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1、(19)国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210944060.3 (22)申请日 2022.08.05 (71)申请人 广州爱保农生物科技有限公司 地址 510000 广东省广州市白云区北太路 1633号广州民营科技园科盛路8号配 套服务大楼5层A505-24房 (72)发明人 汪忠艳吴革华 (74)专利代理机构 厦门市新华专利商标代理有 限公司 35203 专利代理师 张月娥 (51)Int.Cl. C07K 14/78(2006.01) A61K 31/525(2006.01) A61K 38/39(2006.01) A23。
2、L 3/3526(2006.01) A23K 20/147(2016.01) A61P 31/04(2006.01) (54)发明名称 一种大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LP-P1及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种大黄鱼胶原蛋白抗菌肽 LPP1， 其氨基酸序列为KRVRAGMMMRKVAV， 分子量 为1633道尔顿。 实验证明， 本发明抗菌肽LPP1能 够有效抑制副溶血性弧菌和溶藻性弧菌的生长， 且不易产生耐药性， 可以作为抗生素的良好替代 品用于副溶血性弧菌和溶藻性弧菌的防治。 本发 明为后续进一步研究大黄鱼胶原蛋白抗菌肽作 为饲料添加剂、 生物医药开发奠定了基础。 权利要求书1页 说明书5页。
3、 序列表（电子公布） 附图6页 CN 115724943 A 2023.03.03 CN 115724943 A 1.一种大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1， 其氨基酸序列如SEQ ID NO： 1所示。 2.如权利要求1所述的大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1在制备抗菌药物中的应用， 其特征 在于： 所述抗菌药物用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌和/或溶藻性弧菌。 3.一种抗菌药物， 其特征在于： 其有效成分为大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1， 所述抗菌 肽LPP1的氨基酸序列为SEQ ID NO： 1。 4.如权利要求3所述的抗菌药物， 其特征在于： 所述抗菌药物用于抑制和/或杀灭副溶 血性弧菌和/或溶藻性弧。
4、菌。 5.一种饲料添加剂， 其特征在于： 其有效成分为大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1， 所述抗 菌肽LPP1的氨基酸序列为SEQ ID NO： 1。 6.如权利要求5所述的饲料添加剂， 其特征在于： 所述饲料添加剂用于抑制和/或杀灭 副溶血性弧菌和/或溶藻性弧菌。 7.一种食品防腐剂， 其特征在于： 其有效成分为大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1， 所述抗 菌肽LPP1的氨基酸序列为SEQ ID NO： 1。 8.如权利要求9所述的食品防腐剂， 其特征在于： 所述食品防腐剂用于抑制和/或杀灭 副溶血性弧菌和/或溶藻性弧菌。 9.一种抗菌药物， 其特征在于： 其有效成分为大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1和维。
5、生素 B2， 所述抗菌肽LPP1的氨基酸序列为SEQ ID NO： 1。 10.如权利要求9所述的抗菌药物， 其特征在于： 所述抗菌药物用于抑制和/或杀灭副溶 血性弧菌和/或溶藻性弧菌。 权利要求书 1/1 页 2 CN 115724943 A 2 一种大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1及其应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 尤其涉及一种大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1及其应用。 背景技术 0002 大黄鱼(Pseudosciaena crocea)是我国东海四大经济鱼类之一， 在全国范围内广 泛养殖， 尤以福建省产量最高， 约占全国总产量的九成。 近年来,随着大黄鱼养殖规模的不 断扩大。
6、,养殖密度不断提高， 养殖环境不断恶化,病害频繁发生且日趋严重。 其中由弧菌属 细菌引起的疾病， 因其发病率高、 流行范围广、 危害最为严重,每年都给养殖从业者造成了 极大的经济损失。 大黄鱼感染弧菌发病后养殖上经常使用抗生素进行处理， 这不仅给环境 带来二次污染还带来食品安全问题， 并且过度使用会导致许多病原微生物对几乎所有的药 物都产生不同程度的耐药性， 这成为我国畜牧业、 水产养殖业及食品工业领域可持续发展 的桎梏。 因此， 研究开发安全有效的 “抗生素替代物” 对于大黄鱼养殖行业可持续发展有重 要实际意义和应用价值。 0003 抗菌肽(Antimicrobial peptides)被誉。
7、为 “天然抗生素” 是先天免疫系统中至关 重要的一部分， 它是生物体为抵抗病原微生物入侵， 从而形成具有抗菌作用的短肽。 抗菌肽 具有抗菌谱广， 杀菌活力强等特点， 被认为是能够替代抗生素的首选药物， 具有良好的应用 前景。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1及其应用， 通过大黄鱼 胶原蛋白抗菌肽LPP1对副溶血性弧菌和溶藻性弧菌抑菌活性的研究， 为寻找新的食品防 腐剂、 生物医药和水产饲料添加剂提供实验依据， 促进我国食品、 医药和水产养殖行业的健 康、 持续发展。 0005 本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是： 提供一种大黄鱼胶原蛋白抗菌 肽L。
8、PP1。 其氨基酸序列为KRVRAGMMMRKVAV， 如SEQIDNO： 1所示。 0006 抗菌肽LPP1的分子量为1633道尔顿， 所带正电荷为+5， 总疏水性比为57。 0007 抗菌肽LPP1可以从以下作用对细菌造成破坏： 首先吸附在细菌表面， 穿透细胞膜 的脂质双分子层， 然后与细菌基因组DNA相结合， 抑制细菌DNA的合成， 从而导致细菌死亡。 本发明为核黄素联合大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1作为食品防腐剂和水产饲料添加剂提供 了实验依据。 0008 本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是： 提供大黄鱼胶原蛋白抗菌肽 LPP1在制备抗菌药物中的应用， 该抗菌药物用于抑制和/或杀。
9、灭副溶血性弧菌和/或溶藻 性弧菌。 0009 本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是： 提供一种抗菌药物， 其有效成 分为大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1， 所述抗菌肽LPP1的氨基酸序列为SEQ ID NO： 1。 0010 在本发明一较佳实施例中， 所述抗菌药物用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌和/或 说明书 1/5 页 3 CN 115724943 A 3 溶藻性弧菌。 0011 本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是： 提供一种饲料添加剂， 其有效 成分为大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1， 所述抗菌肽LPP1的氨基酸序列为SEQ ID NO： 1。 0012 在本发明一较佳实施例中， 所述。
10、饲料添加剂用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌和/ 或溶藻性弧菌。 0013 本发明解决其技术问题所采用的技术方案之五是： 提供一种食品防腐剂， 其有效 成分为大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1， 所述大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1的氨基酸序列为 SEQ ID NO： 1。 0014 在本发明一较佳实施例中， 所述食品防腐剂用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌和/ 或溶藻性弧菌。 0015 本发明解决其技术问题所采用的技术方案之六是： 提供一种抗菌药物， 其有效成 分为大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1和维生素B2， 所述抗菌肽LPP1的氨基酸序列为SEQ ID NO： 1。 0016 在本发明一较佳实施例中， 所述抗。
11、菌药物用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌和/或 溶藻性弧菌。 0017 本发明的抗菌肽可以采用本领域技术人员已知的方法合成， 例如固相合成， 并采 用本领域技术人员已知的方法进行纯化， 例如高效液相色谱法。 0018 实施本发明， 具有如下有益效果： 0019 本发明以大黄鱼胶原蛋白为研究对象， 通过生物信息学技术筛选， 发现一个全新 氨基酸序列的多肽LPP1。 抗菌肽LPP1与维生素B1、 B2、 B6和B12联合， 筛选出抗菌效果最好 的维生素B2(核黄素)和抗菌肽LPP1组合。 研究核黄素联合大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1对 副溶血性弧菌、 溶藻性弧菌的抑菌活性； 并对它的抑菌机制进行研究。 。
12、实验结果表明， 该结 合肽对副溶血性弧菌、 溶藻性弧菌具有强烈的抑制作用且显著优于单一使用抗菌肽LPP1 时抑制效果， 由此降低抗菌肽LPP1的使用量， 从而降低使用成本。 它的抑菌机理是首先吸 附在细菌表面， 穿透细胞膜的脂质双分子层， 然后与细菌基因组DNA相结合， 抑制细菌DNA的 合成， 从而导致细菌死亡。 本发明为核黄素联合大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1作为食品防腐 剂和水产饲料添加剂提供了实验依据。 附图说明 0020 图1为本发明大黄鱼胶原蛋白源抗菌肽对溶藻弧菌、 副溶血性弧菌抗菌结果图。 0021 图2为本发明大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1对溶藻弧菌(图A)、 副溶血性弧菌(图B)。
13、 最低抑制浓度(MIC)测定对照图。 其中， 0022 a： 抗菌肽浓度0 g/mL； 0023 b： 抗菌肽浓度62.5 g/mL； 0024 c： 抗菌肽浓度31.3 g/mL； 0025 d： 抗菌肽浓度15.6 g/mL； 0026 e： 抗菌肽浓度7.8 g/mL； 0027 f： 抗菌肽浓度3.9 g/mL； 0028 图3为本发明大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1的3D结构预测图。 说明书 2/5 页 4 CN 115724943 A 4 0029 图4为本发明大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1(1/2MIC)联用作用对溶藻弧菌、 副溶血 性弧菌抗菌结果图。 0030 图5为本发明大黄鱼胶原。
14、蛋白抗菌肽LPP1(1/2MIC)联用作用对副溶血性弧菌时 间杀伤曲线(Time kill)图。 在0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液中稀释至1045CFU/mL。 抗菌肽 浓度为1.9 g/mL。 0031 图6为本发明大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1副溶血性弧菌细胞内K+泄漏图。 0032 图7为本发明大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1对与副溶血性弧菌DNA结合电泳图， 其 中， 0033 条带7： 空白对照； 0034 条带16： 分别是结合肽与DNA质量比为100/1， 50/1， 25/1， 25/2， 25/4， 25/8。 0035 图8为本发明大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1对L929细胞。
15、活力的影响柱状图。 具体实施方式 0036 为了更好地理解本发明， 下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明， 但本领域技术人员了解， 下述实施例不是对本发明保护范围的限制， 任何在本发明基础上 做出的改变和变化， 都在本发明的保护范围之内。 0037 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0038 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0039 实施例1： 大黄鱼胶原蛋白抗菌肽的筛选 0040 利用应用抗菌肽(AntiBP)服务器、 抗菌肽收集(CAMPR3)服务器、 抗菌肽计算器和 预测因子(apd2)三个在线软件对大黄鱼胶原。
16、蛋白抗菌肽序列中可能存在的抗菌序列进行 预测， 并对可能具有抗菌序列的电荷、 疏水性进行分析， 最终筛选出序号LPP1、 LPP2、 LP P6、 LPP7和LPP8化学合成， 并进行抑菌活性验证。 筛选结果如下表所示。 0041 表1大黄鱼胶原蛋白肽段生物信息学分析结果 0042 序号肽序列分子量(Da)总疏水比()电荷 LPP1KRVRAGMMMRKVAV1633.12557+5 LPP2EVSPNRVRVGIV1324.5542+1 LPP3ESGSIGTPNF1008.054201 LPP4KASTGSRISSKISQN1563.72420+3 LPP5EGIKQIGGGT959.06。
17、5200 LPP6CCIKPPGPINPKIGF1583.97840+2 LPP7KKQLIESVKNIA1370.64642+2 LPP8EKIKQKVVDTICKSKP1844.23231+3 LPP9EMQQIGGGTHTG1215.311170.75 LPP10DKGVQQVAVVIT1256.464500 0043 实施例2： 抗菌肽抗菌活性验证 0044 将溶藻弧菌、 副溶血性弧菌在37培养12h至对数生长期， 在0.01M pH7.2磷酸 盐缓冲液中稀释至1045CFU/mL。 取上述五种0.5mg/mL肽液等体积与菌液混合后分别于37 下进行孵育， 每隔30分钟取样涂平板， 3。
18、7培养过夜后记录菌落总数， 根据公式： 抑菌率 说明书 3/5 页 5 CN 115724943 A 5 (空白对照菌落数试验组菌落数)/空白对照菌落数100计算抑菌率。 由结果可知， 抗菌 肽LPP1对溶藻弧菌、 副溶血性弧菌抑制效果最明显， 抑制率分别高达99.310.22、 99.710.49(图1)。 0045 实施例3： 抗菌肽LPP1的最低抑制浓度(MIC)测定 0046 大黄鱼胶原蛋白抗菌肽LPP1抑制溶藻弧菌、 副溶血性弧菌的最低抑菌浓度(MIC) 采用微孔法， 在96孔板上进行。 在孔中加入0.01MpH7.2磷酸盐缓冲液中稀释至1045CFU/mL 的溶藻弧菌或副溶血性弧菌。
19、， 然后在孔中分别加入等体积梯度稀释后的不同浓度的大黄鱼 胶原蛋白抗菌肽LPP1， 将96孔板密封于37恒温培养箱中培养1824h。 具有最小抑菌效 果的稀释液所对应的浓度即为最小抑菌浓度MIC。 如图2所示， 抗菌肽LPP1对溶藻性弧菌、 副溶血性弧菌的最低抑菌浓度(MIC)为7.8125 g/mL和3.9063 g/mL。 0047 实施例4： 抗菌肽LPP1的3D结构预测 0048 利用在线结构预测服务器Swissmodel， 对抗菌肽LPP1的结构进行预测， 并利用 Pymol软件进行编辑和修改， 得到抗菌肽LPP1的二级结构， 如图3所示。 0049 实施例4： 抗菌肽LPP1分别与。
20、维生素B1、 B2、 B6和B12联用抗菌效果研究 0050 称取一定量的抗菌肽LPP1分别与维生素B1、 B2、 B6和B12溶解于蒸馏水中， 将肽溶 液与核黄素溶液按照物质的量比10:1混合。 配制的混合溶液在室温下避光磁力搅拌3h， 样 品经真空冷冻干燥成粉末。 将以上粉末配制成已测得的抗菌肽LPP1单用时对溶藻弧菌、 副 溶血性弧菌的1/2MIC值的混合肽液， 重复实施例2中的抗菌活性验证实验。 结果如图4所示， 抗菌肽LPP1与维生素B族复配后抗菌效果均显著提高， 其中与维生素B2复配后获得的肽液 抑菌效果最好， 抗菌肽LPP1由原来的1MIC变为1/2MIC时仍能够抑制溶藻弧菌、 。
21、副溶血性弧 菌的生长， 说明抗菌肽LPP1与维生素B2复配使用对枯溶藻弧菌、 副溶血性弧菌的抑制效果 大于抗菌肽LPP1单独使用时的抑制效果。 重复实施例3， 抗菌肽LPP1与维生素B2复配肽液 对溶藻性弧菌、 副溶血性弧菌的最低抑菌浓度(MIC)为1.95312 g/mL。 0051 实施例5： 抗菌肽LPP1的TIMEKILL测定 0052 以溶藻弧菌， 将溶藻弧菌在37培养12h至对数生长期， 在0.01MpH7.2磷酸盐缓冲 液中稀释至1045CFU/mL。 取MIC浓度抗菌肽LPP1与维生素B2结合肽于37等体积与菌混合 后进行孵育， 每隔30分钟取样涂平板， 于37下培养24h， 。
22、观察并统计活菌数。 以时间为横坐 标,菌落形成单位数(CFUm L1)的对数值(log)为纵坐标,绘制时间杀菌曲线， MIC浓度 抗菌肽LPP1作为空白组。 由结果可知， 维生素B2与抗菌肽联合使用在30min内就能够减少 溶藻弧菌的数量， 1h后可达到杀菌效果。 在维生素B2与抗菌肽LPP1联合作用下， 细菌数量 减少的更快。 表明维生素B2结合抗菌肽LPP1对溶藻弧菌随着作用时间增加有明显的抑制 效果(图5)。 0053 实施例6： 抗菌肽LPP1对细菌细胞内K+泄漏的影响 0054 以溶藻弧菌为例， 将溶藻弧菌菌悬液(菌液浓度为1067CFU/mL)分别与质量浓度 MIC的抗菌肽LPP1。
23、与维生素B2结合肽混合， 37孵育一定时间， 10000r/min离心10min， 对 照组为菌悬液加去离子水， 采用原子吸收光谱仪测定上述上清液中K+质量浓度的变化情 况， 每隔10min记录一次， 共记录7次。 由图6可知， 溶藻弧菌经抗菌肽LPP1与维生素B2结合 肽处理后， 其胞内K+释放量随时间的延长均呈快速增长趋势， 而对照组变化不明显。 说明抗 菌肽LPP1与维生素B2结合能破坏溶藻弧菌细胞膜的完整性。 说明书 4/5 页 6 CN 115724943 A 6 0055 实施例7： 抗菌肽LPP1与维生素B2结合肽与细菌DNA的相互作用 0056 采用DNA凝胶阻滞法研究了抗菌肽。
24、LPP1与维生素B2结合肽与副溶血性弧菌基因 组DNA的相互作用。 将副溶血性弧菌在37的50mL营养肉汤培养基(NB)中培养12h， 用细菌 基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA。 在260和280nm的光密度比(OD260/OD280 1.90)评价提取的基因组DNA的纯度。 接下来， 将10 l DNA(218ng/ L)与维生素B2联合大黄 鱼胶原蛋白肽LPP1在25下混合90min， 将混合物在0.8琼脂糖凝胶上进行电泳。 使用 GelDocXR凝胶成像系统(BioRad， 美国)在紫外线照射下观察凝胶阻滞， 如图7所示。 不同质 量浓度的抗菌肽LPP1与维生素B2结合肽作用于。
25、副溶血性弧菌后， 菌体DNA条带并未发生明 显的迁移现象。 这一结合作用在肽与DNA的比为25/8时， 依然可以阻滞DNA的迁移。 且部分 DNA滞留于上样孔内， 这可能是因为电荷电负性发生改变或DNA双螺旋结构改变， 从而影响 DNA迁移率。 0057 实施例8： 抗菌肽LPP1与维生素B2结合肽细胞毒性实验 0058 本实验以小鼠肺纤维细胞系的L929细胞株作为实验对象， 采用MTS法评估有效抑 菌药物组合的细胞毒性。 先将细胞株接种于高糖DMEM培养基中， 置于37、 5CO2、 饱和湿 度的培养箱中培养24h， 细胞贴壁生长， 继续孵育57d后以0.25胰蛋白酶消化传代。 选取 对数期。
26、的细胞作为实验对象， 并将细胞悬液浓度统一稀释至1.0106CFU/m L备用。 在96孔 酶标板上每孔接入100 L细胞悬液(约105CFU/m L)， 并于5CO2、 饱和湿度的培养箱中培养 24h后加入加入不同浓度的抗菌肽LPP1与维生素B2结合肽至每个孔， 对照组不加任何药 物。 继续培养24h后加入MTS溶液20 L继续培养4h， 于490nm下测定其吸光值(OD值)， 计算细 胞存活率。 0059 综上， 本发明提供了一种全新的抗菌肽LPP1对副溶血性弧菌和溶藻弧菌的最低 抑菌浓度MIC分别为7.8125 g/mL和3.9063 g/mL， 能够抑制副溶血性弧菌、 溶藻弧菌生长。 。
27、本发明抗菌肽LPP1首先吸附在细菌表面， 穿透细胞膜的脂质双分子层， 然后与细菌基因组 DNA相结合， 抑制细菌DNA的合成， 从而导致细菌死亡。 0060 虽然以上描述了本发明的具体实施方式， 但是熟悉本技术领域的技术人员应当理 解， 我们所描述的具体的实施例只是说明性的， 而不是用于对本发明的范围的限定， 熟悉本 领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化， 都应当涵盖在本发明的 权利要求所保护的范围内。 说明书 5/5 页 7 CN 115724943 A 7 图1 说明书附图 1/6 页 8 CN 115724943 A 8 图2 说明书附图 2/6 页 9 CN 115724943 A 9 图3 图4 说明书附图 3/6 页 10 CN 115724943 A 10 图5 图6 说明书附图 4/6 页 11 CN 115724943 A 11 图7 说明书附图 5/6 页 12 CN 115724943 A 12 图8 说明书附图 6/6 页 13 CN 115724943 A 13 。