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1、(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202410025519.9(22)申请日 2024.01.08(71)申请人 深圳粒影生物科技有限公司地址 518107 广东省深圳市光明区凤凰街道塘尾社区恒泰裕大厦3B栋18楼(72)发明人 石竟成宋晓慧李艳孙耀玺张影葛建敬(51)Int.Cl.C12N 15/67(2006.01)C12N 15/81(2006.01)C07K 14/78(2006.01)C07K 19/00(2006.01)C12R 1/84(2006.01)(54)发明名称一种提高外源蛋白表达量的方法(57)摘要本发明提。
2、供了一种提高外源蛋白表达量的方法，属于生物技术领域，本发明在目的蛋白的N端引入两个组氨酸，使得蛋白的表达量得到了显著提高；相比于其它技术，本发明方法操作更简便，并且维持了外源蛋白的理化性质如蛋白质的高级结构和生物活性。本发明还提供了高表达的重组胶原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1或2所示。权利要求书1页 说明书4页序列表（电子公布）附图3页CN 117511978 A2024.02.06CN 117511978 A1.一种提高外源蛋白表达量的方法，其特征在于，是在编码外源蛋白的核苷酸序列的5 端添加编码两个组氨酸的核苷酸进行表达。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达是。
3、在毕赤酵母中表达。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源蛋白为胶原蛋白。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：i）将目的基因通过克隆组装至载体质粒上，转化至大肠杆菌中扩增，抽提质粒；ii）用快切酶对质粒进行线性化，电转化至毕赤酵母，使用YPD抗性平板进行初筛和复筛；iii）将转化子挑取至BMGY培养基中，培养后离心弃上清；使用BMMY培养基将菌体重悬，诱导培养；培养液经分离纯化得到目的蛋白。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的载体质粒为pPICZA，所述的大肠杆菌为大肠杆菌JM109，所述的快切酶为酶SacI，所述的毕赤酵母为毕赤酵母GS115。6.。
4、根据权利要求4所述的方法，其特征在于，使用YPD抗性平板进行初筛和复筛是指使用100g/mL的YPD抗性平板进行初步筛选，800g/mL的YPD抗性平板进行复筛。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的诱导培养是使用1%的甲醇，每24小时补加一次，共计诱导培养96小时。8.一种高表达的重组胶原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1或2所示。9.编码权利要求8所述的高表达的重组胶原蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.3或4所示。10.两个组氨酸组成的标签在促进外源蛋白表达中的应用，其特征在于，是在外源蛋白的氨基酸序列的N端添加两个组氨酸。权利要求书1。
5、/1 页2CN 117511978 A2一种提高外源蛋白表达量的方法技术领域0001本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种提高外源蛋白表达量的方法。背景技术0002外源蛋白表达面临表达量低、纯度低和功能性差等问题。在真核生物中，过表达外源蛋白可能造成内质网内聚集大量的未折叠蛋白，超越内质网的加工能力，导致蛋白容易发生错误折叠，从而限制其高水平表达。0003目前提高蛋白质表达量的宏观方法包括有改造分泌信号肽、启动子工程、提高胞内拷贝数、共表达分子伴侣等，微观方法包括有CRISPRi干扰技术等。0004在真核系统中，重组蛋白从转录到翻译的调控较为复杂，而通过优化mRNA二级结构带来翻译效率的提升是一。
6、种优化微生物表达蛋白的策略。发明内容0005目前最为有效的方法是通过翻译暂停技术达到减缓蛋白质翻译速率，从而提升表达量的方法，本发明旨在通过引入少量的碱基找到适合目的蛋白的N端的前导肽，起到与翻译暂停技术相类似的效果。0006本发明的技术原理：首先，将重组蛋白N端前多个碱基序列转换为RNA序列作为输入信号，使用Mfold软件进行RNA二级结构预测，然后在蛋白序列的N端引入不同种类及个数的的氨基酸，发明人发现引入两个组氨酸能够增强RNA二级结构稳定性，起到减缓蛋白质翻译速率的作用，从而使得肽链能够更好地折叠形成目的蛋白，后面通过SDSPAGE实验也证实了该方法能够提高外源蛋白在毕赤酵母中产量。0。
7、007本发明的第一目的在于提供一种提高外源蛋白表达量的方法，在编码外源蛋白的核苷酸序列的5 端添加编码连续两个组氨酸的核苷酸进行表达，即在外源蛋白的N端引入了两个组氨酸。0008优选地，所述的表达是在毕赤酵母中表达。0009优选地，所述的外源蛋白为胶原蛋白；更优选地，所述的外源蛋白为重组胶原蛋白。0010优选地，包括以下步骤：0011i）将目的片段通过克隆组装至载体质粒上，转化至大肠杆菌中扩增，抽提质粒；0012ii）用快切酶对质粒进行线性化，电转化至毕赤酵母，使用YPD抗性平板进行初筛和复筛；0013iii）将转化子挑取至BMGY培养基中，培养后离心弃上清；使用BMMY培养基将菌体重悬，诱导。
8、培养；培养液经分离纯化得到目的蛋白。0014更优选地，所述的载体质粒为pPICZA，所述的大肠杆菌为大肠杆菌JM109，所述的快切酶为酶SacI，所述的毕赤酵母为毕赤酵母GS115。0015更优选地，使用YPD抗性平板进行初筛和复筛是指使用100g/mL的YPD抗性平板进说明书1/4 页3CN 117511978 A3行初步筛选，800g/mL的YPD抗性平板进行复筛。0016更优选地，所述的诱导培养是使用1%的甲醇，每24小时补加一次，共计诱导培养96小时。0017本发明第二个目的是提供高表达的重组胶原蛋白，其氨基酸序列与SEQ ID No.1或2所示的氨基酸序列有90%以上同源性。0018。
9、优选地，其氨基酸序列如SEQ ID No.1或2所示。0019关于氨基酸序列同源性，一方面是基于保守氨基酸取代，这种保守性使得某氨基酸被结构相似的氨基酸取代而不会对所得变体多肽的性质产生大的影响，例如是被具有相似侧链的氨基酸残基取代。另一方面，本发明考虑到在SEQ ID No.1或SEQ ID No.2基础上增添一段或多段冗余序列，而这种改变未带来生物活性明显增加的现象，即原来的生物活性片段不会因为冗余序列的介入而更好地发挥生物功能。0020本发明提供了编码所述的高表达的重组胶原蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列与SEQ ID No.3或SEQ ID No.4的核苷酸序列有80%以上同源性；优选。
10、地，所述基因的核苷酸序列与SEQ ID No.3或SEQ ID No.4的核苷酸序列有90%以上同源性；最优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。0021关于核苷酸序列同源性，一方面是由于存在密码子的简并性，导致编码蛋白的核苷酸序列并不唯一，因此能够编码产生如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列，均在本发明的保护范围内。另一方面，如前述的氨基酸序列同源性，相应地编码与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2具有同源性90%的氨基酸序列的核苷酸序列，也落在本发明的保护范围内。0022本发明的第三个目的是提供两个。
11、组氨酸组成的标签在促进外源蛋白表达中的应用。0023与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：0024本发明通过在目的蛋白的N端引入两个组氨酸，使得蛋白的表达量得到了显著提高，实验结果显示提高了5倍以上；相比于其它技术，本发明方法操作更简便，并且维持了外源蛋白的理化性质如蛋白质的高级结构和生物活性。附图说明0025图1为填加组氨酸前，重组胶原蛋白N端二级结构的预测。0026图2为填加组氨酸后，重组胶原蛋白N端二级结构的预测。0027图3为重组胶原蛋白S9在N端添加标签前后的SDSPAGE对比图，其中泳道S91为重组胶原蛋白S9，泳道HHS91为N端添加两个组氨酸的重组胶原蛋白S9，泳道M（Mar。
12、ker）为分子量标记。0028图4为重组胶原蛋白S10在N端添加标签前后的SDSPAGE对比图，其中泳道S101和S102为重组胶原蛋白S10，泳道HHS101、HHS102为N端添加两个组氨酸的重组胶原蛋白S10，泳道M（Marker）为分子量标记。0029图5为重组胶原蛋白S9在N端添加标签后的圆二色谱（CD）图。说明书2/4 页4CN 117511978 A4具体实施方式0030在本发明中，所述基因可以通过生物技术公司合成获得。本发明对所述分离纯化的方法没有特殊限定，采用本领域常规的蛋白分离纯化方法即可。优选的技术方案参见实施例记载。0031下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的。
13、说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。0032实施例1 对目的蛋白进行N端二级结构的预测0033本实施例提供的外源蛋白为重组胶原蛋白S9，其氨基酸序列具体如下：0034GEPGPRGERGPPGPPGPPGPAGKDGRPGERGFPGMKGHRGFDGRNGEKGLPGENGAPGERGPPGPPGINGSPGGKGPRGQPGVMGFPGPKGDKGDTGPPGPQGKPGEPGPKGAPGERGAPGLRGGAGPPGPEGGKGAAGPPGPPGMPGERGDKGEPGGPGADGDKGEGGAPGLPGERGETGPPGPAGFPGAPGEGGPPGVAGPPGGSGPA。
14、GPPGPQGVKGGPGAAGFPGARGLSGERGGKGDRGENGSPGAPGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGIKGHRGFPGNPGAP。0035将重组蛋白N端前24个碱基序列转置为RNA序列作为输入信号，使用Mfold软件进行二级结构预测，以可视化形式导出（图1）。发明人在对N端序列长度和N端具体碱基序列的筛选中，发现在N端引入两个组氨酸形成HHS9进行结构预测，其RNA二级结构具有稳定性（图2），推测该密码子是适合在毕赤酵母菌株中表达的，并且在后来实验中证实了有提高外源蛋白产量的作用。0036实施例2 本发明HHS9的SDSPAGE验证实验。
15、0037本实施例使用的重组胶原蛋白HHS9，其氨基酸序列具体如下：0038HHGEPGPRGERGPPGPPGPPGPAGKDGRPGERGFPGMKGHRGFDGRNGEKGLPGENGAPGERGPPGPPGINGSPGGKGPRGQPGVMGFPGPKGDKGDTGPPGPQGKPGEPGPKGAPGERGAPGLRGGAGPPGPEGGKGAAGPPGPPGMPGERGDKGEPGGPGADGDKGEGGAPGLPGERGETGPPGPAGFPGAPGEGGPPGVAGPPGGSGPAGPPGPQGVKGGPGAAGFPGARGLSGERGGKGDRGENGSPGAPGKSGDRGES。
16、GPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGIKGHRGFPGNPGAP（SEQ ID No.1）。0039首先，由金斯瑞生物科技股份有限公司合成编码HHS9的核酸片段（SEQ ID No.3）。将目的片段通过一步克隆组装至载体质粒pPICZA上，转化至大肠杆菌JM109中，扩增，抽提质粒。0040用快切酶SacI对质粒进行线性化，电转化至GS115，使用100ug/mL的YPD抗性平板进行初步筛选，800ug/mL的YPD抗性平板进行复筛。0041将阳性转化子挑取至BMGY培养基中，30培养至OD600大于15，离心弃上清；使用BMMY培养基将菌体重悬，然后诱导培养：使用1%的甲。
17、醇，每24小时补加一次，共计诱导96小时后结束培养。0042分离纯化：0043将菌液进行12000 g离心，弃菌体，上清用0.22 m的膜进行过滤，随后使用5kDa孔径的透析袋进行透析，透析缓冲液为20mM，pH5.0的PB 缓冲液。每12h换一次透析缓冲液，共计透析36h。0044接着用层析柱HiTrap SP HP 5ml（Cytiva）进行洗脱，设置参数如下：0045样品环境：20mM PB pH5.0；说明书3/4 页5CN 117511978 A50046缓冲液A（平衡液）：20mM PB pH5.0，0047缓冲液B（洗脱液）：20mM PB pH5.0，1M NaCl；0048实。
18、验流速：4ml/min；0049梯度洗脱：直接用100%缓冲液B洗脱，收集220nm处的洗脱峰，15CV体积。0050SDSPAGE分析纯化后蛋白纯度及表达量，并以N端未添加标签的重组蛋白作为对照，结果如图3所示，可见在重组蛋白S9的N端添加两个组氨酸提高外源蛋白产量的作用，并且提高了5倍以上。将蛋白进行浓缩或冻干保存。0051实施例3 本发明HHS10的SDSPAGE验证实验0052为验证本发明方法的通用性，本实施例使用另一重组蛋白HHS10（是指S10的N端添加两个组氨酸）进行实验，其氨基酸序列具体如下：0053HHGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAG。
19、EPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRD（。
20、SEQ ID No.2）。0054合成编码HHS10的核酸片段如SEQ ID No.4所示。实验方法及过程参考实施例2。0055SDSPAGE结果如图4所示，可见在重组蛋白S10的N端添加两个组氨酸提高外源蛋白产量的作用，并且提高了5倍以上。0056实施例4 本发明HHS9的SDSPAGE验证实验0057本发明对胶原蛋白的结构表征是采用本领域常用的圆二色谱法(circular dichroism，CD)，CD是用于测定具有手性结构、能产生左右旋光差异性吸收的化合物结构，主要用于测定分子结构不对称性的光谱学方法。一般生物大分子中均含有手性的基团和结构，因而CD常用来测量和观察生物大分子的结构和构。
21、象的变化。胶原蛋白三螺旋结构的CD特征一般是在225 nm附近有一个正吸收峰，在197 nm附近有一个负吸收峰，吸收峰的位置随着氨基酸序列和长度的变化会发生偏移。0058将实施例2制备得到的重组胶原蛋白HHS9冻干粉末溶解在的PB缓冲液中进行CD检测。结果如图5所示，实施例2中制备的重组胶原蛋白HHS9在约221nm处具有最大特征正峰，小于200nm处出现负峰，根据已知的胶原蛋白三螺旋结构的圆二色谱特征，判断添加标签的重组胶原蛋白样品仍具有三螺旋结构。0059以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。说明书4/4 页6CN 117511978 A6图 1图 2说明书附图1/3 页7CN 117511978 A7图 3图 4说明书附图2/3 页8CN 117511978 A8图 5说明书附图3/3 页9CN 117511978 A9。