一种培养鸡HD11巨噬细胞的新方法.pdf

1、10申请公布号CN104059879A43申请公布日20140924CN104059879A21申请号201410317770922申请日20140704C12N5/078620100171申请人江苏省家禽科学研究所地址225125江苏省扬州市邗江区仓颉路58号72发明人刘向萍窦新红常国斌王克华朱静陈国宏74专利代理机构南京苏高专利商标事务所普通合伙32204代理人柏尚春54发明名称一种培养鸡HD11巨噬细胞的新方法57摘要一种培养鸡HD11巨噬细胞的新方法，分别用RPMI1640和DMEM两种不同的培养基，添加不同比例的胎牛血清和鸡血清，分别培养5小时、10小时、24小时、48小时后，通过M

2、TT比色试验，检测最佳培养体系，得到培养鸡巨噬细胞HD11的最优培养基方案，发现培养基RPMI1640的培养效果要优于用培养基DMEM培养和当培养基含25的鸡血清时，培养效果最优。51INTCL权利要求书2页说明书5页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书5页附图5页10申请公布号CN104059879ACN104059879A1/2页21一种培养鸡HD11巨噬细胞的新方法，其特征在于分别用RPMI1640和DMEM两种不同的培养基，添加不同比例的胎牛血清和鸡血清，分别培养5小时、10小时、24小时、48小时后，通过MTT比色试验，记录光吸收结果；最后以时

3、间为横轴，光吸收值A为纵轴绘制细胞生长曲线，检测最佳培养体系，具体步骤为1HD11细胞的准备取生长状态良好，处于对数期生长的细胞两瓶；2MTT溶液的制备称取125MGMTT，放入小烧杯中，加25MLPBS001MOL/L，PH74，在磁力搅拌机上搅拌30MIN，用022M的过滤器过滤除菌，分装，4保存，两周内有效，二甲基亚砜DMSO,使用分析纯产品；3培养基，胎牛血清及鸡血清的准备分别准备两种未添加任何血清的培养基RPMI1640和DMEM，各50ML，预热；预热好的胎牛血清和鸡血清各25ML；所述步骤3的具体步骤为1取生长状态良好，出于对数期生长的两瓶HD11细胞，分别计数；2收集细胞，用P

4、BS清洗23次，离心1000RPM，5MIN弃上清，分别用未加任何血清的RPMI1640和DMEM重悬备用；3分别制备含不同鸡血清的两种培养基ARPMI1640ARPMI164010FBS25鸡血清重悬细胞；BRPMI164010FBS5鸡血清重悬细胞；CRPMI164010FBS10鸡血清重悬细胞；DRPMI164015鸡血清重悬细胞；BDMEM；EDMEM10FBS25鸡血清重悬细胞；FDMEM10FBS5鸡血清重悬细胞；GDMEM10FBS10鸡血清重悬细胞；HDMEM15鸡血清重悬细胞；4接种细胞按以上体系，将细胞接种于96孔板中，且每个水平4个重复；5细胞培养放入CO2培养箱，在5C

5、O2、37条件下，按设计的时间分别培养5小时、10小时、24小时、48小时；6呈色按设计时间培养后，每孔加入MTT溶液5MG/ML20UL，37继续孵育4小时，终止培养，离心1000R/MIN,15MIN小心弃去孔内培养液，每孔加入150ULDMSO，振荡10MIN，使甲臜充分溶解；7比色选择490NM波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值A为纵轴绘制细胞生长曲线；8结果RPMI1640培养基与DMEM培养基比较差异极显著；不同的培养时间之间比较差异不显著；用不同鸡血清浓度培养之间比较差异极显著，两种培养基与不同培养时间之间互作比较，差异不显著；不同培养基与

6、不同鸡血清浓度之间互作比较，差异极显著；不同培养时间与不同鸡血清浓度之间互作比较差异不显著；三者互作，差异不显著；通过两种多重比较方法显示，不同鸡血清浓度培养时，血清浓度为25与其他三种鸡血清浓度有极显著的差异；并得到培养鸡巨噬细胞HD11的最优培养基方案为RPMI1640SIGMA公司，权利要求书CN104059879A2/2页310新生牛血清补充热灭活，100MMHEPES，10MM丙酮酸钠，01MM非必需氨基酸，20MM谷氨酰胺，100UML1的青霉素100G/ML链霉素，5105M2巯基乙醇PH值73，25鸡血清。2一种根据权利要求1所述的培养鸡HD11巨噬细胞的新方法，其特征在于培养

7、基RPMI1640的培养效果要优于用培养基DMEM培养。3一种根据权利要求1所述的培养鸡HD11巨噬细胞的新方法，其特征在于当培养基含25的鸡血清时，培养效果最优。权利要求书CN104059879A1/5页4一种培养鸡HD11巨噬细胞的新方法技术领域0001本发明涉及动物细胞培养领域具体涉及细胞培养技术。背景技术0002巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。鸡HD11巨噬细胞属于悬浮细胞，该细胞的现有的培养体系RPMI1640SIGMA公司，10新生牛血清补充热灭活，100MMHEPES，10MM丙酮酸钠，01MM非必需氨基酸，20MM谷氨酰胺，100

8、UML1的青霉素100G/ML链霉素，5105M2巯基乙醇PH值73和5的二氧化碳。培养瓶横放如培养箱时培养基的深度超过5MM，当培养瓶直立放置时，培养基高度超过10CM，还需要深层通入CO2和空气，以保证足够的气体交换。0003鸡HD11巨噬细胞目前的培养体系存在细胞生长缓慢，增殖效率低以及转染效率低等问题，影响了巨噬细胞在相关科学研究中的应用，阻碍了家禽免疫研究进展。发明内容0004为了解决现有技术的问题，本发明以鸡巨噬细胞HD11细胞为研究对象，改进培养体系，用RPMI1640和DMEM两种不同培养基培养，并分别添加不同比例胎牛血清和鸡血清，在不同培养期间比较HD11细胞培养效果，旨在建

9、立一种新的培养方法。本发明采用的技术方案如下0005一种培养鸡HD11巨噬细胞的新方法，分别用RPMI1640和DMEM两种不同的培养基，添加不同比例的胎牛血清和鸡血清，分别培养5小时、10小时、24小时、48小时后，通过MTT比色试验，记录光吸收结果；最后以时间为横轴，光吸收值A为纵轴绘制细胞生长曲线，检测最佳培养体系，具体步骤为00061HD11细胞的准备取生长状态良好，处于对数期生长的细胞两瓶；00072MTT溶液的制备称取125MGMTT，放入小烧杯中，加25MLPBS001MOL/L，PH74，在磁力搅拌机上搅拌30MIN，用022M的过滤器过滤除菌，分装，4保存，两周内有效，二甲基

10、亚砜DMSO,使用分析纯产品；00083培养基，胎牛血清及鸡血清的准备分别准备两种未添加任何血清的培养基RPMI1640和DMEM，各50ML，预热；预热好的胎牛血清和鸡血清各25ML；0009所述步骤3的具体步骤为00101取生长状态良好，出于对数期生长的两瓶HD11细胞，分别计数；00112收集细胞，用PBS清洗23次，离心1000RPM，5MIN弃上清，分别用未加任何血清的RPMI1640和DMEM重悬备用；00123分别制备含不同鸡血清的两种培养基0013ARPMI16400014IRPMI164010FBS25鸡血清重悬细胞；0015JRPMI164010FBS5鸡血清重悬细胞；说明

11、书CN104059879A2/5页50016KRPMI164010FBS10鸡血清重悬细胞；0017LRPMI164015鸡血清重悬细胞；0018BDMEM；0019MDMEM10FBS25鸡血清重悬细胞；0020NDMEM10FBS5鸡血清重悬细胞；0021ODMEM10FBS10鸡血清重悬细胞；0022PDMEM15鸡血清重悬细胞；00234接种细胞按以上体系，将细胞接种于96孔板中，且每个水平4个重复；00245细胞培养放入CO2培养箱，在5CO2、37条件下，按设计的时间分别培养5小时、10小时、24小时、48小时；00256呈色按设计时间培养后，每孔加入MTT溶液5MG/ML20UL

12、，37继续孵育4小时，终止培养，离心1000R/MIN,15MIN小心弃去孔内培养液，每孔加入150ULDMSO，振荡10MIN，使甲臜充分溶解；00267比色选择490NM波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值A为纵轴绘制细胞生长曲线；00278结果RPMI1640培养基与DMEM培养基比较差异极显著；不同的培养时间之间比较差异不显著；用不同鸡血清浓度培养之间比较差异极显著，两种培养基与不同培养时间之间互作比较，差异不显著；不同培养基与不同鸡血清浓度之间互作比较，差异极显著；不同培养时间与不同鸡血清浓度之间互作比较差异不显著；三者互作，差异不显著；通过两种

13、多重比较方法显示，不同鸡血清浓度培养时，血清浓度为25与其他三种鸡血清浓度有极显著的差异；并得到培养鸡巨噬细胞HD11的最优培养基方案为RPMI1640SIGMA公司，10新生牛血清补充热灭活，100MMHEPES，10MM丙酮酸钠，01MM非必需氨基酸，20MM谷氨酰胺，100UML1的青霉素100G/ML链霉素，5105M2巯基乙醇PH值73，25鸡血清。0028本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是0029鸡巨噬细胞HD11能够更快、更好的生长，提高增殖效率，新的培养体系，使细胞迅速增长，且细胞活力增加，缩短试验时间，使后续试验更好的进行。附图说明0030图15H，DMEM10胎牛血

14、清25鸡血清；0031图210H，DMEM10胎牛血清25鸡血清；0032图324H，DMEM10胎牛血清25鸡血清；0033图448H，DMEM10胎牛血清25鸡血清；0034图55H，RPMI164010胎牛血清25鸡血清；0035图610H，RPMI164010胎牛血清25鸡血清；0036图724H，RPMI164010胎牛血清25鸡血清；0037图848H，RPMI164010胎牛血清25鸡血清；0038图9不同培养基之间的细胞生长图图10不同鸡血清浓度之间的细胞生长图。说明书CN104059879A3/5页6具体实施方式0039下面结合附图对本发明作进一步详细描述0040实施例004

15、1本发明的技术方案是分别用RPMI1640和DMEM两种不同的培养基，添加不同比例的胎牛血清和鸡血清，分别培养5小时、10小时、24小时、48小时后，通过MTT比色试验，检测最佳培养体系。0042具体步骤为首先用两种不同培养基按设置的时间培养细胞；其次用MTT比色试验检测，记录光吸收结果；最后以时间为横轴，光吸收值A为纵轴绘制细胞生长曲线。00431材料与方法004411材料0045111HD11细胞的准备0046取生长状态良好，处于对数期生长的细胞两瓶。0047112MTT溶液的制备0048称取125MGMTT，放入小烧杯中，加25MLPBS001MOL/L，PH74，在磁力搅拌机上搅拌30

16、MIN，用022M的过滤器过滤除菌，分装，4保存。两周内有效。二甲基亚砜DMSO,使用分析纯产品0049113培养基，胎牛血清及鸡血清的准备0050分别准备两种未添加任何血清的培养基RPMI1640和DMEM，各50ML，预热；预热好的胎牛血清和鸡血清各25ML。0051具体步骤00521取生长状态良好，出于对数期生长的两瓶HD11细胞，分别计数；00532收集细胞，用PBS清洗23次，离心1000RPM，5MIN弃上清，分别用未加任何血清的RPMI1640和DMEM重悬备用；00543分别制备含不同鸡血清的两种培养基0055ARPMI16400056QRPMI164010FBS25鸡血清重悬

17、细胞0057RRPMI164010FBS5鸡血清重悬细胞0058SRPMI164010FBS10鸡血清重悬细胞0059TRPMI164015鸡血清重悬细胞0060BDMEM0061UDMEM10FBS25鸡血清重悬细胞0062VDMEM10FBS5鸡血清重悬细胞0063WDMEM10FBS10鸡血清重悬细胞0064XDMEM15鸡血清重悬细胞00654接种细胞按以上体系，将细胞接种于96孔板中，且每个水平4个重复。00665细胞培养放入CO2培养箱，在5CO2、37条件下，按设计的时间分别培养5小时、10小时、24小时、48小时。00676呈色按设计时间培养后，每孔加入MTT溶液5MG/ML2

18、0UL，37继续孵育4说明书CN104059879A4/5页7小时，终止培养，离心1000R/MIN,15MIN小心弃去孔内培养液，每孔加入150ULDMSO，振荡10MIN，使甲臜充分溶解。00687比色选择490NM波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值A为纵轴绘制细胞生长曲线。00692结果007021不同培养体系之间培养效果比较见表10071表1不同培养体系之间培养效果比较00720073注同列比较时，”表示差异极显著，”表示差异显著；同行比较时，大写字母”A”或”B”或”C”表示差异极显著，小写字母”A”或”B”或”C”或”D”表示差异显著。007

19、422不同培养时间、培养基、不同血清浓度之间的方差分析0075表2不同培养时间、培养基、不同血清浓度之间的方差分析0076源III型平方和DF均方FSIG校正模型1996A310645910000截距10441104495810000MEDIUM10441104495787000TIME0263009802498SERUM27230918317000MEDIUMTIME0263009803497MEDIUMSERUM27230918317000TIMESERUM17890201817082MEDIUMTIMESERUM17890201817082误差69764011总计373796校正的总计2

20、6939500770078通过上表数据得出，RPMI1640培养基与DMEM培养基比较差异极显著；不同的培养时间之间比较差异不显著；用不同鸡血清浓度培养之间比较差异极显著。两种培养基与不说明书CN104059879A5/5页8同培养时间之间互作比较，差异不显著；不同培养基与不同鸡血清浓度之间互作比较，差异极显著；不同培养时间与不同鸡血清浓度之间互作比较差异不显著；三者互作，差异不显著。007923不同鸡血清浓度之间的多重比较0080表3不同鸡血清浓度之间的多重比较00810082由上表得出通过两种多重比较方法显示，不同鸡血清浓度培养时，血清浓度为25与其他三种鸡血清浓度有极显著的差异。0083

21、24细胞生长图0084241不同培养基之间的细胞生长比较图90085由此图可知，培养基RPMI1640的培养效果要优于用培养基DMEM培养。0086242不同鸡血清浓度之间的细胞生长图图100087由图可知当培养基含25的鸡血清时，培养效果最优。0088具体细胞培养见附图1800893结论0090由以上数据表明，培养鸡巨噬细胞HD11的最优培养基方案为RPMI1640SIGMA公司，10新生牛血清补充热灭活，100MMHEPES，10MM丙酮酸钠，01MM非必需氨基酸，20MM谷氨酰胺，100UML1的青霉素100G/ML链霉素，5105M2巯基乙醇PH值73，25鸡血清。说明书CN104059879A1/5页9图1图2说明书附图CN104059879A2/5页10图3图4说明书附图CN104059879A103/5页11图5图6说明书附图CN104059879A114/5页12图7图8说明书附图CN104059879A125/5页13图9图10说明书附图CN104059879A13