用于制备薄芝糖肽注射液的灵芝属薄树芝菌的培养基.pdf

1、10申请公布号CN101993281A43申请公布日20110330CN101993281ACN101993281A21申请号200910166558622申请日20090826C05G1/00200601A01G1/04200601A61K36/074200601A61K9/08200601A61P39/06200601A61P37/04200601A61P21/00200601A61P1/08200601A61P25/00200601A61P25/08200601A61P25/20200601C12P1/02200601C12P21/00200601C12P19/04200601C12R1

2、/64520060171申请人扬州制药有限公司地址225009江苏省扬州市文峰南路7号申请人江苏联环药业股份有限公司72发明人姚兴田贺曾佑吴文格胡长坤潘和平左义华74专利代理机构北京连和连知识产权代理有限公司11278代理人贺小明54发明名称用于制备薄芝糖肽注射液的灵芝属薄树芝菌的培养基57摘要本发明提供了一种用于制备薄芝糖肽注射液的灵芝属薄树芝菌的培养基、用该培养基培养灵芝属薄树芝菌的方法以及利用该培养基培养的薄树芝菌来制备薄芝糖肽注射液的方法。所述培养基的配方为黄豆饼粉2030、麸皮粉1020、蔗糖3050、硫酸铵004006、硫酸镁00501、磷酸二氢钠0102、磷酸氢二钠0204、豆油

3、0406、维生素B200000500002、赖氨酸0000100003、甘氨酸0000200004，其余为水。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图1页CN101993284A1/1页21一种用于制备薄芝糖肽注射液的灵芝属薄树芝菌的培养基，其特征在于，该培养基的配方为黄豆饼粉2030、麸皮粉1020、蔗糖3050、硫酸铵004006、硫酸镁00501、磷酸二氢钠0102、磷酸氢二钠0204、豆油0406、维生素B200000500002、赖氨酸0000100003、甘氨酸0000200004，其余为水。2如权利要求1所述的培养基，其特征在于，

4、该培养基的配方为黄豆饼粉25、麸皮粉15、蔗糖40、硫酸铵005、硫酸镁0075、磷酸二氢钠015、磷酸氢二钠03、豆油05、维生素B200001、赖氨酸00002、甘氨酸00003，其余为水。3用权利要求1或2所述的培养基培养灵芝属薄树芝菌的方法。4一种利用权利要求1或2所述的培养基培养的薄树芝菌来制备薄芝糖肽注射液的方法，包括下列步骤A将灵芝属薄树芝菌株置所述培养基中发酵培养，得菌丝体；B将所得菌丝体用醇液进行提取，静置，得薄芝糖肽提取液；C将上述提取液进行稀配、灌封、灭菌，得薄芝糖肽注射液。5如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤B中所述的醇液为乙醇、丙醇、1，2丙二醇中的一种或几种。

5、6如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤B中所述的醇液为7595的乙醇水溶液。7如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤B中静置的温度为015，静置的时间为616小时。8如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤C中对提取液进行稀配、过滤、灌封的过程中，将提取液温度控制在020。9如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤C中对提取液进行稀配、过滤、灌封的过程中，将提取液温度控制在46。10如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤C中提取液进行稀配、过滤、灌封的过程在10000级背景下局部100级的空气洁净度条件下进行。权利要求书CN101993281ACN101993284A1/4页3用于

6、制备薄芝糖肽注射液的灵芝属薄树芝菌的培养基技术领域0001本发明涉及生物和化工技术领域。更具体地说，涉及一种用于制备薄芝糖肽注射液的灵芝属薄树芝菌的培养基、用该培养基培养灵芝属薄树芝菌的方法以及利用该培养基培养的薄树芝菌来制备薄芝糖肽注射液的方法。背景技术0002薄芝糖肽注射液系用GCL菌株，经液体发酵培养制得薄树芝干燥菌丝体，菌丝体经提取、纯化、稀配、过滤、灌封而制得的灭菌水溶液。0003本品具有调节机体免疫功能的作用，对机体非特异性免疫、体液免疫及细胞免疫等有促进作用；具有抗氧化作用，清除氧自由基，还有促进核酸、蛋白质生物合成作用。临床使用静脉注射或肌肉注射治疗进行性肌营养不良、萎缩性肌强

7、直及前庭功能障碍、高血压等引起的眩晕和植物神经功能紊乱、癫痫、失眠等症，亦可用于肿瘤、肝炎的辅助治疗。0004多糖、多肽是薄芝糖肽注射液的主要有效成分，现行国家药品标准中，薄芝糖肽注射液的规格为2ML中含多糖5MG，含多肽1MG，产品中多糖多肽的含量不得低于标示量的90。0005当前工业化规模生产中，单位发酵液中多糖多肽的得量不高，每毫升发酵液平均得多糖05毫克，得多肽01毫克。0006在薄芝糖肽注射液质量标准中，可见异物和热原是两个重要检查项目，因本品是经发酵制备的产品，如生产条件控制不当，很易造成上述两项达不到标准要求，从而降低成品收率。0007如何提高单位发酵液中多糖多肽的得量，以及如何

8、改进稀配、灌装工艺，使可见异物、热原两项质量指标稳定合格，对提高薄芝糖肽注射液的技术水平、提高产品质量、降低生产成本方面具有重要意义。发明内容0008因此，本发明的一个目的是提供一种适合灵芝属薄树芝菌生长、代谢的发酵培养基配方。0009该培养基的配方为黄豆饼粉2030、麸皮粉1020、蔗糖3050、硫酸铵004006、硫酸镁00501、磷酸二氢钠0102、磷酸氢二钠0204、豆油0406、维生素B200000500002、赖氨酸0000100003、甘氨酸0000200004，其余为水。0010上述培养基的配方优选黄豆饼粉25、麸皮粉15、蔗糖40、硫酸铵005、硫酸镁0075、磷酸二氢钠01

9、5、磷酸氢二钠03、豆油05、维生素B200001、赖氨酸00002、甘氨酸00003，其余为水。0011本发明的另一个目的是提供一种用上述培养基培养灵芝属薄树芝菌的方法。0012本发明的再一个目的是提供一种利用上述培养基培养的薄树芝菌来制备薄芝糖说明书CN101993281ACN101993284A2/4页4肽注射液的方法。0013上述薄芝糖肽注射液的制备方法，包括下列步骤0014A将灵芝属薄树芝菌株置上述培养基中发酵培养，得菌丝体；0015B将所得菌丝体用醇溶剂进行提取，静置，得薄芝糖肽提取液；0016C将上述提取液进行稀配、灌封、灭菌，得薄芝糖肽注射液；0017其中，步骤B中所述的醇为乙

10、醇、丙醇、1，2丙二醇中的一种或几种，优选乙醇，更优选7595的乙醇水溶液，最优选85的乙醇水溶液；0018考虑到薄芝糖肽注射液为经发酵得到，为去除产品中蛋白质、鞣质等杂质，故提取液在稀配前，增加了步骤B中的低温静置过程；具体说，步骤B中静置的温度为015，优选2；静置的时间为616小时，优选10小时；0019此外，在注射液稀配过滤灌装过程中，控制药液在较低温度范围内，以防止微生物污染；具体说，步骤C中对提取液进行稀配、过滤、灌封的过程中，将提取液温度控制在020，优选控制在46；0020另外，薄芝糖肽注射液属最终灭菌的小容量注射剂，按GMP药品生产质量管理规范要求，最终灭菌的小容量注射剂的稀

11、配、过滤和灌封应在10000级空气洁净条件下进行。本发明考虑到产品的特点，为了进一步提高产品的质量，提高了对制造环境的洁净度要求。即，步骤C中提取液进行稀配、过滤、灌封的过程在10000级背景下局部100级的空气洁净度条件下进行。0021采用本发明的培养基培养的灵芝属薄树芝菌菌丝粗壮，单位发酵液中多糖、多肽的产量显著提高，平均每毫升发酵液可得多糖08毫克，可得多肽014毫克。利用该培养基培养的薄树芝菌制备的薄芝糖肽注射液，其产品质量得到明显提高。其中，可见异物、热原两检查项目符合要求，一次成品合格率达98以上。附图说明0022图1是本发明的薄芝糖肽注射液工业化规模的生产工艺流程图。具体实施方式

12、0023为了更加清楚地对本发明进行说明，以下通过具体实施例对本发明的具体实施方式进行详细说明。但是应该理解，以下所述具体实施例仅用于对本发明进行示例性地说明，而非用于对本发明进行任何性质的限定，其中所用材料、试剂等仅为代表性的，其并不限于所列举的情况。所属技术领域的技术人员通过阅读以下说明可以对本发明做出不脱离本发明权利要求所限定的保护范围的改动和改进，这些改动和改进也处于本发明所要求保护的范围内。0024本发明的生产工艺流程如图1所示。下面是对流程图中所提到的材料和步骤的详细说明。00251菌种灵芝属薄树芝GANODERMACAPENSELLOGDTENG00262斜面菌种的制备0027培养

13、基蔗糖2、磷酸二氢钠03、硫酸镁015、琼脂2、麸皮5，25恒温培养56天，待白色菌丝布满斜面，4保存。说明书CN101993281ACN101993284A3/4页500283一级种子瓶制备0029培养基蔗糖2、磷酸二氢钠03、硫酸镁015、琼脂2、麸皮5和维生素B200001。接入斜面菌种，2628摇床培养7296小时，至菌液浅黄棕色，澄清，菌球多刺，直径3毫米左右。00304二级种子瓶制备0031培养基蔗糖2、磷酸二氢钠03、硫酸镁015、琼脂2、麸皮5和维生素B200001。0032接入一级种子瓶液，种量8，2628培养7296小时，至菌液浅黄棕色，澄清，菌球多刺，直径35毫米。003

14、35种子罐培养0034培养基配比黄豆饼粉2030、麸皮粉1020、蔗糖3050、硫酸铵004006、硫酸镁00501、磷酸二氢钠0102、磷酸氢二钠0204、豆油0406、维生素B200000500002、赖氨酸0000100003、甘氨酸0000200004，其余为水。0035最佳培养基配比为黄豆饼粉25、麸皮粉15、蔗糖40、硫酸铵005、硫酸镁0075、磷酸二氢钠015、磷酸氢二钠03、豆油05、维生素B200001、赖氨酸00002、甘氨酸00003，其余为水。0036实罐灭菌，罐压01MPA122灭菌30分钟，保压01MPA，降温至培养温度，接入二级种瓶液，培养条件温度2628，罐压

15、005MPA，空气流量016小时时1015立方米/时；16小时放罐20立方米/时。00376发酵罐培养0038培养基配比黄豆饼粉2030、麸皮粉1020、蔗糖3050、硫酸铵004006、硫酸镁00501、磷酸二氢钠0102、磷酸氢二钠0204、豆油0406、维生素B200000500002、赖氨酸0000100003、甘氨酸0000200004，其余为水。0039最佳培养基配比为黄豆饼粉25、麸皮粉15、蔗糖40、硫酸铵005、硫酸镁0075、磷酸二氢钠015、磷酸氢二钠03、豆油05、维生素B200001、赖氨酸00002、甘氨酸00003，其余为水。0040实罐灭菌，罐压01MPA，12

16、2灭菌30分钟，保压01MPA，降温至培养温度，利用压差将种子罐种子压入发酵罐。0041培养条件温度2628，罐压005MPA，空气流量016小时520立方米/时，16小时放罐25立方米/时，培养时间6678小时。0042放罐条件菌丝内充满液泡，分枝分节部分断裂，溶液浅黄棕色，发酵液开始变稀。00437发酵液及菌丝体处理0044放罐发酵液以离心机脱水，所得潮菌丝体于7080干燥，至水份5，得干菌丝体。00458菌丝体提取0046菌丝体以7595乙醇或丙醇提取，过滤，得提取液。0047最佳提取工艺为干菌丝体加85乙醇，回流提取2次，加活性炭，搅拌过滤，滤液说明书CN101993281ACN101

17、993284A4/4页6减压赶醇，加注射用水，于2静置10小时，过滤，得提取液。00489提取液静置0049提取液在015静置616小时。0050最佳提取液静置条件为提取液稀配前2静置10小时。005110稀配0052控制药液温度020进行稀配。0053最佳稀配工艺为操作在10000级背景下局部100级中进行，控制药液温度46，以5碳酸氢钠液调节提取液，PH值为5865，加注射用水，使溶液中多糖含量为2510毫克/毫升，多肽含量为052毫克/毫升，经045毫微米和022毫微米滤器过滤，在20003000LX照度下灯检，药液应为浅黄棕色溶液，澄明，无可见异物。005411灌封0055控制药液温度020进行灌封。0056最佳灌封工艺为操作在10000级背景下局部100级中进行，控制药液温度46。0057将灯检合格的药液按规定装量灌注至洁净安瓿中，封口。005812灭菌0059在121流通蒸气下灭菌30分钟。说明书CN101993281ACN101993284A1/1页7图1说明书附图CN101993281A