使用肉毒毒素的骨缝线给药技术.pdf

1、10申请公布号CN102056620A43申请公布日20110511CN102056620ACN102056620A21申请号200980120887522申请日2009033112/062,37220080403USA61K38/48200601A61P25/0020060171申请人阿勒根公司地址美国加利福尼亚72发明人AM布卢门菲尔德74专利代理机构北京北翔知识产权代理有限公司11285代理人张广育姜建成54发明名称使用肉毒毒素的骨缝线给药技术57摘要本发明使用患者特异性界标来治疗头痛。一方面，本发明涉及向遭受头痛的患者给予梭菌毒素，例如肉毒神经毒素，其中肉毒毒素的给药部位是基于患者头骨

2、的至少一条骨缝线。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2010120386PCT申请的申请数据PCT/US2009/0389502009033187PCT申请的公布数据WO2009/124046EN2009100851INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书19页附图6页CN102056627A1/2页21一种治疗遭受头痛的患者的方法，包括向位于患者头骨的至少一条骨缝线附近的神经给予梭菌毒素的步骤，其中所述给予梭菌毒素减轻头痛的至少一种症状，从而治疗所述遭受头痛的患者。2权利要求1的方法，还包括确定所述的至少一条骨缝线的位置的步骤。3权利要求1的方法

3、，其中所述头痛选自窦性头痛、紧张性头痛、偏头痛、丛集性头痛和颈源性头痛。4权利要求1的方法，其中所述的至少一条骨缝线选自额缝、鳞缝、枕乳突缝、冠状缝、人字缝和矢状缝。5权利要求1的方法，其中所述梭菌神经毒素是一种肉毒毒素。6权利要求5的方法，其中所述肉毒毒素选自A、B、C1、D、E、F和G型肉毒毒素。7权利要求5的方法，其中所述肉毒毒素是A型肉毒毒素。8权利要求1的方法，其中所述头痛是阵发性偏头痛或慢性偏头痛。9一种治疗有需要的患者的头痛的方法，包括以下步骤A确定与患者头痛相关的疼痛部位；B确定患者的至少一条相对于其他骨缝线而言与疼痛部位最接近的骨缝线的位置；和C对患者给予一种梭菌神经毒素，其

4、中所述给药是在患者至少一条骨缝线沿线附近并且沿骨缝线长度方向上线性连续并且基本上叠加地进行，从而治疗患者的头痛。10权利要求9的方法，其中所述梭菌神经毒素是一种选自如下的肉毒毒素A、B、C1、D、E、F和G型肉毒毒素。11权利要求9的方法，其中梭菌神经毒素是A型肉毒毒素。12权利要求11的方法，其中所述给药步骤包括如下步骤将含有A型肉毒毒素的注射器的针插入针刺入点，将所述针沿所述至少一条骨缝线定位，以便将A型肉毒毒素沿所述至少一条骨缝线线性给药。13权利要求11的方法，其中所述的至少一条骨缝选自额缝、鳞缝、冠状缝、人字缝、枕乳突缝和矢状缝。14权利要求12的方法，还包括在针刺入点将针重新定位以

5、沿第二条骨缝线线性沉积肉毒毒素的步骤。15一种用于减轻头痛的方法，包括向有需要的患者给予A型肉毒毒素的步骤，其中将所述A型肉毒毒素给药至患者的一条骨缝线附近，并且该给药在七天内减轻头痛，并且头痛保持减轻约2到6个月。16权利要求15的方法，其中所述骨缝选自额缝、鳞缝、冠状缝、人字缝、枕乳突缝和矢状缝。17权利要求15的方法，其中A型肉毒毒素的给药量为约5单位到约4000单位。18权利要求15的方法，其中所述A型肉毒毒素的给药步骤还包括利用刺穿头部皮下组织、头部肌肉和腱膜筋膜并且位于患者的骨缝线沿线附近的针，以及逐渐沿所述骨缝线抽出针，同时递送A型肉毒毒素，从而使所述A型肉毒毒素在骨缝线沿线附近

6、进行线性的皮下连续分布。19权利要求15的方法，其中将A型肉毒毒素给予至额缝、鳞缝、冠状缝、人字缝和矢状权利要求书CN102056620ACN102056627A2/2页3缝中的两种或更多种。20权利要求15的方法，其中通过使用一个针刺入点在至少两条骨缝线沿线附近给予A型肉毒毒素。权利要求书CN102056620ACN102056627A1/19页4使用肉毒毒素的骨缝线给药技术0001交叉引用0002本申请要求享有2008年4月3日提交的序列号为12/062,372的美国非临时申请的优先权，该专利申请以引用方式全文纳入本说明书。背景技术0003本发明涉及一种利用患者特异性界标LANDMARK来

7、治疗头部疼痛如头痛的新方法。一方面，本发明涉及向遭受头痛的患者给予梭菌毒素，如肉毒神经毒素，其中肉毒毒素的给药部位基于患者头骨至少一条骨缝线且在其附近。0004各种头部疼痛病症如头痛的病理生理学在不断地被探究着。头痛是头部的疼痛，部位如头皮、面部、前额或颈部，并且可被分作原发性头痛和继发性头痛。原发性头痛是一种非其他病症引起的头痛。相反，继发性头痛则是由于一种疾病或病状，如不健康、感染、损伤、中风或其他异常引起。因此，继发性头痛与其根源性原发障碍有关，该根源性原发障碍会引起头痛作为其症状。0005头痛又被分类为各种头痛类型，例如，紧张性头痛TENSIONHEADACHE、颈源性头痛CERVIC

8、OGENICHEADACHE、窦性头痛SINUSHEADACHE、丛集性头痛CLUSTERHEADACHE、偏头痛MIGRAINEHEADACHE、慢性进行性头痛CHRONICPROGRESSIVEHEADACHE和激素头痛HORMONEHEADACHE。0006紧张性头痛是常见的一类原发性头痛。紧张性头痛的患者经常声称在前额或头颈后部或者在这两个区域都感到疼痛。他们将其疼痛描述为紧绷的感觉，好像他们的头被钳住或好像有人沿着他们头的外围紧勒一条带子。抱怨紧张性头痛的人一般在肩部或颈部感到疼痛。有些人会出现混合性头痛综合症，也就是紧张性头痛和偏头痛的结合。0007有些头痛是继发性头痛。例如，颈源

9、性头痛是由颈部问题例如由长时间的单一姿势、关节炎、上部脊椎损伤或颈椎疾病引起的颈部肌肉的异常引起的头痛。通常情况下，颈源性头痛的患者在X射线或磁共振颈部成像检查中未显示出明显病理性结果，这使得他们疼痛的源头或原因变得更不清楚。有人设想该疼痛可能是来自于颈椎上部的各种结构。也有理论认为，疼痛的产生无论是原发性还是继发性可能与颈部肌肉有关。在具体的病例中，疼痛可能被报道为单侧的，并可能伴随着颈部活动范围受限。颈源性头痛的一个显著标志是这种头痛可由于对枕骨部头的后部肌肉或颈部进行触诊或对其施压而引发。因此，在一些情形中，特定的颈部运动或将头置于某个位置能促使颈源性头痛发生。0008窦性头痛引起头和面

10、部前面疼痛，它是由位于脸颊、鼻和眼后部的各窦道的炎症引起的。与窦性头痛相关的疼痛往往在患者向前弯曲也就是，直立时面向地板运动时以及从睡眠中醒来时变得严重。一般在头面部疼痛同时还报告有后鼻滴流、喉咙痛和流涕。0009慢性进行性头痛也称作牵引性或炎症性头痛是随时间日益严重和频繁发作的头痛。作为最不寻常的头痛类型中的一种，慢性进行性头痛被认为是脑或头骨的不明疾病或障碍导致的结果。0010激素头痛是女性特有的与月经期、孕期和绝经期激素水平改变有关的头痛。此外，说明书CN102056620ACN102056627A2/19页5对一些女性而言，由于使用避孕药或注射合成孕酮而引起的化学诱导的激素水平改变也能

11、引发头痛。0011丛集性头痛是一种影响头部一侧单侧并且还可能涉及眼睛流泪和鼻塞的头痛。丛集性头痛会在几个星期内每天约同一时间反复发作，然后不再出现。有假设称，丛集性头痛可能与身体组织突然释放组胺或5羟色胺有关。其症状可包括眼睛下方或周围肿胀通常发生在头痛侧，伴有过量的泪水以及头痛侧的眼睛发红。丛集性头痛患者也可出现鼻漏或鼻充血通常只发生于与头痛侧相同的鼻子一侧。丛集性头痛的疼痛被描述为特征性地出现在头一侧的稳定、剧烈或灼烧样疼痛，这种疼痛发作之后很快恶化，在10分钟之内达到顶峰并最长持续约2小时。0012偏头痛经常伴随头部某一区域的剧烈的脉动性或搏动性疼痛。有些人的偏头痛伴随对光和声音极度敏感

12、、恶心和呕吐。对特定的患者，偏头痛的发作可预知，因为偏头痛发生之前有些“预兆”，确切地说是闪光似的视觉干扰、手臂或腿有麻刺感或暂时失明。偏头痛会极其痛苦，可能使患者在几小时甚至几天内都无法从事正常活动。偏头痛可分为慢性或阵发性偏头痛。慢性偏头痛患者在超过3个月的时间内每月遭受15天或者更多天的偏头痛。阵发性偏头痛患者每月偏头痛少于15天。在某些病例中，阵发性偏头痛发生频率增至每天或几近每天，但常常没有偏头痛的常见特征如恶心或对光敏感由此形成被称为转换型偏头痛或演化型偏头痛的偏头痛。偏头痛的治疗可包括使用抗抑郁药、抗癫痫发作药物或心血管药物，但使用这些治疗方法丝毫不能够确保患者完全康复。不同的诱

13、发因素都可引起偏头痛的发作，这取决于不同的患者。示例性的诱发因素包括缺乏食物或睡眠、暴露于光下或女性激素失调。已知焦虑、压力或压力后的放松，天气、季节、海拔、气压或时区时差变化都能引发偏头痛。0013在很多情况下，在治疗偏头痛或丛集性头痛时使用曲坦类药物基于色胺的药作为中断病程的药物，也就是说，一旦患者感到头痛将要来临，立刻给予患者曲坦类药物。曲坦类药物尽管在治疗特定的个体头痛发作时有效，但其既不能预防也不能治愈头痛。常用于处方的曲坦类药物包括舒马曲坦SUMATRIPTANIMITREX，IMIGRAN、那拉曲坦NARATRIPTANAMERGE，NARAMIG和佐米曲坦ZOLMITRIPTA

14、NZOMIG。0014还公开有其他治疗头痛的方法，例如，利用梭菌毒素。当前肉毒毒素在偏头痛治疗中的使用涉及对面部和头部浅表肌肉和皮下组织的注射。0015梭菌属根据形态学和功能分为127以上个种。肉毒杆菌CLOSTRIDIUMBOTULINUM是一种革兰氏阳性厌氧细菌，它能产生一种强效多肽神经毒素肉毒毒素，该毒素在人和动物中可导致一种神经性麻痹疾病，该疾病被称为肉毒中毒。肉毒杆菌的孢子存在于土壤中，并且可生长于家庭式罐头工厂未严格消毒并密封的食物容器中，这是许多肉毒中毒病例的原因。肉毒中毒作用一般在食用了被肉毒杆菌培养物或孢子感染的食物后18到36小时表现出来。肉毒毒素似乎可以不衰减地穿过肠被覆

15、层并且攻击周围运动神经元。肉毒毒素中毒症状可由行走、吞咽和说话困难一直发展到呼吸肌麻痹和死亡。0016小鼠的LD50为约50皮克市售的A型肉毒毒素一种纯化的神经毒素复合物，可购自加利福尼亚州欧文市的阿勒根公司，商标为BOTOX规格是100单位小瓶也就是，1单位。1单位BOTOX包含约50皮克约56埃摩尔的A型肉毒毒素复合物。值得注意的是，以摩尔计，A型肉毒毒素的致死性为白喉的致死性的约18亿倍，氰化钠的致死性的约说明书CN102056620ACN102056627A3/19页66亿倍，眼镜蛇毒的致死性的约3000万倍，霍乱的致死性的约1200万倍SINGH，CRITICALASPECTSOFB

16、ACTERIA/PROTEINTOXINS，PAGES6384CHAPTER4OFNATURALTOXINSII，EDITEDBYBRSINGHETAL，PLENUMPRESS，NEWYORK1976其中所称的03NG的A型肉毒毒素LD50等同于1单位被修正，因为事实上约005NG的BOTOX等同于1单位。1单位U肉毒毒素被定义为通过腹膜内途径注射至重量为18到20克/每只的SWISSWEBSTER雌鼠后得到的LD50。0017已表征了7种免疫学上不同的肉毒神经毒素，分别为肉毒神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G，每种均可以通过用类型特异性抗体进行中和来识别。肉毒神经毒素的不同血清型在它

17、们所侵染的不同动物种类中，引起的麻痹的严重程度和持续时间不同。例如，通过测量大鼠的麻痹率，测得A型肉毒毒素比B型肉毒毒素的效力强500倍。此外，测得B型肉毒毒素在剂量为480U/KG时对灵长类无毒，该剂量是灵长类的A型肉毒毒素LD50的12倍MOYEREETAL，BOTULINUMTOXINTYPE8EXPERIMENTALANDCLINICALEXPERIENCE，BEGINNINGCHAPTER6，PAGES7185OFTHERAPYWITHBOTULINUMTOXIN，EDITEDBYJANKOVIC，JETAL1994，MARCELDEKKER，INC。在本领域中已知可按如下剂量安全高

18、效地向人给予B型肉毒毒素15000单位或更多，甚至最高达25000单位且最长至56个月重复给药KUMARRANDSEEBERGERLC，LONGTERMSAFETY，EFFICACY，ANDDOSINGOFBOTULINUMTOXINTYPEBMYOBLOCINCERVICALDYSTONIACDANDOTHERMOVEMENTDISORDERS，MOVDISORD2002；17SUPPL5S292S293。肉毒毒素似乎能以高亲和力与胆碱能运动神经元结合，被易位进入神经元并阻断乙酰胆碱的释放。额外的摄取除通过吞噬作用和胞饮作用发生外还可通过低亲和力受体进行。0018不考虑血清型，毒素中毒的分子

19、机制看起来是相似的，涉及至少3个步骤或阶段。该过程的第一步中，所述毒素通过重链H链和细胞表面受体间的特异相互作用与靶神经元的突触前膜结合；每种肉毒毒素类型和破伤风毒素的细胞表面受体被认为是不同的。H链的羧基端区段HC似乎对将毒素靶向至细胞表面很重要。在第二步中，所述毒素穿越中毒细胞的质膜。所述毒素首先通过受体介导的胞吞作用被细胞吞噬，然后形成包含所述毒素的内体。所述毒素随后离开内体进入细胞的胞质中。这一步被认为是由H链的氨基端区段HN介导的，HN引发毒素响应于55或更低的PH发生构象变化。已知内体具有能够降低内体内PH的质子泵。构象变化使毒素的疏水残基暴露，这使得毒素可将自身嵌入内体膜。所述毒

20、素或至少是轻链接着易位穿过内体膜进入细胞质。0019所述肉毒毒素活性机制的最后一个步骤似乎涉及连接重链H链和轻链L链的二硫键的还原。肉毒毒素和破伤风毒素的全部毒性包含在全毒素的L链中；L链是一种锌ZN2内肽酶，它能选择性地裂解对于识别含有神经递质的囊泡、将该囊泡锚定DOCKING于质膜的细胞质一面、以及囊泡与细胞质膜的融合而言所必需的蛋白质。破伤风神经毒素、B型、D型、F型和G型肉毒毒素可导致一种突触小体膜蛋白即突触小泡蛋白也称作囊泡相关膜蛋白VAMP的降解。大部分存在于突触囊泡的细胞质侧表面的VAMP都会由于如上述任何一种裂解事件而被移除。肉毒毒素血清型A型和E型可裂解SNAP25。最初认为

21、肉毒毒素血清型C1裂解突触融合蛋白，但后来发现它裂解突触融合蛋白和SNAP25。每种肉毒毒素特异地切割不同的键；但除了B型肉毒毒素和破伤风毒素，它们切割的是相同的键。这些裂解作用中的每一种都能阻断囊泡膜锚定，从而阻止囊泡内容物出胞。说明书CN102056620ACN102056627A4/19页70020肉毒毒素已经在临床上用于治疗以骨骼肌活动亢进也就是运动失调为特征的神经肌肉障碍。在大约20年前，1989年时，美国食品药品管理局FDA批准了一种A型肉毒毒素复合物用于治疗睑痉挛BLEPHAROSPASM、斜视STRABISMUS和偏侧面肌痉挛HEMIFACIALSPASM。随后FDA还批准了一

22、种A型肉毒毒素用于治疗颈肌张力障碍和眉间皱纹，一种B型肉毒毒素用于治疗颈肌张力障碍。与A型肉毒毒素相比，非A型肉毒毒素血清型似乎效能更低和/或活性持续时间更短。周围肌内注射A型肉毒毒素的临床效果一般在注射1星期内显现。单次肌内注射A型肉毒毒素所达到的症状减轻的一般持续时间为平均约3个月，但也有报道称有显著更长持续时间的治疗活性。0021尽管所有的肉毒毒素血清型都能似乎抑制神经肌肉接头处的神经递质乙酰胆碱的释放，但它们是通过影响不同的神经分泌蛋白和/或在不同的位点裂解这些蛋白起作用的。例如，A型和E型肉毒毒素都裂解25K道尔顿KD的突触小体相关蛋白SNAP25，但是它们靶向于该蛋白内的不同氨基酸

23、序列。B、D、F和G型肉毒毒素都能作用于囊泡相关蛋白VAMP，也称作突触小泡蛋白，但每种血清型在不同的位点裂解所述蛋白质。最后，C1型肉毒毒素已被证明既能裂解SNAP25又能裂解突触融合蛋白。作用机制的这些不同可能影响各种肉毒毒素血清型的相对效能和/或作用时长。很明显，肉毒毒素的酶底物可存在于多种不同细胞类型中。参见，例如BIOCHEMJ1；339PT1159651999，和MOVDISORD，1033761995胰腺胰岛B细胞至少包含SNAP25和突触小泡蛋白。0022对所有七种已知的肉毒毒素血清型而言，肉毒毒素蛋白质分子的分子量为约150KD。值得注意的是，肉毒毒素是由梭菌以复合物形式释放

24、，该复合物包含所述150KD肉毒毒素蛋白质分子和相关非毒素蛋白。因此，由梭菌产生的A型肉毒毒素复合物可以是900KD、500KD和300KD的形式。B型和C1型肉毒毒素似乎只以700KD或500KD复合物的形式产生。D型肉毒毒素以300KD和500KD两种复合物的形式产生。最后，E型和F型肉毒毒素只以约300KD复合物的形式产生。所述复合物即分子量大于约150KD被认为包含非毒素的血凝素蛋白和非毒素且无毒性的非血凝素蛋白。这两种非毒素蛋白连同肉毒毒素分子一起组成相应的神经毒素复合物的作用可能是提供抵御肉毒毒素分子变性的稳定性，并在毒素被摄取后抵御消化酸。此外，大的分子量大于150KD肉毒毒素复

25、合物可能导致肉毒毒素以较低扩散速率离开肉毒毒素复合物的肌内注射位点。0023体外研究表明肉毒毒素抑制钾阳离子诱导的乙酰胆碱和去甲肾上腺素从脑干组织的原代细胞培养物中的释放。此外，已有报道称肉毒毒素抑制甘氨酸和谷氨酸从脊髓神经元的原代培养物中诱发性释放，在脑突触小体制备物中肉毒毒素抑制乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素中的每种神经递质释放HABERMANNE，ETAL，TETANUSTOXINANDBOTULINUMAANDCNEUROTOXINSINHIBITNORADRENALINERELEASEFROMCULTUREDMOUSEBRAINJNEUROCHEM512；5225271988、CGR

26、P、P物质和谷氨酸SANCHEZPRIETO，J，ETAL，BOTULINUMTOXINABLOCKSGLUTAMATEEXOCYTOSISFROMGUINEAPIGCEREBRALCORTICALSYNAPTOSOMES，EURJBIOCHEM165；6756811897。因此，当使用适当浓度时，肉毒毒素能够阻断大部分神经递质的刺激诱发性释放。参见，例如PEARCE，LB，PHARMACOLOGICCHARACTERIZATIONOFBOTULINUMTOXINFORBASICSCIENCEANDMEDICINE，TOXICON359；13731412AT1393；BIGALKEH，ETAL

27、，BOTULINUMANEUROTOXININHIBITSNONCHOLINERGICSYNAPTICTRANSMISSIONINMOUSESPINALCORD说明书CN102056620ACN102056627A5/19页8NEURONSINCULTURE，BRAINRESEARCH360；3183241985；HABERMANNE，INHIBITIONBYTETANUSANDBOTULINUMATOXINOFTHERELEASEOF3HNORADRENALINEAND3HGABAFROMRATBRAINHOMOGENATE，EXPERIENTIA44；2242261988，BIGALKEH

28、，ETAL，TETANUSTOXINANDBOTULINUMATOXININHIBITRELEASEANDUPTAKEOFVARIOUSTRANSMITTERS，ASSTUDIEDWITHPARTICULATEPREPARATIONSFROMRATBRAINANDSPINALCORD，NAUNYNSCHMIEDEBERGSARCHPHARMACOL316；2442511981，以及；JANKOVICJETAL，THERAPYWITHBOTULINUMTOXIN，MARCELDEKKER，INC，1994，PAGE5。0024A型肉毒毒素可经在发酵罐中建立并培养肉毒杆菌培养物、然后依照已知方法收

29、集并纯化发酵混合物而得到。所有的肉毒毒素血清型最初合成得到的形式都是无活性单链蛋白质，所述无活性单链蛋白质必须经蛋白酶作用被切割或形成缺口从而变为具有神经活性。能制备A型和G型肉毒毒素的菌株具有内源蛋白酶，因此血清型A和G可从细菌培养物中主要以活性形式回收。相反，肉毒毒素血清型C1、D和E是由非蛋白水解菌株合成的，因此通常从培养物中回收时无活性。血清型B和F，蛋白水解菌株和非蛋白水解菌株都可产生，因此在回收时可以是活性或非活性形式。然而，即使是产生例如B型肉毒毒素血清型的蛋白水解菌株，它也仅仅是裂解所合成的毒素的一部分。有缺口分子和无缺口分子的准确比例取决于培养物孵育的时长和温度。因此，肉毒毒

30、素例如B型肉毒毒素的任何制剂中都有一定比例可能无活性，这可以解释B型肉毒毒素与A型肉毒毒素相比效能显著更低的原因以及解释了为何B型肉毒毒素一般以几千单位常规使用，这一点是本领域公知的，参见，例如LONGTERMSAFETY，EFFICACY，ANDDOSINGOFBOTULINUMTOXINTYPEBMYOBLOCINCERVICALDYSTONIACDANDOTHERMOVEMENTDISORDERSKUMARRANDSEEBERGERLCMOVDISORD2002；17SUPPL5S292S293。无活性肉毒毒素分子在临床制剂中的出现将增加所述制剂的蛋白总载荷，这也意味着抗原性增加，但是并

31、不能增强其临床效能。此外，已知在肌肉注射后B型肉毒毒素的活性持续时间较短且与同剂量的A型肉毒毒素相比效能也较低。0025高质量的A型肉毒毒素晶体可由肉毒杆菌HALLA菌株产生，并具有以下特征每毫克大于3107U、A260/A278小于060以及凝胶电泳时有独特条带图案。已知的SCHANTZ法能够用于制取A型肉毒毒素晶体，如在SCHANTZ，EJ，ETAL，PROPERTIESANDUSEOFBOTULINUMTOXINANDOTHERMICROBIALNEUROTOXINSINMEDICINE，MICROBIOLREV56；80991992中所述。通常A型肉毒毒素复合物可从在适当培养基中培养的

32、A型肉毒杆菌的厌氧发酵物中分离和纯化。在分离出无毒素蛋白后，可用已知的方法获取纯的肉毒毒素，例如，分子量约为150KD、比效能为12108LD50U/MG或更高的纯化A型肉毒毒素；分子量约为156KD、比效能为12108LD50U/MG或更高的纯化B型肉毒毒素；以及分子量约为155KD、比效能为12107LD50U/MG或更高的纯化F型肉毒毒素。0026肉毒毒素和/或肉毒毒素复合物可从下列公司或机构获取美国加利福利亚州的坎贝尔市的LISTBIOLOGICALLABORATORIES，INC公司；英国的THECENTREFORAPPLIEDMICROBIOLOGYANDRESEARCHPORTO

33、NDOWN；WAKOOSAKA，JAPAN，METABIOLOGICSMADISON，WISCONSIN和SIGMACHEMICALSSTLOUIS，MISSOURI。也可以用纯肉毒毒素制备依据本申请公开内容使用的药物组合物。0027一般对酶而言，肉毒毒素它是细胞内的肽酶的生物活性取决于，至少部分取决说明书CN102056620ACN102056627A6/19页9于它们的三维构象。因此，A型肉毒毒素在下列情况下被解毒加热、各种化学物质、表面拉伸和表面干燥。此外，已知将用公知的培养、发酵和纯化方法制取的毒素复合物稀释至药物组合物制剂可用的相当低的毒素浓度时会导致毒素的迅速解毒，除非有合适的稳定

34、剂存在。将毒素从毫克量稀释至每毫升溶液含有纳克量存在很大的困难，因为在如此大幅稀释下会迅速丧失特异性毒性。由于毒素可能在含毒素的药物组合物制成后的数月或数年后使用，可用稳定剂如白蛋白和明胶稳定毒素。0028一种市售的含肉毒毒素的药物组合物以商标BOTOX可从加利福尼亚州欧文市的阿勒根公司获取出售。BOTOX由纯化的A型肉毒毒素复合物、白蛋白和氯化钠组成，以无菌真空干燥的形式包装。A型肉毒毒素从肉毒杆菌HALL菌株的培养物中制取，所述菌株培养于含有NZ胺和酵母提取物的培养基中。A型肉毒毒素复合物是用一系列酸沉淀过程从培养物溶液纯化的，得到由活性高分子量毒素蛋白和一种相关的血凝素蛋白组成的晶体复合

35、物。将所述晶体复合物重溶于一种含有盐水和白蛋白的溶液中，无菌过滤02微米，然后真空干燥。将真空干燥后的产品于5或更低温度下储存在冰箱中。在肌内注射前，可用无菌无防腐剂的盐水将BOTOX重溶。每小瓶BOTOX含有无菌真空干燥形式的约100UA型肉毒毒素纯化神经毒素复合物、05毫克人血清白蛋白和09毫克氯化钠，并且不含防腐剂。0029为将真空干燥的BOTOX重溶，使用无菌无防腐剂的生理盐水09氯化钠注射液，用适当尺寸的注射器抽取适当量的稀释液。由于BOTOX会因起泡或类似的剧烈搅动而变性，要将稀释液轻轻地注入小瓶。出于无菌的原因，BOTOX优选在小瓶从冰箱中取出并进行重溶后的四小时内给药。在这四个

36、小时中，重溶的BOTOX可以在冰箱中于约2到约8下储存。有报道称冷藏的重溶BOTOX的效能可保持至少约2周NEUROLOGY，4824953，1997。有报道称A型肉毒毒素已在如下临床环境下使用00301每次肌内注射多处肌肉约75125U的BOTOX用于治疗颈肌张力障碍；00312每次肌内注射510U的BOTOX用于治疗眉间皱纹抬头纹BROWFURROWS5单位肌内注射至降眉间肌，10单位肌内注射至皱眉肌；00323约3080U的BOTOX通过括约肌内注射到耻骨直肠肌来治疗便秘；00334通过上眼的睑侧睑板前的眼轮匝肌注射和下眼睑的侧睑板前的眼轮匝肌注射，每次肌内注射约15UBOTOX来治疗睑

37、痉挛；00345在眼外肌肌内注射约15U的BOTOX用于治疗斜视，注射量根据待注射的肌肉大小以及想要达到的肌肉麻痹程度例如，所需的屈光度矫正量而变化；00356通过对上肢5处不同的屈肌进行BOTOX肌内注射来治疗中风后的上肢痉挛，所述5处屈肌如下0036A指深屈肌FLEXORDIGITORUMPROFUNDUS75U到30U0037B指浅屈肌FLEXORDIGITORUMSUBLIMUS75U到30U0038C尺侧腕屈肌FLEXORCARPIULNARIS10U到40U0039D桡侧腕屈肌FLEXORCARPIRADIALIS15UTO60U0040E肱二头肌BICEPSBRACHII50U到

38、200U。0041所示五种肌肉的每一种都在同一治疗期注射，因此在每个治疗期患者通过肌内注射使上肢屈肌肌肉接受90U到360UBOTOX说明书CN102056620ACN102056627A7/19页1000427为治疗偏头痛，在颅骨膜PERICRANIAL向眉间肌、额肌和颞肌对称注射注射25U的BOTOX作为偏头痛的一种预防性治疗，与载体相比已显示出显著的好处，这可以通过测量25U注射之后的三个月中偏头痛频率、最大严重程度、伴随的呕吐和急性药物使用的下降程度而测出。0043已知A型肉毒毒素效能最长可达12个月EUROPEANJNEUROLOGY6SUPP4S111S11501999，并且当用于

39、治疗腺体如治疗多汗时，在一些情况下效能可长达27个月，参见，例如BUSHARAK，BOTULINUMTOXINANDRHINORRHEA，OTOLARYNGOLHEADNECKSURG1996；1143507，和THELARYNGOSCOPE109134413461999。然而，通常肌内注射BOTOX的效能一般持续时间约为3到4个月。0044使用A型肉毒毒素治疗各种临床疾病的成功已引起对其他肉毒毒素血清型的关注。两种市售的人用A型肉毒毒素制剂是可购于加利福尼亚州欧文市的阿勒根公司的BOTOX和可购于英国波顿唐的博福益普生BEAUFOURIPSEN，PORTONDOWN，ENGLAND的DYSP

40、ORTB型肉毒毒素制剂MYOBLOC可购于加利福尼亚州旧金山的SOLSTICEPHARMACEUTICALS。0045肉毒毒素已被提议用于或已被用于治疗中耳炎美国专利5,766,605、内耳疾病美国专利6,265,379；6,358,926、紧张性头痛美国专利6,458,365和6,776,992、偏头痛美国专利5,714,468、窦性头痛美国专利6,838,434、术后疼痛和内脏痛美国专利6,464,986、头发生长和头发维持美国专利6,299,893、银屑病和皮炎美国专利5,670,484、肌肉损伤美国专利6,423,319、各种癌症美国专利6,139,845、平滑肌疾病美国专利5,437

41、,291和神经源性炎症美国专利6,063,768。已知控释毒素植入参见，例如美国专利6,306,423和6,312,708可作为肉毒毒素经皮给药方式美国专利申请10/194,805。2005年8月24日提交的序列号为11/211,311的美国专利申请公布文本NO2007/0048334A1公开了通过对患者的头、颈和肩部肌肉给药将一种肉毒毒素用于改善胃排空和/或治疗胃食管反流病GERD。已知肉毒毒素可用来削弱口腔咀嚼肌或咬肌，因此可治疗自身造成的伤口及其所致的溃疡PAYNEM，ETAL，BOTULINUMTOXINASANOVELTREATMENTFORSELFMUTILATIONINLESCH

42、NYHANSYNDROME，ANNNEUROL2002SEPTEMBER；523SUPP1S157。2004年1月18日提交的序列号为11/039,506的美国专利申请公布文本NO20050191321A1公开了通过梭菌毒素的局部给药来治疗药物滥用疾病MOD。2005年12月28日提交的序列号为11/319,880的美国专利申请公开文本NO20060104995A1公开了将肉毒毒素用于头部。00462004年10月12日提交的序列号为10/964,898的美国专利申请公布文本NO20050147626A1公开了通过向三岔感觉神经或其附近区域进行周围给予肉毒毒素来治疗或预防一种神经疾病和/或一种

43、神经精神疾病。2005年12月7日提交的序列号为11/296,079的美国专利申请公布文本NO20060171963A1公开了一种用于减轻与偏头痛、三叉神经自主性头痛和由血管疾病引起的头痛相关的疼痛的方法，该方法是通过向神经末梢周围给予治疗有效量的突触前神经毒素来实现的，所述神经末梢选自三叉神经末梢、枕部神经末梢和鼻副交感神经末梢。0047此外，肉毒毒素可能具有减轻大鼠福尔马林模型中诱导性炎性疼痛的作用AOKIK，ETAL，MECHANISMSOFTHEANTINOCICEPTIVEEFFECTOFSUBCUTANEOUSBOTOX说明书CN102056620ACN102056627A8/19

44、页11INHIBITIONOFPERIPHERALANDCENTRALNOCICEPTIVEPROCESSING，CEPHALALGIA2003SEP；237649。此外，有报道称肉毒毒素神经阻断可引起表皮厚度减小LIY，ETAL，SENSORYANDMOTORDENERVATIONINFLUENCESEPIDERMALTHICKNESSINRATFOOTGLABROUSSKIN，EXPNEUROL1997；147452462参见459页。最后，已知可对足部给予肉毒毒素来治疗足部过量出汗KATSAMBASA，ETAL，CUTANEOUSDISEASESOFTHEFOOTUNAPPROVEDTR

45、EATMENTS，CLINDERMATOL2002NOVDEC；206689699；SEVIM，S，ETAL，BOTULINUMTOXINATHERAPYFORPALMARANDPLANTARHYPERHIDROSIS，ACTANEUROLBEIG2002DEC；102416770、足趾痉挛SUPUTTITADA，A，LOCALBOTULINUMTOXINTYPEAINJECTIONSINTHETREATMENTOFSPASTICTOES，AMJPHYSMEDREHABIL2002OCT；81107705、特发性足尖步行IDIOPATHICTOEWALKINGTACKS，L，ETAL，IDIO

46、PATHICTOEWALKINGTREATMENTWITHBOTULINUMTOXINAINJECTION，DEVMEDCHILDNEUROL2002；44SUPPL916，和足部肌张力障碍ROGERSJ，ETAL，INJECTIONSOFBOTULINUMTOXINAINFOOTDYSTONIA，NEUROLOGY1993APR；434SUPPL2。破伤风毒素及其衍生物即含有非天然靶向部分、片段、杂合体和嵌合体也可具有治疗效用。破伤风毒素有很多与肉毒毒素类似之处。另外，破伤风毒素和肉毒毒素是由梭菌属的近缘种分别为破伤风梭菌CLOSTRIDIUMTETANI和肉毒杆菌产生的多肽。0048此外，

47、破伤风毒素和肉毒毒素都是由轻链分子量约50KD和重链分子量约100KD经单个二硫键共价结合构成的双链蛋白质。因此，破伤风毒素和七种肉毒毒素未复合的的每一种的分子量都是约150KD。而且，破伤风毒素和肉毒毒素的轻链都具有表现出细胞内生物蛋白酶活性的结构域，而重链则含有受体结合免疫原性结构域和细胞膜易位结构域。0049此外，破伤风毒素和肉毒毒素都表现出对突触前胆碱能神经元表面的神经节苷脂受体具有高的特异亲和力。受体介导的周围胆碱能神经元对破伤风毒素的胞吞作用可导致逆向轴突输送、对抑制性神经递质从中枢突触释放的阻断和痉挛性麻痹。相反，受体介导的周围胆碱能神经元对肉毒毒素的胞吞作用可导致程度非常小的逆

48、向轴突输送如果有，从中毒的周围运动神经元的乙酰胆碱出胞作用的抑制以及迟缓性麻痹。0050最后，破伤风毒素和肉毒毒素在生物合成和分子建构两方面都很类似。破伤风毒素和A型肉毒毒素的蛋白序列之间总共有34一致，一些功能结构域的序列一致性则高达到62BINZTETAL，THECOMPLETESEQUENCEOFBOTULINUMNEUROTOXINTYPEAANDCOMPARISONWITHOTHERCLOSTRIDIALNEUROTOXINS，JBIOLOGICALCHEMISTRY26516；915391581990。0051乙酰胆碱0052通常哺乳动物神经系统的每种神经元类型仅释放单一的一类小分

49、子神经递质。神经递质乙酰胆碱是由脑的很多区域的神经元分泌的，但是具体来说是由如下部分分泌运动皮层的大椎体细胞、基底神经节的一些不同神经元、支配骨骼肌的运动神经元、自主神经系统交感和副交感神经系统的节前神经元、副交感神经系统的节后神经元和交感神经系统的一些节后神经元。基本上，只有连接汗腺、立毛肌PILOERECTORMUSCLE和小部分血管的节后交感神经纤维是胆碱能的，因为交感神经系统的大部分节后神经元分泌神经递质去甲肾上腺素。在大部分情况下，乙酰胆碱具有兴奋作用。但是，已知乙酰胆碱对一些周说明书CN102056620ACN102056627A9/19页12围副交感神经末梢是有抑制作用的，例如通过迷走神经抑制心率。0053自主神经系统的传出信号是通过交感神经系统或副交感神经系统传向身体的。交感神经系统的节前神经元由位于脊髓中间外侧角INTERMEDIOLATERALHORN的神经节前交感神经神经元胞体延伸出来。所述神经节前交感神经纤维从细胞体延伸出来，与位于脊椎旁交感神经节或椎前神经节的节后神经元形成突触。因为交感和副交感神经系统的神经节前神经元都是胆碱能的，将乙酰胆碱施用给神经节将使交感和副交感节后神经元兴奋。0054乙酰胆碱能激活两种受体毒蕈碱受体和烟碱受体。由副交感神经系统的节后神经元激发的所有效应细胞都有毒蕈碱受体，交感神经系统的节后胆碱能神经元激发