硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法及其应用.pdf

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1、(19)国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210939373.X (22)申请日 2022.08.05 (71)申请人 怡道生物科技(苏州)有限公司 地址 215000 江苏省苏州市高新区长亭路8 号大新科技园1幢2层 (72)发明人 商元宵薛韦良李志浩史力 (74)专利代理机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通合伙) 11463 专利代理师 刘桐亚 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/54(2006.01) G01N 30/74(2006.01) C07H 21/02(2006。

2、.01) C07H 1/06(2006.01) B01D 15/42(2006.01) B01D 15/36(2006.01) (54)发明名称 硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法及其 应用 (57)摘要 本发明涉及硫代寡聚核苷酸纯化技术领域， 尤其是涉及硫代寡聚核苷酸聚合物的液相色谱 分离方法及其应用。 本发明提供的硫代寡聚核苷 酸的液相色谱分离方法操作简便且成本低廉， 经 过验证， 其检测结果中目标峰保留时间误差 1min， 峰面积RE10， 纯度RE3满足硫代寡 聚核苷酸纯化需求， 且稳定性好， 重复性高， 适宜 实际生产推广应用。 权利要求书2页 说明书13页 序列表（电子公布） 附图4。

3、页 CN 115728406 A 2023.03.03 CN 115728406 A 1.硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法， 其特征在于， 所述液相色谱为阴离子交换高 效液相色谱， 包括以下色谱条件： 以Tris溶液为流动相A， 以含NaCl的Tris溶液为流动相B， 流动相A和流动相B的流速为 0.81.2ml/min， 色谱柱温度： 4852， 检测波长： 260nm； 流动相梯度设置包括以下(a)(c)中任一种： (a)流动相B初始比例为0， 且流动相B比例由0升至100的洗脱阶段至少为两个； (b)流动相B初始比例为20， 流动相B比例由20升至100的洗脱阶段至少为一个， 且流动相B。

4、比例由20升至100的时间为2030min； (c)流动相B初始比例为50， 流动相B比例由50升至100的洗脱阶段至少为一个， 且流动相B比例由50升至100的时间为2931min。 2.根据权利要求1所述的液相色谱分离方法， 其特征在于， 所述流动相A和流动相B中 Tris溶液的浓度为1921mM， 所述流动相B中NaCl的浓度为3.94.1M。 3.根据权利要求2所述的液相色谱分离方法， 其特征在于， 所述流动相A和流动相B中 Tris溶液的浓度为20mM， 所述流动相B中NaCl的浓度为4M。 4.根据权利要求2所述的液相色谱分离方法， 其特征在于， 流动相A和流动相B的流速为 1ml。

5、/min， 色谱柱温度： 50。 5.根据权利要求1所述的液相色谱分离方法， 其特征在于， 所述色谱条件为： 以Tris溶液为流动相A， 以含NaCl的Tris溶液为流动相B， 所述Tris溶液浓度为20mM， 所 述流动相B中NaCl的浓度为4M， 所述流动相A和流动相B的流速为1ml/min， 色谱柱温度50， 检测波长： 260nm； 所述流动相B初始比例为0， 流动相B比例由0升至100的洗脱阶段为两个， 且其中 至少一次流动相B的比例升至100后， 保持稳定的100比例1012min， 优选为10min。 6.根据权利要求1所述的液相色谱分离方法， 其特征在于， 所述色谱条件为： 以。

6、Tris溶液为流动相A， 以含NaCl的Tris溶液为流动相B， 所述Tris溶液浓度为20mM， 所 述流动相B中NaCl的浓度为4M， 所述流动相A和流动相B的流速为1ml/min， 色谱柱温度50， 检测波长： 260nm； 所述流动相B初始比例为20， 流动相B比例由20升至100的洗脱阶段为一个， 且流 动相B比例由20升至100的时间为2526min， 优选为26min。 7.根据权利要求1所述的液相色谱分离方法， 其特征在于， 所述色谱条件为： 以Tris溶液为流动相A， 以含NaCl的Tris溶液为流动相B， 所述Tris溶液浓度为20mM， 所 述流动相B中NaCl的浓度为4。

7、M， 所述流动相A和流动相B的流速为1ml/min， 色谱柱温度50， 检测波长： 260nm； 所述流动相B初始比例为50， 流动相B比例由50升至100的洗脱阶段为一个， 且流 动相B比例由50升至100的时间为2526min， 优选为25.8min。 8.硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法， 其特征在于， 所述液相色谱为阴离子交换高 效液相色谱， 包括以下色谱条件： 以含乙腈的Tris溶液为流动相A， 以含NaCl的Tris溶液为流动相B， 流动相A和流动相B 的流速为0.81.2ml/min， 色谱柱温度： 4852， 检测波长： 260nm； 所述Tris溶液的浓度为20mM， 所述流。

8、动相A中乙腈的体积分数为46， 优选为5， 权利要求书 1/2 页 2 CN 115728406 A 2 所述流动相B中NaCl的浓度为4M， 所述流动相B初始比例为25， 流动相B比例由25升至 100的洗脱阶段至少为一个， 且流动相B比例由25升至100的时间为2526min， 优选 为25.8min。 9.权利要求18任一项所述的硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法在硫代寡聚核苷 酸纯化中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述硫代寡聚核苷酸包括含有2224个 核苷酸的硫代寡聚核苷酸。 权利要求书 2/2 页 3 CN 115728406 A 3 硫代寡聚核苷酸的液相色。

9、谱分离方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及硫代寡聚核苷酸聚合物纯化技术领域， 尤其是涉及硫代寡聚核苷酸聚 合物的液相色谱分离方法及其应用。 背景技术 0002 寡聚核苷酸片段样品(如CPGODN)是含有非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸 (CpG)的寡脱氧核苷酸(ODN)。 采用化学合成方法获得的CPGODN是经硫代修饰的单链脱氧 寡核苷酸高分子聚合物， 该聚合物随产物本身链长的增加， 疏水性差异会逐渐减小， 这使得 采用常规的高效液相色谱对其进行分离分析变得极为困难， 在现有技术中， 已见报道的 CPGODN的纯度的检测方法包括， (1)采用比色法检测CPGODN的纯度， 如王学菊， 刘。

10、璟等提 出的 “MTT比色法建立B型CPGODN活性检测标准，细胞与分子免疫学杂质 2008年01期， 69 71页” 。 (2)采用ELISA法检测CPGODN的纯度， 如专利CN100526876C提供了一种检测人未 甲基化寡聚脱氧核苷酸ELISA检测试剂盒， 对CPGODN进行修饰和水解， 而后结合反相高效 液相色谱对水解样品进行检测， 从而确定CPGODN纯度。 (3)毛细管电泳法检测CPGODN的纯 度。 0003 上述方法均存在稳定性差和重复性低的缺点， 同时毛细管电泳法使用的主要检测 设备之一毛细管电泳仪价格昂贵， 普及率低， 难以推广应用到实际生产中。 0004 鉴于此， 特提。

11、出本发明。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法并将该方法应 用于硫代寡聚核苷酸的纯化中， 以缓解了现有技术中存在的稳定性差和重复度低的技术问 题， 适宜推广应用。 0006 为了解决上述技术问题， 实现上述目的， 本发明提供了以下技术方案： 0007 第一方面， 本发明提供硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法， 所述液相色谱为阴 离子交换高效液相色谱， 包括以下色谱条件： 0008 以Tris溶液为流动相A， 以含NaCl的Tris溶液为流动相B， 流动相A和流动相B的流 速为0.81.2ml/min， 色谱柱温度： 4852， 检测波长： 260nm； 。

12、0009 流动相梯度设置包括以下(a)(c)中任一种： 0010 (a)流动相B初始比例为0， 且流动相B比例由0升至100的洗脱阶段至少为两 个； 0011 (b)流动相B初始比例为20， 流动相B比例由20升至100的洗脱阶段至少为一 个， 且流动相B比例由20升至100的时间为2030min； 0012 (c)流动相B初始比例为50， 流动相B比例由50升至100的洗脱阶段至少为一 个， 且流动相B比例由50升至100的时间为2931min。 0013 在可选的实施方式中， 所述流动相A和流动相B中Tris溶液的浓度为1921mM， 所 说明书 1/13 页 4 CN 115728406。

13、 A 4 述流动相B中NaCl的浓度为3.94.1M。 0014 在可选的实施方式中， 所述流动相A和流动相B中Tris溶液的浓度为20mM， 所述流 动相B中NaCl的浓度为4M。 0015 在可选的实施方式中， 流动相A和流动相B的流速为1ml/min， 色谱柱温度： 50。 0016 在可选的实施方式中， 所述色谱条件为： 0017 以Tris溶液为流动相A， 以含NaCl的Tris溶液为流动相B， 所述Tris溶液浓度为 20mM， 所述流动相B中NaCl的浓度为4M， 所述流动相A和流动相B的流速为1ml/min， 色谱柱温 度50， 检测波长： 260nm； 0018 所述流动相B。

14、初始比例为0， 流动相B比例由0升至100的洗脱阶段为两个， 且 其中至少一次流动相B的比例升至100后， 保持稳定的100比例1012min， 优选为 10min。 0019 在可选的实施方式中， 所述色谱条件为： 0020 以Tris溶液为流动相A， 以含NaCl的Tris溶液为流动相B， 所述Tris溶液浓度为 20mM， 所述流动相B中NaCl的浓度为4M， 所述流动相A和流动相B的流速为1ml/min， 色谱柱温 度50， 检测波长： 260nm； 0021 所述流动相B初始比例为20， 流动相B比例由20升至100的洗脱阶段为一个， 且流动相B比例由20升至100的时间为2526m。

15、in， 优选为26min。 0022 在可选的实施方式中， 所述色谱条件为： 0023 以Tris溶液为流动相A， 以含NaCl的Tris溶液为流动相B， 所述Tris溶液浓度为 20mM， 所述流动相B中NaCl的浓度为4M， 所述流动相A和流动相B的流速为1ml/min， 色谱柱温 度50， 检测波长： 260nm； 0024 所述流动相B初始比例为50， 流动相B比例由50升至100的洗脱阶段为一个， 且流动相B比例由50升至100的时间为2526min， 优选为25.8min。 0025 第二方面， 本发明提供硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法， 所述液相色谱为阴 离子交换高效液相色谱，。

16、 包括以下色谱条件： 0026 以含乙腈的Tris溶液为流动相A， 以含NaCl的Tris溶液为流动相B， 流动相A和流动 相B的流速为0.81.2/min， 色谱柱温度： 4852， 检测波长： 260nm； 0027 所述Tris溶液的浓度为20mM， 所述流动相A中乙腈的体积分数为46， 优选为 5， 所述流动相B中NaCl的浓度为4M， 所述流动相B初始比例为25， 流动相B比例由25升 至100的洗脱阶段至少为一个， 且流动相B比例由25升至100的时间为2526min， 优 选为25.8min。 0028 第三方面， 本发明提供前述实施方式任一项所述的硫代寡聚核苷酸的液相色谱分 离。

17、方法在硫代寡聚核苷酸纯化中的应用。 0029 在可选的实施方式中， 所述硫代寡聚核苷酸包括含有2224个核苷酸的硫代寡聚 核苷酸， 例如22、 23或24个核苷酸。 0030 本发明提供的硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法操作简便且成本低廉， 经过验 证， 其检测结果中目标峰保留时间误差1min， 峰面积RE10， 纯度RE3满足寡聚核 苷酸纯化需求， 且稳定性好， 重复性高， 适宜实际生产推广应用。 说明书 2/13 页 5 CN 115728406 A 5 附图说明 0031 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案， 下面将对具体 实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作。

18、简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的 附图是本发明的一些实施方式， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前 提下， 还可以根据这些附图获得其他的附图。 0032 图1为本发明实施例1色谱检测结果； 0033 图2为本发明实施例2色谱检测结果； 0034 图3为本发明实施例3色谱检测结果； 0035 图4为本发明实施例4色谱检测结果； 0036 图5为本发明实施例5色谱检测结果； 0037 图6为本发明实施例5连续进样6针色谱检测结果； 0038 图7为本发明效果例线性评价中得到的标准曲线。 具体实施方式 0039 为使本发明实施例的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将结合。

19、本发明实施例 中的附图， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的实施例是 本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 通常在此处附图中描述和示出的本发明实施 例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。 0040 因此， 以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护 的本发明的范围， 而是仅仅表示本发明的选定实施例。 基于本发明中的实施例， 本领域普通 技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范 围。 0041 应注意到： 相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项， 因此， 一旦某一项在一 个附图中被定义， 。

20、则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。 0042 第一方面， 本发明提供硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法， 所述液相色谱为阴 离子交换高效液相色谱， 包括以下色谱条件： 0043 以Tris溶液为流动相A， 以含NaCl的Tris溶液为流动相B， 流动相A和流动相B的流 速为0.81.2ml/min， 色谱柱温度： 4852， 检测波长： 260nm； 0044 流动相梯度设置包括以下(a)(c)中任一种： 0045 (a)流动相B初始比例为0， 且流动相B比例由0升至100的洗脱阶段至少为两 个； 0046 (b)流动相B初始比例为20， 流动相B比例由20升至100的洗脱阶段至少。

21、为一 个， 且流动相B比例由20升至100的时间为2030min； 0047 (c)流动相B初始比例为50， 流动相B比例由50升至100的洗脱阶段至少为一 个， 且流动相B比例由50升至100的时间为2931min。 0048 在可选的实施方式中， 所述流动相A和流动相B中Tris溶液的浓度为1921mM， 所 述流动相B中NaCl的浓度为3.94.1M。 0049 在可选的实施方式中， 所述流动相A和流动相B中Tris溶液的浓度为20mM， 所述流 动相B中NaCl的浓度为4M。 说明书 3/13 页 6 CN 115728406 A 6 0050 在可选的实施方式中， 流动相A和流动相B。

22、的流速为1ml/min， 色谱柱温度： 50。 0051 在可选的实施方式中， 所述色谱条件为： 0052 以Tris溶液为流动相A， 以含NaCl的Tris溶液为流动相B， 所述Tris溶液浓度为 20mM， 所述流动相B中NaCl的浓度为4M， 所述流动相A和流动相B的流速为1ml/min， 色谱柱温 度50， 检测波长： 260nm； 0053 所述流动相B初始比例为0， 流动相B比例由0升至100的洗脱阶段为两个， 且 其中至少一次流动相B的比例升至100后， 保持稳定的100比例1012min， 优选为 10min。 0054 在可选的实施方式中， 所述色谱条件为： 0055 以Tr。

23、is溶液为流动相A， 以含NaCl的Tris溶液为流动相B， 所述Tris溶液浓度为 20mM， 所述流动相B中NaCl的浓度为4M， 所述流动相A和流动相B的流速为1ml/min， 色谱柱温 度50， 检测波长： 260nm； 0056 所述流动相B初始比例为20， 流动相B比例由20升至100的洗脱阶段为一个， 且流动相B比例由20升至100的时间为2526min， 优选为26min。 0057 在可选的实施方式中， 所述色谱条件为： 0058 以Tris溶液为流动相A， 以含NaCl的Tris溶液为流动相B， 所述Tris溶液浓度为 20mM， 所述流动相B中NaCl的浓度为4M， 所述。

24、流动相A和流动相B的流速为1ml/min， 色谱柱温 度50， 检测波长： 260nm； 0059 所述流动相B初始比例为50， 流动相B比例由50升至100的洗脱阶段为一个， 且流动相B比例由50升至100的时间为2526min， 优选为25.8min。 0060 第二方面， 本发明提供硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法， 所述液相色谱为阴 离子交换高效液相色谱， 包括以下色谱条件： 0061 以含乙腈的Tris溶液为流动相A， 以含NaCl的Tris溶液为流动相B， 流动相A和流动 相B的流速为0.81.2ml/min， 色谱柱温度： 4852， 检测波长： 260nm； 0062 所述Tr。

25、is溶液的浓度为20mM， 所述流动相A中乙腈的体积分数为46， 优选为 5， 所述流动相B中NaCl的浓度为4M， 所述流动相B初始比例为25， 流动相B比例由25升 至100的洗脱阶段至少为一个， 且流动相B比例由25升至100的时间为2526min， 优 选为25.8min。 0063 第三方面， 本发明提供前述实施方式任一项所述的硫代CPGODN的液相色谱分离 方法在硫代寡聚核苷酸纯化中的应用。 0064 在可选的实施方式中， 所述硫代寡聚核苷酸包括含有2224个核苷酸的硫代寡聚 核苷酸， 例如22、 23或24个核苷酸。 包括但不限于含有24个核苷酸的硫代寡聚核苷酸， 例如 核苷酸序。

26、列为5 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3 (SEQ ID No.1)的记为样品1， 或含有22个 核苷酸的硫代寡聚核苷酸， 例如核苷酸序列为5 TGACTGTGAACGTTCGAGATGA3 (SEQ ID No.2)的记为样品2。 0065 需要说明的是， 不同种类硫代寡聚核苷酸的具体组成带来的液相色谱分离效果差 异并不大， 本发明提供的液相色谱分离方法能够适用硫代寡聚核苷酸的离子色谱分离和纯 化， 而上述样品1或样品2仅作为示例记载于本发明的实施例中， 不应当理解为对本发明适 用硫代寡聚核苷酸种类的限缩。 说明书 4/13 页 7 CN 115728406 A 7 006。

27、6 下面结合附图， 对本发明的一些实施方式作详细说明。 在不冲突的情况下， 下述的 实施例及实施例中的特征可以相互组合。 0067 下列实施例涉及到的材料和试剂， 实验条件和方法如下： 0068 一、 试剂耗材 0069 氯化钠、 Tris、 盐酸和乙腈。 0070 色谱柱： 强阴离子交换柱 0071 二、 检测方法步骤 0072 流动相A： 称取2.42g0.02g Tris， 加入约900mL超纯水溶解， 用稀盐酸调节pH至 8.00.02， 用超纯水稀释至1000mL， 用0.22 m微孔滤膜过滤。 0073 流动相B： 称取2.42g0.02g Tris和233g0.2g NaCl， 。

28、加入约900mL超纯水溶解， 用稀盐酸调节pH至8.000.02， 加超纯水稀释至1000mL， 用0.22 m微孔滤膜过滤。 0074 稀盐酸： 量取盐酸234mL， 加超纯水稀释至1000mL， 即得。 0075 0.9氯化钠溶液： 称取9.0g0.05g NaCl， 加超纯水溶解并稀释至1000mL。 0076 实施例1 0077 本实施例提供了一种硫代CPGODN的液相色谱分离方法， 色谱条件如下： 0078 0079 流动相梯度表： 0080 时间(min)流动相A()流动相B() 0.01000 4.21000 21.00100 25.21000 33.61000 40.00100。

29、 50.00100 54.01000 63.01000 0081 采用上述色谱条件重复处理样品(含有24个核酸的硫代寡聚核苷酸， 上述样品1) 五次， 结果如图1所示， 由图1可以看出， 连续进样5针样品的主峰后都出现了未知峰， 且重复 性较好， 主峰前面不存在未知峰， 说明盐溶液的洗脱力度或者洗脱时间能够将主成分洗脱 下来， 能够用于该类核酸样品的分离， 不过由图1可以看出， 主成分洗脱并不完全。 0082 实施例2 说明书 5/13 页 8 CN 115728406 A 8 0083 本实施例提供了一种硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法， 色谱条件如下： 0084 0085 流动相梯度表： 。

30、0086 时间(min)流动相A()流动相B() 0.08020 4.28020 21.00100 33.08020 45.08020 0087 采用上述色谱条件处理硫代寡聚核苷酸样品(含有24个核酸的硫代寡聚核苷酸， 上述样品1)， 结果如图2所示， 本实施例与实施例1相比提高了盐溶液的初始比例， 可以看 出， 通过提高盐溶液的初始比例， 未知峰前移， 说明是因盐溶液洗脱力度不够造成实主成分 不能完全洗脱。 0088 实施例3 0089 本 实 施 例 提 供 了 一 种 硫 代 的 液 相 色 谱 分 离 方 法 ， 色 谱 条 件 如 下 ： 0090 流动相梯度表： 0091 说明书 。

31、6/13 页 9 CN 115728406 A 9 0092 0093 采用上述色谱条件处理硫代寡聚核苷酸样品(含有24个核酸的硫代寡聚核苷酸， 上述样品1)， 结果如图3所示， 本实施例相对于实施例2， 在提高盐溶液初始比例的同时又延 长其洗脱时间， 即放缓盐溶液由20到100的速度， 由图3可以看出， 结果未知峰变小， 主 峰峰面积变大。 0094 对比实施例2和实施例3的结果如下： 0095 0096 由上述对比可以看出， 盐溶液的洗脱时间越长， 主峰峰面积越大， 未知峰峰面积越 小， 但总的峰面积变化不明显， 也从侧面说明两个色谱峰是同一物质。 0097 实施例4 0098 本实施例提。

32、供了一种硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法， 色谱条件如下： 0099 0100 流动相梯度表： 0101 时间(min)流动相A()流动相B() 0.05050 4.25050 说明书 7/13 页 10 CN 115728406 A 10 30.00100 38.05050 48.05050 0102 采用上述色谱条件处理硫代寡聚核苷酸样品(含有24个核酸的硫代寡聚核苷酸， 上述样品1)， 结果如图4所示， 由图4可以看出， 盐溶液初始比例由20提高到50后， 主成 分被完全洗脱下来， 峰面积明显变大， 与之前主峰和未知峰的总峰面积比较无明显变化， 但 是峰形不好。 0103 实施例5 01。

33、04 本实施例提供了一种硫代寡聚核苷酸的液相色谱分离方法， 色谱条件如下： 0105 0106 流动相梯度表： 0107 时间(min)流动相A()流动相B() 0.07525 4.27525 30.00100 38.07525 48.07525 0108 采用上述色谱条件处理硫代寡聚核苷酸样品(含有24个核酸的硫代寡聚核苷酸， 上述样品1)， 结果如图5所示， 连续进样6针后得到检测结果图6， 由图5和图6可以看出， 主成 分被完全洗脱下来且没有残留， 重复性较好， 但有拖尾现象， 根据文献报道， 基于阴离子交 换的寡聚核苷酸层析和分析中拖尾是一个较普遍现象， 其原因在于全硫代修饰会增加核酸。

34、 分子的粘度， 增加分离难度， 同时基于阴离子交换的核酸分析条件需要较高的柱温(50) 和较高的pH(8.0),容易造成拖尾等现象， 但对样品的分析不会产生影响， 且该方法已经过 精密度、 线性、 准确度和耐用性等项目的分析方法验证， 均已通过验证要求。 0109 效果例 0110 使用样品硫代寡聚核苷酸对上述实施例5提供的检测方法的检测效果进行验证， 检测步骤如下： 0111 流动相A： 称取2.42g0.02g Tris， 加入约900mL超纯水溶解， 用稀盐酸调节pH至 8.00.02， 加入乙腈50mL， 用超纯水稀释至1000mL， 用0.22 m微孔滤膜过滤。 0112 流动相B：。

35、 称取2.42g0.02g Tris和233g0.2g NaCl， 加入约900mL超纯水溶解， 用稀盐酸调节pH至8.000.02， 加超纯水稀释至1000mL， 用0.22 m微孔滤膜过滤。 0113 稀盐酸： 量取盐酸234mL， 加超纯水稀释至1000mL， 即得。 说明书 8/13 页 11 CN 115728406 A 11 0114 0.9氯化钠溶液： 称取9.0g0.05g NaCl， 加超纯水溶解并稀释至1000mL。 0115 ZJ001样品溶液： 称取ZJ001冻干粉适量， 用0.9氯化钠溶液溶解后测定其含量应 在0.5mg/mL2.5mg/mL范围内， 样品经10000。

36、rpm离心10min， 取上清装入样品瓶。 0116 用流动相初始比例平衡色谱柱60min以上， 至压力和基线稳定后运行样品序列。 0117 序列运行结束后， 用20mMTris pH8.0冲洗色谱柱60min以上， 拆下色谱柱， 然后用 超纯水清洗系统管路至少4小时。 0118 按照面积归一化法获得主峰的峰面积即为ZJ001样品的纯度。 0119 下面对检测效果进行评价： 0120 (1)专属性： 空白缓冲液中无目标峰， 供试品溶液中有目标峰； 供试品加杂中， 目标 峰与杂质峰达到基线分离， 结果符合专属性要求。 0121 (2)精密度(重复性)： 由一名实验者按照上述操作对该样品平行制备6。

37、份， 考察6针 峰面积RSD和纯度RSD， 结果如下， 均符合重复性要求。 0122 0123 0124 (3)精密度(中间精密度)： 两名分析者在不同日期按照上述制备方法分别平行制 备3份， 察6针峰面积RSD和纯度RSD， 结果均符合中间精密度要求。 说明书 9/13 页 12 CN 115728406 A 12 0125 0126 (4)线性： 在5002500 g/mL范围内， 符合线性验证要求。 说明书 10/13 页 13 CN 115728406 A 13 0127 0128 (5)准确度 0129 说明书 11/13 页 14 CN 115728406 A 14 0130 01。

38、31 (6)耐用性 0132 供试品溶液稳定性： 供试品溶液在28分别放置0h、 12h、 24h、 48h、 72h。 0133 说明书 12/13 页 15 CN 115728406 A 15 0134 0135 色谱条件微调： (此项目为了验证该方法的耐用性) 0136 0137 结论： 各验证内容均符合其可接受标准， 说明采用本方法适合特选样品硫代寡聚 核苷酸的IEX HPLC纯度和稳定性的分析检测。 0138 最后应说明的是： 以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案， 而非对其限制； 尽 管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明， 本领域的普通技术人员应当理解： 其依 然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分或者全部技术特征进 行等同替换； 而这些修改或者替换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术 方案的范围。 说明书 13/13 页 16 CN 115728406 A 16 图1 图2 说明书附图 1/4 页 17 CN 115728406 A 17 图3 图4 说明书附图 2/4 页 18 CN 115728406 A 18 图5 图6 说明书附图 3/4 页 19 CN 115728406 A 19 图7 说明书附图 4/4 页 20 CN 115728406 A 20 。