.No.12100-061 Lot.No.758137) ； 胎牛血清 （浙江天杭生物科技 有限公司 Lot.No.100419） ； NaHC03( 上海久亿化学试剂有限公司 Cat.No.11810-033 Lot. No. 1088387) ； Trypsin （AMRESCO 公司） ； EDTA （AMRESCO 公司） ； Penicillin G Sodium Salt （AMRESCO 公司 1） ； Streptomycin Sulfa

17、te(AMRESCO) ； 无水乙醇 （淄博亚杜兰经贸有限公 司） ； MTT (Biosharp 批号 ： 0793) ： PBS（实验室自配） ； 1.4 实验器材 莱卡倒置显微镜 （德国 Leica 型号 ： DMIL） ； 可见 - 紫外光微孔板检测仪 （美国 MD 公司型 号 ： SPECTRAMAX 190） ； C02培养箱 （FORMA型号 ： 3111） ； 超净台 （苏净集团安泰公司制造型号 ： SW-CJ-ZFD） ； 纯水仪 （美国 Sprlng 公司型号 ： S/N 020579） ； 精密移液器 （法国吉尔森公司型 号 ： P2） ； 电子天平 （德国赛多利斯有限公

18、司型号 ： BT323S） ； 全自动高压灭菌锅 （日本 SANYO 公司型号 ： MLS-3020） ； 台式电热鼓风干燥箱 ( 上海精密实验设备公司型号 ： DHG9123A) ； 冰 箱 ( 西门子公司型号 ： KG18V21TI) ； 液氮罐 （CBS 型号 ： 2001） ； 低速离心机 （上海安亭科学仪 器厂型号 ： KA-1000） ； 0.2m 滤器 （MILLIPORE 型号 ： SLGP033RB） ； 1cm 培养皿 (NEST 公司 )、 96 孔培养板 （NEST 公司） ； 细胞计数板 ； 离心管、 移液管、 Tips 若干。 0029 2实验方法 1)A-204

19、细胞用 DMEM+10%FBS 于 37、 5%C02进行常规培养 （10cm 培养皿） ， 当细胞生长 至对数期时， 收集细胞， 弃去培养液， PBS 轻洗 3 遍， 加入 3ml 0.25% 胰蛋白酶 -0.04%EDTA， 37消化 2min 后， 向其中加入 5ml 完全培养基中和反应， 吹打细胞后将其转入离心管中， 1000rpm 离心 5min， 调整细胞悬液浓度 3104个 /ml。 说 明 书 CN 105412171 A 5 4/4 页 6 0030 2) 将细胞种入 96 孔培养板中， 每孔加入细胞悬液 180l， 培养板放入细胞培养箱 中 (37， 5%C02) 常规培养

20、。 0031 3) 根据细胞生长情况， 一般长至 50%-70%， 加入山蜡梅叶片溶液， 继续培养 24h。 0032 4)24h 后加入 20l MTT 溶液 （5mg/ml， 即 0.5%MTT） ， 继续培养 4h。 0033 5)4h 后扣板法倒去上清， 用吸水纸轻轻拍干， 每孔加入 200l 二甲基亚砜， 置摇床 上低速振荡 10min， 使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 490nm 处测量各孔的吸光值。 0034 6) 同时设置本底 （不加细胞， 只加培养液） ， 对照孔 （细胞、 相同浓度的药物溶解介 质、 培养液、 MTT、 二甲基亚砜） ， 每组设定 6 个复孔。 0035

21、 7) 结果以药物对细胞的抑制率表示 ： 细胞增值抑制率 (%)=（对照孔 OD 值 - 给药 孔 OD 值） 、 对照孔 OD 值 100%。实验重复 3 次。 0036 3统计处理 采用Microsoft Excel 2007软件中的相关分析和Student t检验， 数据以meanS D 表示。 0037 4实验结果 MTT 法实验后统计结果显示， 与对照组比较， 当剂量达到 5mg/ml 时， 对 A-204 细胞 增殖抑制有差异 (P0.05)， 剂量在 10mg/ml 时该差异具有显著性 (P0.01)， 当剂量达到 15-20mg/ml 时有极显著性差异 (P0.001)。 0038 表 1 山蜡梅叶片对 A-204 细胞增殖抑制影响研究 (XSD) 组别药物浓度 （mg/ml）抑制率 （%） 对照组00 157.232.02 21013.333.64* 31520.547.58* 42026.8610.03* 注 ： 与对照组比较， *PO.01 ； *P0.001。 0039 5实验结论 本发明的山蜡梅叶片可以抑制A-204细胞增殖， 减少A-204细胞的细胞生长数目， 该作 用呈剂量依赖性。 说 明 书 CN 105412171 A 6