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1、(19)国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210935141.7 (22)申请日 2022.08.05 (71)申请人 华熙生物科技股份有限公司 地址 250000 山东省济南市高新技术开发 区天辰大街678号 申请人 江南大学 江苏华熙益能生物科技有限公司 (72)发明人 周景文邓汉宁张天萌张伟平 刘云鹏徐沙曾伟主 (74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211 专利代理师 仇钰莹 (51)Int.Cl. C12N 15/54(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 15/。
2、61(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12P 17/06(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种生产雌马酚的菌株及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种生产雌马酚的菌株及其 应用， 属于基因工程和生物工程技术领域。 本发 明提供了6磷酸果糖激酶的基因pfkA， NAD(P)+ 转氢酶基因sthA和/或GNAT家族N乙酰转移酶基 因elaA的新用途， 通过对大肠杆菌基因组内源的 pfkA， sthA， elaA中的一个或多个基因进行敲除， 提高了雌马酚的生产能力， 使摇瓶水平的雌马酚 产量由。
3、90mg/L提高至110.6224.1mg/L不等。 权利要求书1页 说明书10页 序列表（电子公布） 附图4页 CN 115725614 A 2023.03.03 CN 115725614 A 1.6磷酸果糖激酶的基因pfkA， NAD(P)+转氢酶基因sthA和/或GNAT家族N乙酰转移酶 基因elaA在提高大肠杆菌雌马酚产量方面的应用， 其特征在于， 所述基因pfkA的核苷酸序 列如Gene ID： 948412所示； 所述基因elaA的核苷酸序列如Gene ID： 946750所示； 所述基因 sthA的核苷酸序列如Gene ID： 948461所示。 2.一种用于生产雌马酚的重组大肠。
4、杆菌， 其特征在于， 包含对出发菌株的如下一个或 多个基因进行了基因表达抑制： 编码6磷酸果糖激酶的基因pfkA， NAD(P)+转氢酶基因 sthA， GNAT家族N乙酰转移酶基因elaA。 3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌， 其特征在于， 缺失或沉默了(a)(c)任一组大 肠杆菌内源基因： (a)6磷酸果糖激酶基因pfkA和NAD(P)+转氢酶基因sthA； (b)6磷酸果糖激酶基因pfkA和GNAT家族N乙酰转移酶基因elaA； (c)NAD(P)+转氢酶基因sthA和GNAT家族N乙酰转移酶基因elaA。 4.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌， 其特征在于， 缺失或沉默了大肠杆菌内。
5、源的6 磷酸果糖激酶基因pfkA、 NAD(P)+转氢酶基因sthA和GNAT家族N乙酰转移酶基因elaA。 5.根据权利要求24任一所述的重组大肠杆菌， 其特征在于， 所述基因pfkA的核苷酸 序列如Gene ID： 948412所示， Gene ID为948412； 所述基因elaA的Gene ID为946750； 所述基 因sthA Gene ID为948461。 6.根据权利要求25任一所述的重组大肠杆菌， 其特征在于， 还进行了如下至少一种 改进： (1)表达了Asaccharobacter celatus来源的大豆苷元还原酶Ac_DZNR； (2)表达了Lactococcus ga。
6、rvieae来源的二氢大豆苷元消旋酶Lg_DDRC； (3)表达了Slackia isoflavoniconvertens来源的二氢大豆苷元还原酶Si_DHDR和四 氢大豆苷元还原酶Si_THDR。 7.根据权利要求6所述的重组大肠杆菌， 其特征在于， 所述大豆苷元还原酶Ac_DZNR含 有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列； 所述二氢大豆苷元消旋酶Lg_DDRC含有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列； 所述二氢大豆苷元还原酶Si_DHDR含有如SEQ ID NO.7所示的氨基 酸序列； 所述四氢大豆苷元还原酶Si_THDR含有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。 8.根据权。
7、利要求27任一所述的重组大肠杆菌， 其特征在于， 以大肠杆菌BL21(DE3)为 宿主。 9.一种微生物转化大豆苷元生产雌马酚的方法， 其特征在于， 以权利要求28任一所 述的重组大肠杆菌为发酵菌株。 10.权利要求14任一所述的重组大肠杆菌或权利要求59任一所述的方法在生产含 雌马酚产品方面的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 115725614 A 2 一种生产雌马酚的菌株及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种生产雌马酚的菌株及其应用， 属于基因工程及生物工程技术领 域。 背景技术 0002 异黄酮类物质是豆科植物中的重要功能物质， 在植物的抗病虫害等方面扮演着重 要的角色， 。
8、对人类健康也具有积极的作用。 大豆苷元广泛存在于大豆等豆类植物中， 可以较 容易地从豆类植物中提取得到。 但其对人体的主要功效是通过它的还原形式雌马酚所体 现的， 雌马酚的功能性强于大豆苷元数倍， 并具有许多大豆苷元不具备的功效， 这使得雌马 酚在药物、 化妆品和食品工业领域具有巨大的应用潜力。 0003 由于雌马酚是由肠道菌群转化大豆苷元生成的， 并不能从植物中提取。 目前对雌 马酚的生产主要是利用传统的化学方法， 通过对大豆苷元进行一系列的还原， 保护与脱保 护反应而制备。 对于手性化合物的合成， 通常存在着反应能耗高， 分离难度大， 催化剂昂贵 等问题， 而且通常会产生较多的副产物， 导。
9、致目标产物的得率低。 而通过微生物转化的方式 生产雌马酚则可以很好的避免这些问题， 且微生物转化生成的雌马酚全为S型， 正好是我们 所需要的。 因此， 针对化学合成雌马酚在产品稳定性、 质量安全和价格等方面的局限， 绿色， 安全， 产物单一的微生物转化方式为雌马酚的合成提供可行的思路。 发明内容 0004 本发明提供了6磷酸果糖激酶的基因pfkA， NAD(P)+转氢酶基因sthA和/或GNAT家 族N乙酰转移酶基因elaA在提高大肠杆菌雌马酚产量方面的应用。 0005 在一种实施方式中， 所述应用是抑制6磷酸果糖激酶的基因pfkA， NAD(P)+转氢酶 基因sthA， GNAT家族N乙酰转。
10、移酶基因elaA中的一个或多个基因的表达。 0006 在一种实施方式中， 所述基因pfkA的核苷酸序列如Gene ID： 948412所示； 所述基 因elaA的核苷酸序列如Gene ID： 946750所示； 所述基因sthA的核苷酸序列如Gene ID： 948461所示。 0007 本发明还提供了用于生产雌马酚的重组大肠杆菌， 以大肠杆菌为出发菌株， 对如 下一个或多个基因进行了基因表达抑制： 编码6磷酸果糖激酶的基因pfkA， NAD(P)+转氢酶 基因sthA， GNAT家族N乙酰转移酶基因。 0008 在一种实施方式中， 所述重组大肠杆菌缺失或沉默了大肠杆菌内源编码6磷酸果 糖激酶。
11、的基因pfkA， NAD(P)+转氢酶基因sthA， GNAT家族N乙酰转移酶基因elaA中的一个或 多个。 0009 在一种实施方式中， 所述重组大肠杆菌敲除了大肠杆菌内源编码6磷酸果糖激酶 的基因pfkA， NAD(P)+转氢酶基因sthA， GNAT家族N乙酰转移酶基因elaA中的一个或多个。 0010 在一种实施方式中， 所述重组大肠杆菌缺失或沉默了6磷酸果糖激酶基因pfkA和 NAD(P)+转氢酶基因sthA。 说明书 1/10 页 3 CN 115725614 A 3 0011 在一种实施方式中， 所述重组大肠杆菌缺失或沉默了6磷酸果糖激酶基因pfkA和 GNAT家族N乙酰转移酶基。
12、因elaA。 0012 在一种实施方式中， 所述重组大肠杆菌缺失或沉默了NAD(P)+转氢酶基因sthA和 GNAT家族N乙酰转移酶基因elaA。 0013 在一种实施方式中， 所述重组大肠杆菌缺失或沉默了大肠杆菌内源的6磷酸果糖 激酶基因pfkA、 NAD(P)+转氢酶基因sthA和GNAT家族N乙酰转移酶基因elaA。 0014 在一种实施方式中， 所述大肠杆菌工程菌还进行了如下至少一种改进： 0015 (1)表达了Asaccharobacter celatus来源的大豆苷元还原酶Ac_DZNR； 0016 (2)表达了Lactococcus garvieae来源的二氢大豆苷元消旋酶Lg_。
13、DDRC； 0017 (3)表达了Slackia isoflavoniconvertens来源的二氢大豆苷元还原酶Si_DHDR 和四氢大豆苷元还原酶Si_THDR。 0018 在一种实施方式中， 所述大肠杆菌工程菌以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株。 0019 在一种实施方式中， 所述大豆苷元还原酶Ac_DZNR的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所 示， 编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 0020 在一种实施方式中， 所述二氢大豆苷元消旋酶Lg_DDRC的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示， 编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 0021 在一种实施。
14、方式中， 所述二氢大豆苷元还原酶Si_DHDR的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示， 编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。 0022 在一种实施方式中， 所述四氢大豆苷元还原酶Si_THDR的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示， 编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。 0023 在一种实施方式中， 以pRSFDuet1、 pCDFDuet1、 pETDuet1作为表达载体表达所 述大豆苷元还原酶Ac_DZNR、 二氢大豆苷元消旋酶Lg_DDRC、 二氢大豆苷元还原酶Si_DHDR或 四氢大豆苷元还原酶Si_THDR。 0024 本发明还提供了一种微生物转化大豆。
15、苷元生产雌马酚的方法， 所述方法是以所述 大肠杆菌为发酵菌株， 在含大豆苷元的培养基中， 于2537发酵至少24h。 0025 在一种实施方式中， 所述方法还采用IPTG诱导。 0026 在一种实施方式中， 所述发酵采用分阶段发酵， 所述分阶段包括： 0027 第一阶段： 控制温度3537、 溶解氧浓度3545促进细胞生长； 0028 第二阶段： 添加终浓度0.10.2mM的诱导剂， 并控制温度2328， 氧气浓度25 35， 诱导57h后流加大豆苷元； 0029 第三阶段： 控制温度2328发酵至少2326h。 0030 在一种实施方式中， 所述方法是将20g/L终浓度的葡萄糖于30， 15。
16、0rpm继续发酵 24h。 0031 在一种实施方式中， 所述方法是将所述重组大肠杆菌接种于LB培养基中培养8 12h作为种子液， 以14的接种量接种于TB培养基中， 3537培养至OD6000.6 1.0， 加入0.10.5mM终浓度的IPTG并降温诱导812h， 补加大豆苷元于2228， 并补加 20g/L终浓度的葡萄糖继续发酵1248h。 0032 在一种实施方式中， 所述方法是将所述大肠杆菌种子液接种于TB培养基中， 37 培养至OD6000.8， 加入终浓度0.1mM的IPTG并降温诱导10h， 再向发酵培养基中补加大豆苷 说明书 2/10 页 4 CN 115725614 A 4 。
17、元和葡萄糖， 于2830， 120180rpm继续发酵至少24h。 0033 在一种实施方式中， 所述种子液是将所述大肠杆菌接种于LB培养基中培养10h获 得。 0034 本发明还要求保护所述大肠杆菌在生产含雌马酚产品方面的应用。 0035 有益效果： 0036 (1)本发明筛选获得了来源于Asaccharobacter celatus的大豆苷元还原酶， 该酶 的转化率高达58。 0037 (2)本发明将Asaccharobacter celatus的大豆苷元还原酶在大肠杆菌中表达， 并 表达Lg_DDRC， Si_DHDR， Si_THDR， 实现了雌马酚在大肠杆菌中的合成， 为雌马酚的合成。
18、提供 了良好的基础。 0038 (3)本发明通过敲除了大肠杆菌内源编码6磷酸果糖激酶的基因pfkA， NAD(P)+转 氢酶基因sthA， GNAT家族N乙酰转移酶基因elaA中的一个或多个基因， 使雌马酚的产量由 91.9mg/L提高至110.6224.1mg/L不等。 附图说明 0039 图1为携带大豆苷元还原酶的表达载体构建图。 0040 图2为全细胞催化的色谱图。 0041 图3为转化产物二氢大豆苷元的质谱图。 0042 图4为全细胞催化验证催化能力的产量比较图。 0043 图5为雌马酚的质谱柱状图。 0044 图6为工程菌株在转化条件下的雌马酚摇瓶水平产量图。 具体实施方式 0045。
19、 (一)培养基 0046 LB培养基： 蛋白胨10g/L， 酵母粉5g/L， 氯化钠10g/L。 加入15g/L琼脂粉， 以配制LB 固体培养基。 0047 TB培养基： 蛋白胨12g/L， 酵母粉24g/L， 4mL甘油、 KH2PO4 2.31g/L、 K2HPO4 12.54g/ L。 0048 发酵培养基： 蛋白胨12g/L， 酵母粉24g/L， 5g/L葡萄糖、 KH2PO4 2 .31g/L、 K2HPO412.54g/L。 0049 补充培养基： D葡萄糖500g/L、 MgSO47H2O 7.5g/L、 酵母提取物10g/L。 0050 200g/L葡萄糖母液： 称取200g无。
20、水葡萄糖溶于500mL去离子水中， 完全溶解后定容 至1L。 0051 100mM大豆苷元的DMSO母液： 称取100mmol大豆苷元溶于500mL DMSO中， 完全溶解 后用DMSO定容至1L。 0052 200mM大豆苷元的DMSO母液： 称取200mmol大豆苷元溶于500mL DMSO中， 完全溶解 后用DMSO定容至1L。 0053 (二)大肠杆菌的化学转化感受态制备： 0054 将E.coli BL21(DE3)划线于LB固体平板中培养12h。 挑取单菌落接种于5mL液体LB 说明书 3/10 页 5 CN 115725614 A 5 培养基中培养810h， 以1.52.5接种量。
21、接种于50mL LB培养基中， 培养至OD6000.61.0。 0055 感受态试剂盒采用TAKRA公司的高效感受态制备试剂盒。 感受态制备过程按其说 明书进行操作。 0056 (三)大肠杆菌电转化感受态制备： 0057 将E.coli BL21(DE3)划线于LB固体平板中培养12h。 挑取单菌落接种于5mL液体LB 培养基中培养810h， 以2接种量接种于50mL LB培养基中(用于基因敲除时添加终浓度 1mM的阿拉伯糖)， 培养至OD6000.61.0。 冰上冷却菌体30min， 4000rpm， 4收集菌体， 用 10的预冷甘油溶液重悬洗涤菌体， 重复洗涤一次， 用10的预冷甘油溶液重。
22、悬菌体后分 装至无菌EP管中， 即得大肠杆菌电转化感受态。 0058 (四)大肠杆菌的化学转化： 0059 1)取制备好的感受态细胞于冰上放置冻融， 加入相应构建好的表达载体， 冰上放 置30min。 0060 2)将放置后的含目标载体的感受态于42水浴锅热激90s， 之后置于37摇床后 培养40min左右。 0061 3)将感受态低速离心后去除部分上清， 吹吸悬浮细胞， 涂布于含相应抗性的LB平 板上， 进行抗性筛选， 并做菌落PCR及测序验证重组转化子。 0062 (五)大肠杆菌的电转化： 0063 1)取制备好的感受态细胞于冰上放置冻融， 加入相应构建好的载体或片段混匀， 冰上放置515。
23、min。 0064 2)吸取含目的载体或片段的感受态至预冷的0.2mm电转杯中， 在1.25kV/mm， 25 F， 200条件下电激。 0065 3)立即吸取1mL的LB培养基重悬电激后的大肠杆菌， 转移至无菌EP管中， 置于37 摇床后培养12h左右。 0066 4)将感受态低速离心后去除部分上清， 吹吸悬浮细胞， 涂布于含相应抗性的LB平 板上， 进行抗性筛选， 并做菌落PCR及测序验证重组转化子。 0067 (六)雌马酚的HPLC测定： 0068 使用岛津高效液相色谱检测， 液相检测条件为： 大曹色谱柱CAPCELL PAK UG120 250mm4.6mm column(partic。
24、le size 5 m)； 流动相A， 含有1甲酸的超纯水； 流动相B， 含 有1甲酸的甲醇； 流动相比例条件， 02min， 5B， 213min， 5100B， 1315min， 100B， 1518min， 1005B， 1820min， 5B； 流速： 1mL/min； 柱温： 40； 进样量： 10 L； 检测器波 长： 280nm。 0069 (七)菌株信息如表1所示。 0070 表1实施例涉及的菌株 说明书 4/10 页 6 CN 115725614 A 6 0071 0072 0073 实施例1大肠杆菌内源基因的单敲除及组合敲除 0074 为了提高底盘细胞生产雌马酚的能力， 利。
25、用CRISPR/Cas9系统对E.coli BL21 (DE3)相关内源基因进行敲除。 分别用引物sgpfkAF/sgpfkAR、 sgsthAF/sgsthAR、 sgelaAF/sgelaAR扩增质粒pEcgRNA， 利用热激法转入大肠杆菌BL21(DE3)中， 涂布于含 有链霉素的抗性平板筛选阳性转化子， 挑取单菌落接种于含相应抗性的5mL液体LB中， 提取 质粒， 即得质粒pEcgRNApfkA、 pEcgRNAelaA、 pEcgRNAsthA； 用引物pfkAarmupF/pfkA armupR和pfkAarmdownF/pfkAarmdownR分别扩增基因pfkA得上下由同源臂p。
26、fkA armup、 pfkAarmdown， 再以pfkAarmup、 pfkAarmdown为模板， 用引物pfkAarmupF/pfkA armdownR进行融合PCR， 得到片段pfkAarm； 用引物elaAarmupF/elaAarmupR和elaA armdownF/elaAarmdownR分别扩增基因elaA得上下由同源臂elaAarmup、 elaA armdown， 再以elaAarmup和elaAarmdown为模板， 用引物elaAarmupF/elaAarmdownR 进行融合PCR， 得到片段elaAarm； 用引物sthAarmupF/sthAarmupR和sth。
27、AarmdownF/ sthAarmdownR分别扩增基因sthA得上下由同源臂sthAarmup、 sthAarmdown， 再以sthA armup和sthAarmdown为模板， 用引物sthAarmupF/sthAarmdownR进行融合PCR， 得到片 段sthAarm； 将PCR产物sthAarm通过试剂盒回收并测序验证。 0075 取100ng的pEcCas质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)的化学感受态细胞中， 得到菌株 BL21(DE3)Cas,利用菌株BL21(DE3)Cas制备电转化感受态。 取100ng pEcgRNApfkA和 400ng pfkAarm电转入BL21。
28、(DE3)Cas感受态中进行pfkA基因的敲除， 将敲除成功的菌株 消除质粒pEcgRNApfkA， 获得菌株BL21(DE3)pfkACas， 进一步消除质粒pCas质粒， 获得 菌株EqC_No1。 0076 以上述相同的策略， 取100ng pEcgRNAsthA和400ng sthAarm电转入BL21(DE3) Cas感受态中进行Gene ID 948461所示sthA基因的敲除， 将敲除成功的菌株消除质粒 pEcgRNAsthA， 获得菌株BL21(DE3)sthACas， 进一步消除质粒pEcCas后， 得到菌株EqC_ No2。 0077 以上述相同的策略， 取100ng pE。
29、cgRNAelaA和400ng elaAarm电转入BL21(DE3) Cas感受态中进行Gene ID 946750所示elaA基因的敲除， 将敲除成功的菌株消除质粒 pEcgRNAelaA和pEcCas后， 得到菌株EqC_No21。 说明书 5/10 页 7 CN 115725614 A 7 0078 所用引物序列均列在表2中。 0079 表2引物及序列 0080 0081 0082 实施例2大肠杆菌内源基因的双敲除 0083 按照实施例1相同的策略， 区别在于， 取100ng pEcgRNAsthA和400ng sthAarm电 转入BL21(DE3)pfkACas(含有pCas质粒的。
30、EqC_No1)感受态中进行Gene ID 948461所示 sthA基因的敲除， 将敲除成功的菌株消除质粒pEcgRNAsthA， 获得菌株BL21(DE3)pfkA sthACas， 进一步消除pEcCas后， 得到同时敲除pfkA和sthA的菌株， 命名为EqC_No3。 0084 以上述相同的策略， 区别在于， 取100ng pEcgRNAelaA和400ng elaAarm电转入 BL21(DE3)pfkACas(含有pCas质粒的EqC_No1)感受态中进行Gene ID 946750所示elaA 基因的敲除， 将敲除成功的菌株消除质粒pEcgRNAelaA和pEcCas后， 得到。
31、敲除pfkA和elaA 菌株， 命名为EqC_No31。 0085 以上述相同的策略， 区别在于， 取100ng pEcgRNAelaA和400ng elaAarm电转入 BL21(DE3)sthACas感受态(含有pCas质粒的EqC_No2)中进行Gene ID 948461所示elaA 基因的敲除， 将敲除成功的菌株消除质粒pEcgRNAelaA和pEcCas后， 得到敲除elaA和sthA 菌株， 命名为EqC_No32。 0086 实施例3大肠杆菌内源基因的三敲除 说明书 6/10 页 8 CN 115725614 A 8 0087 按照实施例1相同的策略， 区别在于， 取100ng。
32、 pEcgRNAelaA和400ng elaAarm电 转入BL21(DE3)pfkAsthACas感受态中进行Gene ID 946750所示elaA基因的敲除， 将 敲除成功的菌株消除质粒pEcgRNAelaA， 获得菌株BL21(DE3)pfkAsthAelaACas， 进 一步消除pEcCas后， 得到同时敲除pfkA、 sthA、 elaA三个基因的菌株， 命名为EqC_No4。 0088 实施例4表达大豆苷元还原酶的质粒构建及酶的表达 0089 1)表达载体构建 0090 来源于Slackia isoflavoniconvertens的大豆苷元还原酶Si_DZNR， 其氨基酸序 列。
33、如Genbank登录号WP_123220034.1所示， 经密码子优化后得到编码Si_DZNR的基因片段， 并构建于pET28a(+)表达载体的多克隆位点， 获得重组质粒pET28a(+)1， 其质粒图谱如图1 所示， 其N端保留了His标签和thrombin位点， 以双酶切方式构建。 密码子优化， 基因合成， 载 体构建均由上海生工生物工程有限公司完成。 0091 将来源于Adlercreutzia celatus的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的酶， 通过密 码子优化获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1的基因片段， 采用与重组质粒pET28a(+)1同样的 方法， 构建至pET2。
34、8a(+)表达载体， 获得重组质粒pET28a(+)2。 0092 按照上述相同策略， 分别将来源于Adlercreutzia mucosicola(氨基酸序列如 Genbank登录号： WP_160344852.1所示)、 Sharpea porci(氨基酸序列如Genbank登录号： WP_ 154515424.1所示)、 Sharpea azabuensis(氨基酸序列如Genbank登录号： WP_074782075.1 所示)、 Traorella massiliensis(氨基酸序列如Genbank登录号： WP_071441835.1所示)、 Catenisphaera adip。
35、ataccumulans(氨基酸序列如Genbank登录号： WP_183327643.1所示)、 Clostridium saccharogumia(氨基酸序列如Genbank登录号： WP_027090791.1所示)、 Intestinibaculum porci(氨基酸序列如Genbank登录号： WP_179951177 .1所示)、 Holdemania massiliensis(氨基酸序列如Genbank登录号： WP_020223358.1所示)的酶分别 进行密码子优化， 采用与重组质粒pET28a(+)1相同的策略， 构建至pET28a(+)表达载体， 分 别获得重组质粒pE。
36、T28a(+)3pET28a(+)10。 0093 2)蛋白表达 0094 将步骤(1)构建的重组质粒pET28a(+)1pET28a(+)10分别转化至大肠杆菌感 受态细胞中， 并将转化液涂布至LB平板上， 37培养过夜， 利用菌落PCR验证转化子， 获得重 组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)1E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)10。 0095 将验证正确的转化子转移至含有50mg/L硫酸卡那霉素的5mL LB培养基中37过 夜培养， 制备种子液。 将培养好的种子液以一定比例转接至含有50mg/L硫酸卡那霉素的 50mL TB培养基中， 控制初始OD。
37、6000.020.04， 37， 220rpm培养至菌体浓度达到OD600 0.8后， 降温至2228， 并添加异丙基 D硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.1mM进行诱导 表达812h， 获得菌液。 0096 实施例5全细胞催化验证酶的催化能力 0097 将实施例4中重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)1E.coli BL21(DE3)/ pET28a(+)10的菌液分别于4000rpm， 4离心收集菌体， 并用PBS溶液清洗菌体2次， 收集细 胞重悬于KPB(pH8.0)溶液中， 并控制细胞重悬液的菌体量为OD60010， 随后， 往细胞重悬 液中添加体积分数6的1。
38、00mM大豆苷元DMSO储备液， 混合均匀后， 置于25， 150rpm的反应 条件下进行全细胞催化。 说明书 7/10 页 9 CN 115725614 A 9 0098 通过全细胞催化大豆苷元以比较和验证氨基酸序列如Genbank登录号WP_ 123220034.1所示的Si_DZNR和实施例1筛选的大豆苷元还原酶活性， 定时取样用于液相检 测产物的生成及底物消耗情况。 转化率()按如下公式计算： 实际生成的二氢大豆苷元摩 尔数/理论完全转化生成二氢大豆苷元摩尔数100。 0099 结果如图2图4所示， 来源于Adlercreutzia celatus、 Adlercreutzia muc。
39、osicola、 Sharpea porci、 Sharpea azabuensis、 Traorella massiliensis的酶具有大 豆苷元还原酶活性， 可以将大豆苷元还原为二氢大豆苷元。 而来源于Catenisphaera adipataccumulans、 Clostridium saccharogumia、 Intestinibaculum porci、 Holdemania massiliensis的酶不具有催化大豆苷元还原为二氢大豆苷元的能力， 转化率为0。 0100 实施例筛选的10个酶在分别加入底物反应12h后表现出最大转化率， 其中， 以氨基 酸序列如SEQ ID N。
40、O.5所示的酶的转化率为58， 约为Si_DZNR的转化率的3倍， 来源于 Adlercreutzia mucosicola、 Sharpea porci、 Sharpea azabuensis、 Traorella massiliensis的酶也具有催化大豆苷元还原为二氢大豆苷元的酶活性， 转化率分别为6、 3、 8、 7。 0101 实施例6转化大豆苷元生产雌马酚的大肠杆菌工程菌株的构建 0102 为构建转化大豆苷元合成雌马酚的工程菌株， 以pCDFDuet1、 pRSFDuet1质粒为 模板， 用引物对pCDFcz1F/pCDFcz1R扩增pCDFDuet1的除MCS1位点的其他片段， 。
41、命名为 pcdf1； 用引物对pCDFDDRCF/pCDFDDRCR扩增SEQ ID NO.2所示的DDRC编码基因片段 ddrc； 利用Gibson组装将pcdf1和ddrc顺序组装， 经抗性筛选验证克隆子， 挑取阳性克隆子 提取质粒后送测序， 将测序正确的质粒命名为pCDFc。 用引物对pCDFcz2R/pCDFcz2F扩 增pCDFc的除MCS2位点的其他片段， 命名为pcdf2； 用引物对pCDFDZNRF/pCDFDZNRR扩 增SEQ ID NO.1所示的Ac_DZNR的编码基因片段dznr； 利用Gibson组装将pcdf2和dznr顺序 组装， 即得质粒pCDFcz。 按照上述。
42、相同的策略， 对于质粒pRSFDuetdt的构建， 用引物对 pRSFdt1F/pRSFdt1R扩增pRSFDuet1的除MCS1位点的其他片段， 命名为pRSF1； 用引物 对pRSFDHDRF/pRSFDHDRR扩增SEQ ID NO.3所示的DHDR编码基因片段dhdr； 利用Gibson 组装将pRSF1和dhdr顺序组装， 经抗性筛选验证克隆子， 挑取阳性克隆子提取质粒后送测 序， 将测序正确的质粒命名为pRSFd。 用引物对pRSFdt2R/pRSFdt2F扩增pRSFd的除 MCS2位点的其他片段， 命名为pRSF2； 用引物对pRSFTHDRF/pRSFTHDRR扩增如SEQ 。
43、ID NO.4所示THDR的编码基因片段thdr； 利用Gibson组装将pRSF2和thdr顺序组装， 即得质粒 pRSFdt。 引物、 基因合成、 测序均由上海生工生物工程有限公司完成。 将pCDFdt和pETcz 转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中得到菌株WT_EqC。 将pCDFdt和pETcz分别转到 EqC_No1、 EqC_No2、 EqC_No3和EqC_No4中， 得到的菌株分别命名为EqC_No5、 EqC_No6、 EqC_ No7和EqC_No8。 0103 所有引物及基因序列均列在表3中。 0104 表3引物及序列 说明书 8/10 页 10 CN 1。
44、15725614 A 10 0105 0106 0107 实施例7转化大豆苷元生产雌马酚的大肠杆菌工程菌株的摇瓶水平生产 0108 分别将实施例6构建的菌株WT_EqC、 EqC_No5EqC_No8划线于含有链霉素、 氨苄青 霉素、 氯霉素的LB平板上于37过夜培养12h， 挑取菌落接种于含有链霉素， 氨苄青霉素， 氯 霉素的LB液体中， 于37， 220rpm培养810h作为种子液， 以1.52.5的接种量接种于含有 5(w/v)的聚乙烯吡咯烷酮(PVP40)的25mL TB培养基(含链霉素， 氨苄青霉素， 氯霉素)中， 培养1.53h， 待菌体OD6000.81.0时， 添加终浓度为0.。
45、1mM的IPTG， 并降温2228， 220rpm 诱导， 诱导1012h后， 添加10200g/L的葡萄糖母液， 并添加5的100mM大豆苷元母液， 于 25， 120180rpm继续培养24h， 并取样进行HPLC检测雌马酚的含量。 液相结果分析显示(图 5图6)对照菌株WT_EqC的雌马酚产量为53.2mg/L； 各改造菌株产量分别为EqC_No5： 说明书 9/10 页 11 CN 115725614 A 11 91.9mg/L， EqC_No6： 110.6mg/L， EqC_No7： 224.1mg/L， EqC_No8： 201.6mg/L。 0109 虽然本发明已以较佳实施例公开如上， 但其并非用以限定本发明， 任何熟悉此技 术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内， 都可做各种的改动与修饰， 因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。 说明书 10/10 页 12 CN 115725614 A 12 图1 说明书附图 1/4 页 13 CN 115725614 A 13 图2 图3 说明书附图 2/4 页 14 CN 115725614 A 14 图4 图5 说明书附图 3/4 页 15 CN 115725614 A 15 图6 说明书附图 4/4 页 16 CN 115725614 A 16 。