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1、(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202310374966.0(22)申请日 2023.04.10(83)生物保藏信息CGMCC No.26745 2023.03.06(71)申请人 扬州大学地址 225009 江苏省扬州市大学南路88号(72)发明人 周晓见毕铭靳翠丽刘青(74)专利代理机构 南京禹为知识产权代理事务所(特殊普通合伙)32272专利代理师 王晓东(51)Int.Cl.C12N 1/20(2006.01)A01K 61/59(2017.01)C12N 1/12(2006.01)C12R 1/07(2006.01)C。
2、12R 1/89(2006.01)(54)发明名称一株促进底栖附着生物群落形成与发展的活性菌株及其应用(57)摘要本发明公开了一株促进底栖附着生物群落形成与发展的活性菌株及其应用，短小芽孢杆菌(Bacilus pumilus)MSTI2023654，于2023年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26745，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，该菌株有效提高底栖硅藻的附着率，且该菌株粗提物能够诱导硅藻细胞产生含有更多多糖，尤其是酸性多糖的胞外多聚物，以此提高EPS粘性，提高底栖硅藻附着率。该菌株粗提物还可以有效诱导。
3、藤壶金星幼虫的附着与变态，对于海水养殖牡蛎、刺参等经济水产业来说具有重要意义。权利要求书1页 说明书5页 附图4页CN 116606759 A2023.08.18CN 116606759 A1.短小芽孢杆菌(Baciluspumilus)MSTI2023654，于2023年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.26745，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。2.权利要求1所述的短小芽孢杆菌(Baciluspumilus)MSTI2023654在水产养殖中促进底栖附着生物群落形成与发展的应用。3.如权利要求2所述的应用，。
4、其特征在于：所述底栖附着生物群落包括底栖硅藻和藤壶金星幼虫。4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于：包括，短小芽孢杆菌(Bacilus pumilus)MSTI2023654提高底栖硅藻的附着率并诱导硅藻细胞产生更多酸性多糖的胞外多聚物，提高EPS粘性，促进底栖生物膜的形成与发展。5.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于：包括，短小芽孢杆菌(Bacilus pumilus)MSTI2023654有效诱导藤壶金星幼虫的附着与变态，提高金星幼虫的附着率。权利要求书1/1 页2CN 116606759 A2一株促进底栖附着生物群落形成与发展的活性菌株及其应用技术领域0001本发明属于生物领域，。
5、具体涉及到一株促进底栖附着生物群落形成与发展的活性菌株及其应用。背景技术0002近年来，受环境污染、过度捕捞和全球气候变化等因素的影响，全球海洋渔业资源衰退明显。随着海洋潜在价值的日益显现，海洋资源的保护和可持续利用越来越受到各国的重视。为了缓解海洋栖息地退化并有效保护濒危物种，实现海洋资源可持续利用，渔业和海洋生态学家普遍认为，建设海洋牧场是海洋渔业可持续发展的重要出路。而建设海洋牧场，其中关键的一环则是要建设与发展海洋底栖附着生物群落，促进从初始化条件膜到微生物黏膜再到大型附着生物的群落演替。0003而在水产养殖业中，培养底栖附着生物群落也对行业效益与发展有着至关重要的影响。许多苗种生产，。
6、例如牡蛎、贻贝等幼体附着变态率低以及附着变态后稚体“滑板”死亡问题制约了此类海水养殖业的发展。而研究表明底栖硅藻不仅可以作为底栖附着生物稚体的优良饵料，还能够诱导此类幼体的附着变态。随着底栖附着生物群落的发展，海洋中的甲壳动物、软体动物、鱼类等才能生长繁殖。因此底栖硅藻的质量直接影响到苗种培育的成活率，是水产经济动物育苗成功的关键因素之一，因此培养足量的优质底栖硅藻、增强海洋生物膜的形成，是人工育苗生产中最为重要的环节。0004但由于底栖硅藻具有较强的附着特性，不像浮游微藻一样能够立体地利用水体，高效率利用营养物质，因此大规模的生产培养十分困难。0005因此，目前，本领域现阶段的水产养殖业亟需。
7、寻求扩大底栖硅藻的养殖规模，或提高底栖硅藻附着率以提高对附着生物幼体附着变态的诱导活性的方法。发明内容0006本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。0007鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。0008因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种短小芽孢杆菌(Baciluspumilus)MSTI2023654，于2023年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为。
8、CGMCCNo.26745，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。0009本发明的 再 一 个目的 是，克 服现 有技术中的 不足，提供短 小芽 孢杆 菌(Baciluspumilus)MSTI2023654在水产养殖中促进底栖附着生物群落形成与发展的应用。0010作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述底栖附着生物群落包括底栖硅说明书1/5 页3CN 116606759 A3藻和藤壶金星幼虫。0011作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：包括，短小芽孢杆菌(Bacilus pumilus)MSTI2023654提高底栖硅藻的附着率并诱导硅藻细胞产生更多酸性多。
9、糖的胞外多聚物，提高EPS粘性，促进底栖生物膜的形成与发展。0012作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：包括，短小芽孢杆菌(Bacilus pumilus)MSTI2023654有效诱导藤壶金星幼虫的附着与变态，提高金星幼虫的附着率。0013本发明有益效果：0014本发明提供一种短小芽孢杆菌(Baciluspumilus)MSTI2023654，于2023年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.26745，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，该菌株及其粗提物处理多种海洋底栖硅藻及藤壶金星幼虫，有效提高底栖硅藻的附着。
10、率并诱导硅藻细胞产生含有更多多糖，尤其是酸性多糖的胞外多聚物，以此提高EPS粘性，促进底栖生物膜的形成与发展；此外，该菌株粗提物还可以有效诱导藤壶金星幼虫的附着与变态；在水产养殖的实际应用中，提高硅藻与附着生物金星幼虫的附着率，对促进底栖附着生物群落的形成与发展有着重要意义。附图说明0015为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：0016图1为本发明实施例中活性菌株MSTI2023654的系统发。
11、育树图。0017图2为本发明实施例中活性菌株MSTI2023654对9种底栖硅藻附着率的影响图。0018图3为本发明实施例中活性菌株MSTI2023654对小新月菱形藻EPS产量的影响图。0019图4为本发明实施例中活性菌株MSTI2023654对小新月菱形藻中EPS中各组分含量的影响图。0020图5为本发明实施例中活性菌株MSTI2023654对藤壶金星幼虫时间附着情况的影响图。具体实施方式0021为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。0022在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同。
12、于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。0023其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。说明书2/5 页4CN 116606759 A40024本研究所用菌株MSTI2023654分离自连云港海域海水样品，通过16SrDNA序列分析结合形态特征将其鉴定为一种短小芽孢杆菌Baciluspumilus。0025本发明菌株MSTI2023。
13、654于2023年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命 名为短小芽孢杆菌Baciluspumilus，保藏编号为CGMCCNo.26745，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。0026实施例10027菌株MSTI2023654的鉴定：SDSCTAB法对菌株MSTI2023654的基因组DNA进行提取，交由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序分析。0028测定了菌株6SrDNA序列的有效长度为1489bp1，将序列提交BLAST，与GenBank中其它菌株的16SrDNA序列进行同源性比对，应用MEGA11.0软件，分析并构建系统进化。
14、树(见图1)，与菌株MSTI2023654进化同源性最高的为短小芽孢杆菌BaciluspumilusSB3002和短小芽孢杆菌Baciluspumilus IHBB9209，同源性大于99.99，综合菌株形态特征和基因序列分析，可将其鉴定为短小芽孢杆菌。0029实施例20030(1)样品采集：分离自连云港海域海水样品，存放于80冰箱冻存。0031菌株MSTI2023654的分离与培养：将海水样品梯度稀释后涂布接种到蛋白胨酵母膏固体培养基(即PY培养基，配方：1L盐度3的无菌人工海水中加入3g酵母浸提物、5g蛋白胨(固体培养基再加20g琼脂粉)，经121高压蒸汽灭菌20min并冷却至室温后制得)。
15、中，28培养，从第二天起每天观察菌落长出情况，挑取新长出的放线菌接种到新鲜的PY固体培养基上纯化。0032将分离到的菌分别接种到PY液体培养基中，28，120rpm振荡培养5天。0033离心去菌体，发酵液用等体积乙酸乙酯萃取2次。有机相经旋转蒸发仪浓缩，得到各菌株粗提物样品、称重，待测。0034菌株MSTI2023654的活性筛选：将待测样品(上述菌株的各菌株粗提物)均以100 g/mL的浓度分别加入到小新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)藻液中，23培养30天后观察计算小新月菱形藻的附着情况，如果小新月菱形藻附着率升高表明测试菌对底栖硅藻的附着有促进作用。初筛显示一菌株发酵液。
16、粗提物在100 g/mL时对小新月菱形藻的附着有显著地促进作用，该菌株命名为MSTI2023654。0035菌株MSTI2023654的培养与粗提物制备：1mL菌株冻存液(含甘油50(v/v)转入10mLPY培养基，在温度为28的震荡培养箱培养60h至对数增长期,然后转入800mL新鲜PY培养基，在温度28、摇床转速120rpm条件下培养84h至稳定期，收集整个培养物(含菌体)；0036将等体积的乙酸乙酯(含5(v/v)丙酮)加入细菌培养液，剧烈摇动以使代谢产物提取充分；0037静置后待有机相与水相分层后，收集有机相，转移至旋转蒸发仪在37下负压浓缩至小体积后，转至氮吹仪吹干得到粗提物。003。
17、8粗提物样品溶于二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)，配制成一定浓度测试液以备生物测试使用。0039(2)诱导底栖硅藻附着试验：说明书3/5 页5CN 116606759 A50040测试硅藻：三 角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)，纤细角毛藻(Chaetocerosgracilis)，小新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)，碎片菱形藻(Nitzschiafrustulum)，辐节藻(Stauroneissp.)，双眉藻(Amphorasp.M3)，异菱藻(Staurophorasp.WH6)，双眉藻(Amphorasp.WH8)。
18、和双眉藻(Amphorasp.Amp)。0041硅藻藻液用血球计数板计数，并用人工海水调整密度为36105cells/mL；0042在24孔板中，加入2mL受试藻液，加入2 L含待测粗提物的DMSO溶液，使粗提物测试浓度为100 g/mL，对照分别加同体积的空白海水和不含粗提物的DMSO；0043同时，取能够生产100 g/mL浓度粗提物的菌液，4500rpm冷冻离心5min，去上层清液，用同体积人工海水清洗2次，用移液枪吹吸均匀，待用。0044在2mL受试藻液中分别加入清洗过的菌体和原始菌液(测试前涂板确定菌体仍有活性)。温度23，光强100 molphotonsm2s1，光暗比12h:12。
19、h，培养3d。0045将24孔板置于摇床，70rpm，振荡10min，用移液枪将上层未附着的藻液吸出，用人工海水润洗测试孔3次以吸取未附着的硅藻，每孔中仍附着在底部的藻细胞，用血球计数板分别观察计数，计算硅藻附着率。每个测试至少重复四次。0046结果用硅藻附着率表示：00470048分离得到的活性菌株能够有效促进不同底栖硅藻附着，见图2，其中，图ai分别为三角褐指藻、纤细角毛藻、小新月菱形藻、碎片菱形藻、辐节藻、双眉藻M3、异菱藻WH6、双眉藻WH8、双眉藻Amp。0049可以看出，三角褐指藻、纤细角毛藻、小新月菱形藻和双眉藻M3在MSTI2023654菌液及其粗提物处理下，其附着率有着显著提。
20、升。碎片菱形藻和双眉藻Amp在活性菌液处理下附着率也有显著提升，而在粗提物处理下作用效果稍逊色，但比之对照仍有显著提升。0050辐节藻、异菱藻WH6与双眉藻WH8原本其附着率高至8090左右，因此该菌株对其附着并未有明显影响。而从其余几种硅藻实验结果来看，该菌株粗提物对提高硅藻附着率有着显著作用，而该菌株洗去胞外物质后，其细胞本身对硅藻的附着也有一定促进作用。0051实施例30052粗提物对硅藻不同EPS组分的影响试验：0053实验用含Na2SiO3的f/2培养基(成分为：1L盐度3人工无菌海水中加入75mg NaNO3,5mg NaH2PO4H2O,30mg Na2SiO39H2O,1.3m。
21、g FeCl36H2O,8.7mg Na2EDTA2H2O,9.8 gCuSO45H2O,6.3 g Na2MoO4H2O,22 g ZnSO47H2O,10 gCoCl26H2O,0.18mg MnCl24H2O,1 g VitaminB12,1 g Biotin,2mg Thiamine HCL)，经121高压蒸汽灭菌20min并冷却至室温后使用；0054按8的比例(v/v)接种，加入含待测粗提物的DMSO溶液，使粗提物测试浓度为100 g/mL，对照加同体积不含粗提物的DMSO，每个处理设置至少三组平行；0055温度23，光强100 molphotonsm2s1，光暗比12h:12h，培。
22、养30d。0056将锥形瓶置于摇床，70rpm振荡10min，倒出上层浮游藻细胞(上)，加入同等体积人工海水，用毛笔将锥形瓶底部附着的藻细胞(下)全部刷下。以4000rpm分别离心10min后收集各自的上清液，即分别为浮游藻细胞(上)和附着藻细胞(下)的SLEPS溶液。说明书4/5 页6CN 116606759 A60057向离心后的藻细胞沉淀中加入等体积的磷酸盐缓冲溶液(10mL，0.1mmol/mL，pH7.5)，充分混匀并至于室温下静置20min。005870条件下水浴1h。待体系冷却至室温后，以4000rpm离心10min，收集上清液，即可得到浮游藻细胞(下)和附着藻细胞(下)的BEP。
23、S溶液。0059采用苯酚硫酸法测定EPS中多糖含量，用考马斯亮蓝染色法对EPS溶液所含蛋白质进行定量分析，用ElsonMorgan反应测定EPS中糖胺含量，用硫酸咔唑法测量EPS中糖醛酸含量，采用硫酸钡比浊法测量EPS中硫酸基含量。0060在菌株MSTI2023654粗提物处理下，附着的硅藻细胞(下)的BEPS产量显著提高(图3)，小新月菱形藻在菌株MSTI2023654粗提物处理下，其不同EPS的组分含量均有变化(图4)。在浮游藻细胞(上)的SLEPS中，多糖与蛋白质含量有极显著提升，其他组分未有明显变化；浮游藻细胞(上)的BEPS与底栖藻细胞的SLEPS中，蛋白质含量有着显著提升；在对底栖。
24、硅藻附着并形成生物膜过程起至关重要作用的底栖藻细胞(下)BEPS中，多糖含量显著增加，糖醛酸含量有所提升，而蛋白质含量、糖胺含量与硫酸基含量降低。0061实施例40062对藤壶幼虫附着活性的测试试验：本研究所用藤壶为纹藤壶(Amphibalanus amphitrite)，藤壶成体采自连云港潮间带(北纬34 88，东经119 19)，经人工刺激获得无节幼虫后，在扬州大学海洋科学与技术研究所实验室用新鲜人工海水饲养无节幼体，喂饲纤细角毛藻，在室温下培养一周左右，得到金星幼虫。0063本实验所用金星幼虫在4冰箱存放48h后，再用于生物测试。0064测试时，在24孔板中每孔分别加入1mL人工海水，再。
25、向每孔中加入1520只金星幼虫。以加入同体积空白DMSO为对照，加入含待测粗提物的DMSO溶液，使粗提物测试浓度为100 g/mL，每组做六个平行。0065将测试用的24孔板用锡箔纸改好，置于避光、室温条件下。每12h计数金星幼虫附着情况，最后计算幼虫附着率。附着率计算公式如下：00660067在菌株MSTI2023654粗提物的处理下，由12h至96h，处理过的藤壶金星幼虫附着率均高于空白对照组(图5)。观察48h附着状态时，菌株粗提物诱导的金星幼虫的附着速率明显提升，与对照组存在显著性差异(p0.01)。0068应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的范围当中。说明书5/5 页7CN 116606759 A7图1图2说明书附图1/4 页8CN 116606759 A8图3说明书附图2/4 页9CN 116606759 A9图4说明书附图3/4 页10CN 116606759 A10图5说明书附图4/4 页11CN 116606759 A11。