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1、(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202310704734.7(22)申请日 2023.06.14(71)申请人 沈阳农业大学地址 110000 辽宁省沈阳市大东区东陵路120号133栋1-3-2(72)发明人 桑晓宇杨娜李响陈冉冯颖何婷郭瑞莹李林(74)专利代理机构 北京华清迪源知识产权代理有限公司 11577专利代理师 朱芳(51)Int.Cl.A61K 39/002(2006.01)A61P 33/02(2006.01)C12N 15/30(2006.01)C07K 14/45(2006.01)(54)发明名称一种用于预防弓。
2、形虫急性感染的DNA疫苗(57)摘要本发明实施例公开了一种用于预防弓形虫急性感染的DNA疫苗，其含有如下核苷酸序列：1)用于编码SAG1的如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；和/或，2)用于编码SABP1的如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本发明构建的DNA疫苗均可不同程度保护小鼠抵抗弓形虫RH株的感染，并且DNA疫苗联合免疫具有最好的保护效果，有效地提升单基因疫苗的免疫效果，刺激小鼠产生细胞免疫应答，显著增强小鼠抵抗弓形虫急性感染能力。本发明为开发弓形虫新药和疫苗奠定了新的实验基础。权利要求书1页 说明书5页序列表（电子公布）附图7页CN 116603057 A2023.08.。
3、18CN 116603057 A1.一种用于预防弓形虫急性感染的DNA疫苗，其特征在于，其含有如下核苷酸序列：1)用于编码SAG1的如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；和/或，2)用于编码SABP1的如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于，以pVAX1为骨架载体。3.权利要求1所述的用于预防弓形虫急性感染的DNA疫苗的制备方法，其特征在于，包括：构建重组质粒pVAX1SAG1和pVAX1SABP1；所述重组质粒pVAX1SAG1和pVAX1SABP1单独构成DNA疫苗；或者，将所述重组质粒pVAX1SAG1和pVAX1SABP1混合后构成。
4、DNA疫苗。4.根据权利要求3所述的用于预防弓形虫急性感染的DNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述混合构成DNA疫苗中，重组质粒pVAX1SAG1和pVAX1SABP的质量比为1:1。5.根据权利要求3所述的用于预防弓形虫急性感染的DNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述DNA疫苗还包括药学上可接受的载体。权利要求书1/1 页2CN 116603057 A2一种用于预防弓形虫急性感染的DNA疫苗技术领域0001本发明实施例涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于预防弓形虫急性感染的DNA疫苗。背景技术0002弓形虫(Toxoplasmagondii)是重要的人畜共患寄生原虫，中间宿主广泛、人可以通。
5、过摄入污染卵囊的食物、水源或者含未煮熟的含有包囊的肉类食品而感染。磺胺类药物对弓形虫急性感染有一定的效果，但是对弓形虫慢性感染几乎没有效果，同时磺胺类药物对人身体的副作用较大。因此，研究新的、安全有效的弓形虫疫苗对预防预防和控制弓形虫病具有重要的兽医公共卫生意义。0003与传统疫苗相比，DNA疫苗的最大优势在于其没有类似活疫苗的风险，易诱导产生CD8+杀伤性T细胞(CTL)反应，引发针对感染细胞的免疫应答反应；其抗原合成和呈递方式更类似于自然病原体感染，使得DNA疫苗可能更有效的对抗弓形虫感染。单价疫苗具有一定的免疫效果，然而，由于弓形虫复杂的生活史和免疫逃避机制，且不同抗原在体内诱导的免疫效。
6、果不同，仅用单一抗原制备的DNA疫苗难以刺激宿主的完整的免疫应答，很难达到理想的免疫效果，多基因DNA疫苗可能比单基因DNA疫苗具有更好的保护效果，因此弓形虫DNA多基因疫苗的制备已成为研究热点。发明内容0004弓形虫速殖子入侵宿主细胞机制复杂，有多种虫体蛋白质参与虫体的入侵过程。其中，SAG1作为弓形虫速殖子时期重要的表面蛋白，参与虫体的吸附和侵入，具有很高的免疫原性，可刺激机体产生强烈的体液与细胞免疫反应，被认为是最有潜力的弓形虫疫苗抗原。本实验室前期研究发现，弓形虫另一个膜表面蛋白质SABP1，能够结合宿主细胞表面的唾液酸分子，进而介导弓形虫对宿主细胞的黏附和侵袭，在弓形虫入侵宿主细胞的。
7、过程中发挥重要作用。同时，SABP1蛋白质C端具有免疫作图蛋白(Immune mappedprotein，IMP)结构域，该结构域在顶复门原虫家族中十分保守且具有具有良好的免疫原性。当前尚未有关于SAG1和SABP1蛋白质的DNA疫苗联合免疫的效果研究。0005为此，本发明实施例提供一种用于预防弓形虫急性感染的DNA疫苗。0006为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：0007根据本发明实施例的第一方面，本发明提供一种用于弓形虫感染预防的DNA疫苗，其含有如下核苷酸序列：00081)用于编码SAG1的如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；和/或，00092)用于编码SABP1的如S。
8、EQ ID NO.2所示的核苷酸序列。0010进一步地，以pVAX1为骨架载体。0011根据本发明实施例的第二方面，本发明提供如上所述的用于预防弓形虫急性感染的DNA疫苗的制备方法，包括：说明书1/5 页3CN 116603057 A30012构建重组质粒pVAX1SAG1和pVAX1SABP1；0013所述重组质粒pVAX1SAG1和pVAX1SABP1单独构成DNA疫苗；或者，将所述重组质粒pVAX1SAG1和pVAX1SABP1混合后构成DNA疫苗。0014进一步地，所述混合构成DNA疫苗中，重组质粒pVAX1SAG1和pVAX1SABP的质量比为1:1。0015进一步地，所述DNA疫苗。
9、还包括药学上可接受的载体。0016本发明实施例具有如下优点：0017本发明构建表达弓形虫质膜蛋白质SAG1和SABP1的真核表达质粒pVAX1SAG1和pVAX1SABP1，以间接免疫荧光技术验证其在293T细胞中的高效表达，随后大量制备DNA疫苗，分别单一或联合免疫Balb/c小鼠，四免后测定小鼠的体液免疫和细胞免疫指标、脾淋巴细胞增殖能、细胞因子力及其对感染弓形虫RH株的免疫保护作用。本发明构建的DNA疫苗均可不同程度保护小鼠抵抗弓形虫RH株的感染，并且DNA疫苗联合免疫具有最好的保护效果，有效地提升单基因疫苗的免疫效果，刺激小鼠产生细胞免疫应答，显著增强小鼠抵抗弓形虫急性感染能力。本发明。
10、为开发弓形虫新药和疫苗奠定了新的实验基础。附图说明0018为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。0019图1为本发明实施例提供的重组质粒pVAX1SABP1核酸电泳鉴定，其中1为pVAX1SABP1。0020图2为本发明实施例提供的重组质粒pVAX1SAG1核酸电泳鉴定，其中1为pVAX1SAG1。0021图3为本发明实施例提供的重组质粒pVAX1SAG1和pVAX1SAB。
11、P1的体外表达Westernblot验证，其中1为pVAX1SAG1；2为pVAX1SABP1；3为pVAX1；4为正常细胞。0022图4为本发明实施例提供的重组质粒pVAX1SAG1的体外表达IFA验证(10倍目镜20倍物镜)。0023图5为本发明实施例提供的重组质粒pVAX1SABP1的体外表达IFA验证(10倍目镜20倍物镜)。0024图6为本发明实施例提供的pVAX1空载体的体外表达IFA验证(10倍目镜20倍物镜)。0025图7为本发明实施例提供的免疫小鼠血清内总IgG抗体效价检测(*P0.01、*P0.001和*P0.0001)。0026图8为本发明实施例提供的免疫小鼠血清内IgG。
12、1和IgG2a亚类检测(*P0.05、*P0.01、*P0.001和*P0.0001)。0027图9为本发明实施例提供的免疫小鼠脾淋巴细胞48h增殖情况检测(*P0.05、*P0.01、*P0.001和*P0.0001)。0028图10为本发明实施例提供的免疫小鼠脾淋巴细胞72h增殖情况检测(*P0.05、*P说明书2/5 页4CN 116603057 A40.01、*P0.001和*P0.0001)。0029图11为本发明实施例提供的免疫小鼠IFN水平检测(*P0.0001)。0030图12为本发明实施例提供的免疫小鼠IL2水平检测(*P0.0001)。0031图13为本发明实施例提供的免疫。
13、小鼠IL4水平检测(*P0.01和*P0.0001)。0032图14为本发明实施例提供的免疫小鼠IL12(p70)水平检测(*P0.0001)。0033图15为本发明实施例提供的免疫小鼠攻虫保护监测。具体实施方式0034以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。0035实施例1pVAX1SABP1重组质粒的构建0036以本实验室前期构建的pDES。
14、T17SABP1质粒为模板设计SABP1基因特异性引物(DOI:10.1093/infdis/jiaa072)，引物序列如下：pVAX1SABP15:5AACTTAAGCTTGCCACCATGGGATCTGGCAACAAC 3(SEQ ID NO.3)，pVAX1SABP13:5TCCGTCTAGATCAATGGTGATGGTGATGATGCTTC 3(SEQ ID NO.4)。将合成好的引物稀释至10 M工作浓度，通过PCR扩增获得SABP1基因的编码序列(SEQ ID NO.1)，通过酶切、连接插入到载体pVAX1的Hind和Xba 酶切位点中间，得到pVAX1SABP1重组质粒。将构建好。
15、的重组质粒pVAX1SABP1进行核酸电泳鉴定，结果如图1所示。0037实施例2pVAX1SAG1重组质粒的构建0038登录ToxoDB网站首页，输入“TGGT1_233460”，复制SAG1基因的全长CDS序列后粘贴至Primer 5.0软件中，设计SAG1基因特异性引物。设计引物序列如下：pVAX1SAG15:5CTAGTCTAGATCAGTGGTGGTGGTGGTGGT3(SEQ ID NO.5)，pVAX1SAG13:5 ACCCAAGCTTATGGGCAGCAGCCAT3(SEQ ID NO.6)。将合成好的引物稀释至10 M工作浓度。以弓形虫RH株cDNA为模板，通过PCR扩增获得。
16、SAG1基因的编码序列(SEQ ID NO.2)，通过酶切、连接插入到载体pVAX1的Hind和Xba 酶切位点中间，得到pVAX1SAG1重组质粒。将构建好的重组质粒pVAX1SAG1进行核酸电泳鉴定，结果如图2所示。0039实施例3重组质粒的体外表达验证0040(1)Western blot验证0041将pVAX1SAG1和pVAX1SABP1重组质粒分别通过Lipo6000TM脂质体转染引入293T细胞中，pVAX1空载体为阴性对照。培养24h后弃去上层培养液用PBS洗三次，加入5SDS上样缓冲液，沸水煮10min制样，待样品冷却到室温后进行SDSPAGE和Western blot分析。。
17、用含1BSA的PBST溶液作为封闭液，分别用SAG1和SABP1小鼠源多克隆抗体为一抗，HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)为二抗对目的蛋白进行鉴定。结果显示在目的大小位置均有正确条带，说明pVAX1SAG1和pVAX1SABP1在293T细胞内成功表达。结果如图3所示。0042(2)IFA验证0043将重组质粒pVAX1SAG1和pVAX1SABP1通过Lipo6000TM脂质体转染引入293T细胞中，pVAX1空载体为阴性对照。培养24h后用PBS洗1次，用4多聚甲醛室温固定15min，再用说明书3/5 页5CN 116603057 A5PBS洗三次，然后用封闭液(含1BSA和22.52。
18、mg/ml甘氨酸的PBST)37封闭1h，分别用SAG1和SABP1小鼠源多克隆抗体为一抗，37孵育1h后，PBST洗三次，用Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(H+L)作为二抗(稀释液为1BSA的PBST)，37孵育1h，PBS洗三次后，滴加含有DAPI和抗荧光淬灭剂的ProLongTMGold Antifade Mountant with DAPI，用指甲油封片后，在正置荧光显微镜下观察。结果显示，重组质粒转染组能够检测到明显的绿色荧光如图4、图5所示，而阴性对照组则无荧光现象如图6所示，说明pVAX1SAG1和pVAX1SABP1在293T细胞内成功表达。0044实施例4DN。
19、A疫苗的制备0045将验证表达的重组质粒pVAX1SAG1和pVAX1SABP1进行无内毒素质粒大提，以获得DNA疫苗，这两种重组质粒单独构成DNA疫苗或将两种重组质粒以质量比1:1混合后获得联合DNA疫苗。免疫共分成6组，第一组空白小鼠，不进行免疫；第二组为阴性组注射无菌PBS缓冲液；第三组为pVAX1空载体组；第四组为pVAX1SABP1重组质粒免疫组；第五组为pVAX1SAG1重组质粒免疫组；第六组为pVAX1SABP1+pVAX1SAG1联合免疫组。将制备的DNA疫苗以肌肉注射的方式对小鼠进行免疫，将质粒浓度稀释至1 g/L，第三组每只小鼠注射100 g pVAX1质粒，第四组每只小鼠。
20、注射100 g pVAX1SAG1质粒，第五组每只小鼠注射100 g pVAX1SABP1质粒，第六组每只小鼠分别注射50 g pVAX1SAG1和50 g pVAX1SABP1。0046实施例5DNA疫苗免疫原性评估0047(1)免疫小鼠血清IgG抗体效价及IgG1、IgG2a亚类的检测0048于每次免疫后10天采集小鼠尾尖血，使用弓形虫裂解抗原(Toxplasma Lysed Angtigen,TLA)包被酶标板；使用HRP山羊抗小鼠(H+L)进行总抗体效价的检测；于末次免疫后10天采集小鼠尾尖血，使用TLA进行包被，使用HRPPolyclonal Goat Anti Mouse IgG1。
21、和HRPPolyclonal Goat Anti Mouse IgG2a进行抗体亚型的检测，结果显示，随着免疫次数的增加，单一DNA疫苗和联合DNA疫苗免疫组小鼠的抗体效价随之升高，与空白对照、阴性组和空载体组相比均差异显著(P0.0001)；经IgG亚型分析，单一DNA疫苗和联合DNA疫苗免疫组小鼠的IgG1与IgG2a抗体亚类滴度与空白对照、阴性组和空载体组相比均显著增高，且IgG2a的OD450nm值高于IgG1(P0.0001)，表明该DNA疫苗对BALB/c小鼠免疫后，主要引起了Th1型免疫反应，诱导小鼠机体产生细胞免疫应答。总抗体效价结果如图7所示；抗体亚型检测结果如图8所示。00。
22、49(2)脾淋巴细胞增殖实验0050末次免疫10天后，每组随机选取3只BALB/c小鼠进行眼球采血，处死后置于70酒精内浸泡10min，无菌取小鼠脾脏，使用200目细胞筛网研磨脾脏，加入10mL含12胎牛血清的培养液冲洗细胞筛网；2000rpm室温离心10min，弃掉细胞培养液，加入PBS缓冲液洗细胞一次，再加入5mL裂红液以裂解脾细胞，补液至15mL后混匀并室温静置5min。室温离心10min，弃掉裂红液，再重复裂解细胞一次；弃掉裂红液，加入PBS缓冲液重悬脾细胞，重复清洗脾细胞2次；加入台盼蓝观察细胞状态；计数后，将脾淋巴细胞铺入96孔细胞培养板(5105/孔)中，加入TLA(20 g/m。
23、L)、ConA(5 g/mL)或GST(20 g/mL)以刺激淋巴细胞，于培养箱内培养48h、72h；每孔加入20 L CCK8试剂孵育4h；结果显示各组小鼠的脾淋巴细胞在Con A的刺激下均有增殖，对照组小鼠的脾淋巴细胞在TLA的刺激下未见增殖；与使用1640培养液刺激相比，免疫组小鼠的脾淋巴细胞在TLA的刺激下均显著增加，表明免疫小鼠经特异性说明书4/5 页6CN 116603057 A6抗原刺激后，能够有效的激活T、B淋巴细胞以抵抗弓形虫的入侵。结果如图9、图10所示。0051(3)细胞因子水平检测0052在做脾淋巴细胞增殖实验的同时，收集脾淋巴细胞刺激24h后上清样品进行IL2和IL4。
24、的测定；收集脾淋巴细胞刺激96h后上清样品进行IL12p70和IFN的测定。结果显示，与对照组相比，免疫组小鼠的IL2、IL4、IL12p70及IFN水平均有显著增高，联合免疫组各细胞因子水平增加最显著(P0.0001)。结果如图1114所示。0053实施例6DNA疫苗免疫保护性评估0054第四次免疫后10天，各实验组小鼠通过腹腔注射50个弓形虫RH株虫体，与其它试验组相比，联合DNA疫苗能够有效延长攻虫小鼠存活时间，与空白组、阴性组和空载组相比，小鼠的平均存活时间延长4.33d(P0.0001)，说明联合DNA疫苗增强了小鼠对弓形虫急性感染的抵抗力。结果如图15所示。0055虽然，上文中已经。
25、用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。说明书5/5 页7CN 116603057 A7图1图2说明书附图1/7 页8CN 116603057 A8图3图4图5说明书附图2/7 页9CN 116603057 A9图6图7说明书附图3/7 页10CN 116603057 A10图8图9说明书附图4/7 页11CN 116603057 A11图10图11说明书附图5/7 页12CN 116603057 A12图12图13说明书附图6/7 页13CN 116603057 A13图14图15说明书附图7/7 页14CN 116603057 A14。