结直肠癌靶向用药相关热点突变在结直肠癌辅助治疗中的用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010402057.X (22)申请日 2020.05.13 (71)申请人 广州市金圻睿生物科技有限责任公 司 地址 510320 广东省广州市黄埔区(国际生 物岛)螺旋四路9号第四层B401单元、 第五层B501单元、 第六层B601单元 (72)发明人 王庆陈嘉昌胡朝晖柳俊 韩尔康 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理 有限公司 44224 代理人 林青中 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) G01N 33/574(2006.0。

2、1) (54)发明名称 结直肠癌靶向用药相关热点突变在结直肠 癌辅助治疗中的用途 (57)摘要 本发明涉及医学诊断领域， 具体而言， 涉及 一种结直肠癌靶向用药相关热点突变在结直肠 癌辅助治疗中的用途。 所述检测试剂用于检测的 突变位点如下所示： BRAF基因的V600E、 ERBB2基 因的Y772_A775dup、 PIK3CA基因的E545K、 PIK3CA 基因的H1047R、 PTEN基因的L320S。 这些热点突变 可以用于结直肠癌辅助治疗， 能够有效减小检测 和数据分析对工作量， 降低了检测时间和成本。 权利要求书2页 说明书26页 序列表3页 CN 111676285 A 20。

3、20.09.18 CN 111676285 A 1.检测试剂在制备用于结直肠癌的辅助治疗试剂盒中的应用， 所述检测试剂用于检测 突变位点， 所述突变位点如下所示： 2.根据权利要求1所述的应用， 所述突变位点还包括如下位点的至少一种： 3.根据权利要求2所述的应用， 所述突变位点中至少包含DDR2基因的H110D位点。 4.根据权利要求13任一项所述的应用， 所述检测试剂于核酸水平进行检测。 5.根据权利要求4所述的应用， 所述检测试剂用于执行以下任一种方法： 聚合酶链反应、 变性梯度凝胶电泳、 核酸测序法、 核酸分型芯片检测、 变性高效液相色 谱法、 原位杂交、 生物质谱法以及HRM法。 6。

4、.根据权利要求5所述的应用， 所述核酸测序法为高通量测序。 7.根据权利要求6所述的应用， 所述检测试剂包含片段化缓冲液、 片段化酶、 修复缓冲 液、 修复酶、 连接缓冲液、 连接酶、 扩增反应液、 DNA聚合酶、 扩增引物以及接头片段中的至少 一种。 权利要求书 1/2 页 2 CN 111676285 A 2 8.根据权利要求7所述的应用， 所述接头片段选自至少一个来自SEQ ID NO： 1SEQ ID NO： 12中的序列表示的多核苷酸组成的接头。 9.根据权利要求13任一项所述的应用， 所述检测试剂于蛋白水平进行检测。 10.根据权利要求9所述的应用， 所述检测试剂用于执行以下任一种。

5、方法： 生物质谱法、 氨基酸测序法、 电泳法以及用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检 测。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111676285 A 3 结直肠癌靶向用药相关热点突变在结直肠癌辅助治疗中的 用途 技术领域 0001 本发明涉及医学诊断领域， 具体而言， 涉及一种结直肠癌靶向用药相关热点突变 在结直肠癌辅助治疗中的用途。 背景技术 0002 结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤， 在我国， 结直肠癌的发病率位于第三位， 死亡 率位居第四位， 发病率和死亡率仍呈逐年上升的趋势。 结直肠癌的发病率和死亡率在经济 发达的地区高于欠发达的地区， 男女发病的分布趋势是男性高于女性。 随着年龄的。

6、增长， 结 直肠癌发病和死亡的风险极大的增加。 作为全球年新发病例数最多的国家， 积极开展结直 肠癌个体化治疗有重大的意义。 目前使用靶向药物是治疗中、 晚期结直肠癌的主要手段， 也 是患者术前、 术后辅助治疗的重要方法。 通过合理的靶向用药， 用于患者的早期的辅助治 疗， 晚期的预后预测、 疗效评估， 以及治疗后的转移复发监测。 0003 明确结直肠癌的分子分型， 有利于合理使用靶向用药， 对个体化治疗有指导意义。 然而结直肠癌的发病与诸多基因突变位点相关， 现有技术并没有系统的公开与结直肠癌靶 向用药相关基因热点突变位点， 因而会导致诊断无法做到有的放矢， 浪费检测资源和分析 数据的资源，。

7、 检测效率低下， 且结论也不够准确。 发明内容 0004 本发明涉及检测试剂在制备用于结直肠癌的辅助治疗试剂盒中的应用， 所述检测 试剂用于检测突变位点， 所述突变位点如下所示： 0005 0006 本发明的有益效果为： 0007 本发明提供了与结直肠癌靶向用药相关的比例靠前的热点突变， 因而可以有目的 性的对这些位点进行检测， 可以更好地用于辅助治疗， 有效减小检测和数据分析的工作量， 降低了检测时间和成本。 具体实施方式 0008 现将详细地提供本发明实施方式的参考， 其一个或多个实例描述于下文。 提供每 一实例作为解释而非限制本发明。 实际上， 对本领域技术人员而言， 显而易见的是， 可。

8、以对 本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。 例如， 作为一个实施方式的部 说明书 1/26 页 4 CN 111676285 A 4 分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中， 来产生更进一步的实施方式。 0009 因此， 旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变 化。 本发明的其它对象、 特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。 本领域普 通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述， 而非意在限制本发明更广阔的方 面。 0010 本发明涉及检测试剂在制备用于结直肠癌的辅助治疗试剂盒中的应用， 所述检测 试剂用于检测突变位点， 所述突变位。

9、点如下所示： 0011 0012 上述突变位点为与结直肠癌靶向用药相关的比例靠前的热点突变， 它们可以用于 结直肠癌的辅助治疗。 0013 辅助治疗可以包含多方面的内容， 例如用药指导(包括疗效评估)和预后预测等。 “用药指导” 在本发明中可以指本领域技术人员可根据本发明所提供的突变位点判断和调 整结直肠癌的药物种类， 并确定给药方式(给药量、 给药间隔等)。 在本发明所公开内容的基 础上， 本领域人员可以不付出创造性地获知这些突变位点与结直肠癌密切相关。 0014 在一些实施方式中， 所述突变位点还包括如下位点的至少一种： 说明书 2/26 页 5 CN 111676285 A 5 0015。

10、 0016 其中， Q149*和R335*等位点中的*号代表变为终止密码子。 0017 在一些实施方式中， 所述突变位点中至少包含DDR2基因的H110D位点。 0018 DDR2基因H110D位点， 在COSMIC数据库中并未收录， 属于新发现的结直肠癌靶向用 药相关基因热点突变。 0019 上述27个突变位点覆盖了结直肠癌靶向用药的常见相关基因。 0020 结肠癌和直肠癌统称为结直肠癌。 两者有许多相似的特征， 因此在本发明中将其 统一作为一种癌症类型讨论。 0021 针对结直肠癌的靶向用药， KRAS、 NRAS、 BRAF基因野生型， 用于西妥昔单抗注射液 的伴随诊断检测。 RAS基因。

11、家族(KRAS和NRAS)野生型是进行西妥昔单抗初始治疗的先决条 件。 靶向用药西妥昔单抗用于治疗RAS基因野生型的转移性结直肠癌。 西妥昔单抗联合 FOLFOX(奥沙利铂+亚叶酸钙+5-氟尿嘧啶5-FU)或FOLFIRI(伊立替康+亚叶酸钙+5-FU)一 线治疗RAS野生型转移性结直肠癌(mCRC)患者、 或联合伊立替康用于对伊立替康化疗无效 的患者。 0022 帕尼单抗适用于RAS基因家族(KRAS和NRAS)野生型的转移性结直肠癌患者。 能与 正常细胞及肿瘤细胞中的EGFR基因特异连接， 竞争性抑制EGFR配体的连接。 与EGFR连接能 阻止配体诱导的受体自身磷酸化以及激活受体相关的激酶。

12、， 诱发细胞凋亡， 减少促炎性细 胞因子及血管生长因子的产物。 能选择性抑制EGFR表达的结直肠癌细胞的生长和存活。 0023 曲氟尿苷和胸苷磷酸化酶抑制剂的联合用药， 对KRAS野生型结直肠癌表现出抗肿 说明书 3/26 页 6 CN 111676285 A 6 瘤活性。 胸苷磷酸化酶抑制剂通过抑制胸苷磷酸化酶， 增加癌细胞与曲氟尿苷的接触， 而曲 氟尿苷则能渗入癌细胞DNA中， 干扰其DNA合成和抑制细胞增殖。 0024 KRAS基因定位于染色体12p12.1， 在结直肠癌中突变率约为3640。 KRAS基因 参与细胞内的信号传递， 在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中， 起着。

13、重 要调控作用。 正常的KRAS基因， 可抑制肿瘤细胞生长。 KRAS基因发生突变， 被酪氨酸激酶持 续活化， 激活下游控制细胞生成的PI3K-AKT-mTOR信号通路， 以及控制细胞增殖的RAS-RAF- MEK-ERK信号通路， 导致细胞持续增殖， 最终发生癌变。 KRAS基因野生型的结直肠癌患者， 建 议使用EGFR靶向药物进行个体化治疗。 0025 NRAS基因定位于染色体1p13.2， 在结直肠癌中突变率约为16， 是常见的致 癌基因。 NRAS基因改变主要为点突变和基因扩增， 点突变以第11、 12、 13、 59、 61密码子多见， NRAS突变多发生在以第61号密码子。 这些密。

14、码子编码的氨基酸是Ras蛋白和GTP酶活化蛋白 (GAP)的作用位点。 机制为该基因的突变导致其下游基因的如Raf激酶的异常持续激活。 突 变导致Ras-GTP处于持续激活状态， 引起细胞恶性增殖和转移。 在细胞的讯息传递路径上， Ras主要为活化控制基因转录的激酶， 从而调节细胞的增生与分化。 利用对NRAS基因是否存 在体细胞突变进行检测， 可用于辅助临床医生筛选出受益于EGFR抗体等药物的结直肠癌患 者， 适合于患者在进入个体化靶向治疗疗程之前使用， 可为患者个体用药提供用药科学依 据， 降低治疗风险以及患者负担。 0026 BRAF基因定位于染色体7q34， 在结直肠癌中突变率约为81。

15、5， 为体细胞错义 突变， 90以上的突变发生在第15号外显子， 为V600E突变。 该突变导致下游MEK/ERK信号通 路持续激活， 对肿瘤的生长增殖和侵袭转移至关重要。 对BRAF基因突变的检测， 可以为结直 肠癌患者的个体化治疗提供更确切的依据。 功能上从N端到C端分为RAS结合区、 富半胱氨酸 区(Cys)、 甘氨酸环(G-loop)和激活区。 该基因编码蛋白属于raf/mil家族的丝氨酸/苏氨酸 蛋白激酶， 在细胞分裂、 分化和分泌起重要作用。 0027 DDR2基因定位于染色体1q23.3。 基因编码的蛋白质是含有盘状结构域的受体酪氨 酸激酶(RTK)。 RTK在细胞与微环境的交流。

16、中起着关键作用。 这些分子参与细胞生长， 分化和 代谢的调节。 在一些情况下， RTK通过膜转导信号的生化机制已显示为配体诱导的受体寡聚 化和随后的细胞内磷酸化。 在DDR2的情况下， 配体是与其胞外盘状结构域结合的胶原。 这种 自身磷酸化导致细胞溶质靶标的磷酸化以及与其他分子的结合， 其涉及信号转导的多效 性。 DDR2与结直肠癌的发生有关。 0028 ERBB2基因定位于染色体17q12， 编码的蛋白属于表皮生长因子受体家族， 也属于 受体酪氨酸激酶家族。 ERBB2没有与配体结合的结构域， 但可以与家族成员形成异源二聚体 来结合配体如表皮生长因子(EGF)， 从而通过磷酸化激活下游蛋白如。

17、MAPK和PI3K。 ERBB2高 表达肿瘤细胞中Ras-MAPK和PI3K-Akt信号传导活性较高， 细胞增殖能力较强， 分化成熟和 凋亡机制受到抑制， 细胞恶性程度高。 ERBB2高表达肿瘤细胞可抵抗TNF- 、 射线以及各种化 疗药物引起的细胞凋亡效应。 临床上ERBB2表达与患者预后密切相关， ERBB2高表达的患者 易发生结直肠癌转移， 存活期短。 0029 PIK3CA基因定位于染色体3q26.32， 在结直肠癌中突变率约为1030。 PIK3CA 基因突变主要集中在其第10和第21号外显子的特异性位点上， 分别对应着该酶的螺旋区和 激酶区。 PIK3CA基因是一种原癌基因， 位于。

18、EGFR下游， 是PI3K/AKT信号通路重要的核心分子 说明书 4/26 页 7 CN 111676285 A 7 之一。 PIK3CA基因编码PI3K IA类中的催化亚基p110a， PIK3CA基因突变导致p110a酶活性增 强、 激活AKT信号通路、 减少细胞对生长因子的依赖、 抑制细胞的凋亡和促进肿瘤的侵袭， 在 结直肠细胞癌变过程中具有不可忽视的重要性。 PI3K-PTEN-AKT信号通路调节细胞的增殖、 分化、 存活和迁移等功能。 近年来发现， 这条通路的活性异常不仅能导致细胞恶性转化， 还 与肿瘤细胞的侵袭转移行为相关。 0030 PTEN基因定位于染色体10q23.31， 在。

19、结直肠癌中突变率约为514， 具有磷酸 酯酶的活性。 PTEN基因编码的蛋白具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶活性， 是第一个具有磷酸 酶活性的抑癌基因， 也是是继p53和Rb基因之后， 与肿瘤发生密切相关的一种抑癌基因， 其 主要机制因为PTEN是PI3K/Akt通路的主要负调控因子。 PTEN的功能缺陷导致结直肠癌的发 生。 PTEN蛋白可通过拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制肿瘤的发生发展。 将野生型 PTEN基因转染到该基因异常的胶质母细胞瘤后， 肿瘤细胞的生长、 侵袭能力受到明显抑制， 发现其对肿瘤细胞的酪氨酸激酶FAK的活性有明显的抑制作用。 此外， PTEN蛋白还可通过特 异性地使IP。

20、3的第三位磷酸去磷酸化而间接地抑制胰岛素诱导的磷酸肌醇-3激酶的活性， 而IP3是胰岛素调节细胞生长信号通路中的重要的第二信使， 可见PTEN蛋白在细胞生长信 号通路中起作用。 0031 SMAD4基因定位于染色体18q21.2， 在结直肠癌中突变率约为1035。 SMAD4基 因编码的蛋白属于SMAD家族， 可被跨膜丝氨酸/苏氨酸受体(转化生长因子TGF- 受体)激酶 激活， 作为TGF- 信号的重要胞浆内信号级联分子， SMAD4可以自身形成同源复合物或与激 活型其他的SMAD家族成员形成异源复合物， 转移到细胞核内， 与其他转录因子协同作用， 调 节TGF- 应答基因的转录。 SMAD4。

21、突变， 导致功能失活或表达低下， 影响TGF- 的信号转导， 参 与结直肠癌的形成。 0032 在一些实施方式中， 上述突变位点用于结直肠癌的诊断或辅助诊断。 0033 在一些实施方式中， 所述检测试剂于核酸水平进行检测。 0034 核酸水平(DNA或RNA水平)的检测试剂可选用本领域技术人员所公知的试剂， 例如 能够与该DNA或RNA杂交， 且标记有荧光标记的核酸(通常为探针或引物)等。 并且本领域技 术人员也容易想到将mRNA反转录成cDNA后对cDNA进行检测， 这些技术手段的常规置换不超 出本发明的保护范围。 0035 在一些实施方式中， 所述检测试剂用于执行以下任一种方法： 0036。

22、 聚合酶链反应、 变性梯度凝胶电泳、 核酸测序法、 核酸分型芯片检测、 变性高效液 相色谱法、 原位杂交、 生物质谱法以及HRM法。 0037 在一些实施方式中， 所述聚合酶链反应选自限制性片段长度多态性法、 单链构象 多态性法、 Taqman探针法、 竞争性等位基因特异性PCR和等位基因特异性PCR。 0038 在一些实施方式中， 所述生物质谱法选自飞行质谱仪检测。 0039 在一些实施方式中， 所述核酸测序法选自Snapshot法。 0040 在本发明的一些实施方式中， 所述核酸测序法可以为转录组测序或基因组测序。 在本发明另外一些实施方案中， 所述核酸测序法是高通量测序， 也称作二代测序。

23、( “NGS” )。 二代测序在并行的测序过程中同时产生数千至数百万条序列。 NGS区别于 “Sanger测序” (一 代测序)， 后者是基于单个测序反应中的链终止产物的电泳分离。 可用于本发明的NGS的测 序平台可以是商用可得的， 包括但不限于Illumina MiniSeq、 NextSeq 550等。 说明书 5/26 页 8 CN 111676285 A 8 0041 在一些实施方式中， 所述检测试剂包含片段化缓冲液、 片段化酶、 修复缓冲液、 修 复酶、 连接缓冲液、 连接酶、 扩增反应液、 DNA聚合酶、 扩增引物以及接头片段中的至少一种。 0042 在一些实施方式中， 所述接头片。

24、段选自至少一个来自SEQ ID NO： 1SEQ ID NO： 12中的序列表示的多核苷酸组成的接头。 0043 在一些实施方式中， 所述检测试剂于蛋白水平进行检测。 0044 在一些实施方式中， 所述检测试剂用于执行以下任一种方法： 0045 生物质谱法、 氨基酸测序法、 电泳法以及用特异性针对突变位点所设计的抗体进 行检测。 0046 用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测的方法进一步可以为免疫沉淀、 免 疫共沉淀、 免疫组化、 ELISA以及Western Blot等。 0047 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。 0048 实施例 0049 本实施例采用高通量测序筛选结。

25、直肠癌相关的热点突变， 高通量测序检测结直肠 癌文库构建的方法， 包括以下步骤： 0050 (一)DNA片段化： 通过酶切的方法把DNA打断为200bp左右的片段； 0051 (二)末端修复： 使用末端修复酶终止打断反应， 并将DNA片段末端补平， 得到平末 端的DNA片段； 0052 (三)接头连接： 将平末端的DNA片段与不同的特异性接头进行连接， 得到加上不同 接头的DNA片段； 0053 (四)接头连接产物的纯化： 用磁珠纯化接头连接产物， 除去未接上或自连的接头， 得到纯化后加接头的DNA片段； 0054 (五)PCR扩增： 将纯化后加接头的DNA片段进行扩增； 0055 (六)PC。

26、R扩增产物的纯化： 用磁珠纯化PCR扩增产物， 除去小片段和引物二聚体， 得 到最终的文库； 后续可用于测序。 0056 第一步骤的反应体系 0057 表1第一步骤的反应体系 0058 组分体积( L) 片段化缓冲液5 片段化酶10 稀释DNA35 反应体系总体积50 0059 第一步骤的反应条件 0060 表2第一步骤的反应条件 0061 0062 第二步骤的反应体系 0063 表3第二步骤的反应体系 说明书 6/26 页 9 CN 111676285 A 9 0064 组分体积( L) 修复缓冲液7 修复酶3 DNA片段化产物50 反应体系总体积60 0065 第二步骤的反应条件 0066。

27、 表4第二步骤的反应条件 0067 第三步骤的反应体系 0068 表5第三步骤的反应体系 0069 组分体积( L) 连接缓冲液30 连接酶10 无核酸酶水7.5 接头2.5 末端修复产物60 反应体系总体积110 L 0070 第三步骤合成的接头序列 0071 表6第三步骤合成的接头序列 说明书 7/26 页 10 CN 111676285 A 10 0072 0073 第三步骤的反应条件 0074 表7第三步骤的反应条件 0075 0076 第五步骤的反应体系 0077 表8第五步骤的反应体系 0078 组分体积( L) 扩增反应液25 扩增引物5 接头纯化产物20 反应体系总体积50 0。

28、079 第五步骤的反应条件 0080 表9第五步骤的反应条件 说明书 8/26 页 11 CN 111676285 A 11 0081 0082 高通量测序检测结直肠癌的文库构建试剂组成成分包括： 片段化缓冲液、 片段化 酶、 修复缓冲液、 修复酶、 连接缓冲液、 连接酶、 扩增反应液、 DNA聚合酶、 扩增引物以及接头 片段。 0083 一.实验设计和样本选择 0084 为了评估高通量测序检测结直肠癌的文库构建试剂的性能， 筛选结直肠癌靶向用 药相关基因热点突变。 选取的样本说明： 以下实施例所用的151例样本， 使用相同批次的试 剂， 考察结直肠癌文库构建试剂盒对不同突变类型的适用性， 筛。

29、选结直肠癌靶向用药相关 基因热点突变。 分别编号为样本C1-C151。 0085 二.实验方法 0086 (一)DNA片段化 0087 1.稀释DNA 0088 1.1.若提取的洗脱液不含EDTA， 使用无核酸酶水稀释DNA， 取35 L 30100ng DNA 至新的八联管或0.2mL PCR管中， 置于冰盒上备用。 0089 1.2.若提取的洗脱液含EDTA， 使用无核酸酶水稀释DNA， 取30 L 30100ng DNA至 新的八联管或0.2mL PCR管中， 置于冰盒上备用。 再按比例稀释测序用文库制备试剂盒中的 调节缓冲液至3.1调节缓冲液， 将3.1 L调节缓冲液加入96.9 L无。

30、核酸酶水中配成100 L3.1调节缓冲液。 依次吸取5 L 3.1调节缓冲液至上述八联管或0.2mL PCR管中， 置于 冰盒上备用。 0090 2.将溶解的片段化缓冲液振荡离心， 片段化酶瞬时离心， 置于冰盒上备用。 0091 3.按照每个样本需要5 L片段化缓冲液、 10 L片段化酶的比例配制反应体系的混 合液。 0092 4.在冰盒上进行操作， 往每个已加入稀释DNA的八联管或0.2mL PCR管中加入15 L 上述混合液， 振荡混匀， 瞬时离心。 0093 表10 DNA片段化反应体系 0094 0095 提前4预冷PCR仪， 将上述八联管或0.2mL PCR管置于PCR仪中， 按下表。

31、条件设置 反应程序： 说明书 9/26 页 12 CN 111676285 A 12 0096 表11 DNA片段化反应条件 0097 0098 (二)末端修复 0099 1.将溶解的修复缓冲液振荡离心， 修复酶瞬时离心， 置于冰盒上备用。 0100 2.按照每个样本需要7 L修复缓冲液、 3 L修复酶的比例配制反应体系的混合液。 0101 3.在冰盒上进行操作， 往上述已有DNA片段化产物的八联管或0.2mL PCR管中加入 10 L上述混合液， 振荡混匀， 瞬时离心。 0102 表12末端修复反应体系 0103 组分体积( L) 修复缓冲液7 修复酶3 DNA片段化产物50 反应体系总体积。

32、60 0104 4.将上述八联管或0.2mL PCR管置于PCR仪中， 按下表条件设置反应程序： 0105 表13末端修复反应条件 0106 0107 (三)接头连接 0108 1.将溶解的连接缓冲液、 接头振荡离心， 连接酶瞬时离心， 置于冰盒上备用。 0109 2.按照每个样本需要30 L连接缓冲液、 10 L连接酶、 7.5 L无核酸酶水的比例配制 反应体系的混合液。 0110 3.在冰盒上进行操作， 往上述已有末端修复产物的八联管或0.2mL PCR管中依次 加入2.5 L对应的接头， 再加入47.5 L上述混合液， 振荡混匀瞬时离心。 0111 表14接头连接反应体系 0112 组分。

33、体积( L) 连接缓冲液30 连接酶10 无核酸酶水7.5 接头2.5 末端修复产物60 反应体系总体积110 L 0113 4.将上述八联管或0.2mL PCR管置于PCR仪中， 按下表条件设置反应程序： 0114 表15接头连接反应条件 说明书 10/26 页 13 CN 111676285 A 13 0115 0116 (四)接头连接产物的纯化 0117 1.将纯化磁珠室温平衡30分钟， 振荡混匀。 0118 2.振荡混匀纯化磁珠， 取88 L纯化磁珠至新的八联管或1.5mL低吸附离心管或96 浅孔板中。 0119 3.将待纯化的DNA转移至上述八联管或1.5mL低吸附离心管或96浅孔板。

34、中， 振荡， 室温静置5分钟， 瞬时离心后置于磁力架上5分钟， 弃上清。 0120 4.往上述八联管中加入100 L 80乙醇； 1.5mL低吸附离心管或96浅孔板中加入 200 L80乙醇， 须完全盖过磁珠， 八联管通过换位4次； 1.5mL低吸附离心管通过将低吸附 离心管旋转2圈， 每半圈静置10秒； 96浅孔板则在磁珠团方向另一面吹打67次， 弃上清。 0121 5.重复步骤4一次。 0122 6.将上述八联管或1.5mL低吸附离心管从磁力架取下， 瞬时离心后再次置于磁力 架上， 用10 L移液器吸弃全部废液(96浅孔板无需离心) 0123 7.打开上述八联管或1.5mL低吸附离心管盖，。

35、 室温晾干5分钟； 96浅孔板直接室温 晾干5分钟。 0124 注意事项： 至磁珠表面没有反光水膜即可， 避免磁珠过度干燥而开裂。 0125 8.将上述八联管或1.5mL低吸附离心管或96浅孔板从磁力架上取下， 加入22 L无 核酸酶水， 振荡重悬磁珠， 室温静置5分钟， 瞬时离心。 0126 9.将上述八联管或1.5mL低吸附离心管或96浅孔板置于磁力架上5分钟， 吸取20 L 上清到新的八联管或0.2mL PCR管中， 即为接头纯化产物。 0127 (五)PCR扩增 0128 1.将溶解的扩增反应液和扩增引物振荡瞬时离心， 置于冰盒上备用。 0129 2.按照每个样本需要25 L扩增反应液。

36、、 5 L扩增引物的比例配制反应体系的混合 液。 0130 3.向上述含有接头纯化产物的八联管或0.2mL PCR管中加入30 L上述混合液， 振 荡混匀瞬时离心。 0131 表16 PCR扩增反应体系 0132 组分体积( L) 扩增反应液25 扩增引物5 接头纯化产物20 反应体系总体积50 0133 4.将上述八联管或0.2mL PCR管置于PCR仪中， 按下表条件设置反应程序： 0134 表17 PCR扩增反应条件 说明书 11/26 页 14 CN 111676285 A 14 0135 0136 (六)PCR扩增产物纯化 0137 1.将纯化磁珠室温平衡30分钟， 振荡混匀。 01。

37、38 2.振荡混匀纯化磁珠， 取50 L纯化磁珠至新的八联管或1.5mL低吸附离心管或96 浅孔板中。 0139 3.将待纯化的DNA转移至上述八联管或1.5mL低吸附离心管或96浅孔板中， 振荡， 室温静置5分钟， 瞬时离心后置于磁力架上5分钟， 弃上清。 0140 4.往上述八联管中加入100 L 80乙醇； 1.5mL低吸附离心管或96浅孔板中加入 200 L80乙醇， 须完全盖过磁珠， 八联管通过换位4次； 1.5mL低吸附离心管通过将低吸附 离心管旋转2圈， 每半圈静置10秒； 96浅孔板则在磁珠团方向另一面吹打67次， 弃上清。 0141 5.重复步骤4一次。 0142 6.将上述。

38、八联管或1.5mL低吸附离心管从磁力架取下， 瞬时离心后再次置于磁力 架上， 用10 L移液器吸弃全部废液(96浅孔板无需离心)。 0143 7.打开上述八联管或1.5mL低吸附离心管盖， 室温晾干5分钟； 96浅孔板直接室温 晾干5分钟。 0144 注意事项： 至磁珠表面没有反光水膜即可， 避免磁珠过度干燥而开裂。 0145 8.将上述八联管或1.5mL低吸附离心管或96浅孔板从磁力架上取下， 加入27 L无 核酸酶水， 振荡重悬磁珠， 室温静置5分钟， 瞬时离心。 0146 9.将上述八联管或1.5mL低吸附离心管或96浅孔板置于磁力架上5分钟， 吸取25 L 上清到新的1.5mL PCR。

39、管中， 即为构建好的文库。 使用dsDNA HS Assay Kit检测浓 度， 建议大于1ng/ L； 文库于-25-15保存， 此条件下可保存12个月。 0147 三.实验结果 0148 表18高通量测序实验结果 说明书 12/26 页 15 CN 111676285 A 15 0149 说明书 13/26 页 16 CN 111676285 A 16 0150 说明书 14/26 页 17 CN 111676285 A 17 0151 说明书 15/26 页 18 CN 111676285 A 18 0152 说明书 16/26 页 19 CN 111676285 A 19 0153 说。

40、明书 17/26 页 20 CN 111676285 A 20 0154 说明书 18/26 页 21 CN 111676285 A 21 0155 说明书 19/26 页 22 CN 111676285 A 22 0156 说明书 20/26 页 23 CN 111676285 A 23 0157 0158 注： 表中突变频率一栏的-代表无变异频率。 0159 四.结果分析 0160 1.年龄分布分析 0161 在153例样本中， 结直肠癌患者的年龄分布主要集中在5160岁的区段中。 0162 表19样本年龄分布表 0163 0164 2.性别比例分析 0165 在153例样本中， 男性样本。

41、80例， 占比52.29， 女性样本73例， 占比47.71。 0166 3.阳性率分析 0167 表20结直肠癌靶向用药基因(仅含双突变其中一个基因)例数分析(已去重) 0168 说明书 21/26 页 24 CN 111676285 A 24 0169 在153例样本中， 阳性样本为79例， 阳性率为51.63。 阴性样本， 即BRAF， DDR2， ERBB2， KRAS， NRAS， PIK3CA， PTEN， SMAD4基因野生型为74例。 0170 4.突变位点例数分析 0171 结直肠癌靶向用药基因(含双突变基因)样本为86例， 其中单突变位点为71例， 双 突变位点为15例。 。

42、0172 表21结直肠癌靶向用药基因(含双突变基因)例数分析(未去重) 0173 0174 (1)BRAF基因突变位点例数分析 0175 BRAF基因突变阳性样本例数为17例， 其中V600E位点突变为17例， 含单突变位点 (V600E)为14例， 双突变位点为3例。 双突变样本见表22。 0176 表22 BRAF基因双突变样本例数分析表 0177 0178 (2)KRAS基因突变位点例数分析 0179 KRAS基因突变阳性样本例数为11例， 含单突变位点(G12D、 G12C、 G12A)为6例， 双突 变位点为5例。 其中单突变位点包括G12D位点突变为3例、 G12C位点突变为2例、。

43、 G12A位点突 变为1例。 双突变样本见表23。 0180 表23 KRAS基因双突变样本例数分析表 0181 说明书 22/26 页 25 CN 111676285 A 25 0182 (3)PIK3CA基因突变位点例数分析 0183 PIK3CA基因突变阳性样本例数为16例， 含单突变位点(E545K、 H1047R、 H1047L)为 12例， 双突变位点为4例。 其中单突变位点包括E545K位点突变为5例、 H1047R位点突变为5 例、 H1047L位点突变为2例。 双突变样本见表24。 0184 表24 PIK3CA基因双突变样本例数分析表 0185 序号双突变基因双突变位点样本。

44、例数(例)备注 1BRAF,PIK3CAV600E,E542K1与BRAF基因双突变 2KRAS,PIK3CAG12D,E545K1与KRAS基因双突变 3KRAS,PIK3CAG12V,H1047L1与KRAS基因双突变 4KRAS,PIK3CAG13D,H1047R1与KRAS基因双突变 0186 (4)PTEN基因突变位点例数分析 0187 PTEN基因突变阳性样本例数为10例， 含单突变位点(L320S、 E242K、 R335*)为8例， 双突变位点为2例。 其中单突变位点包括L320S位点突变为5例、 E242K位点突变为2例、 R335* 位点突变为1例。 双突变样本见表25。 。

45、0188 表25 PTEN基因双突变样本例数分析表 0189 序号双突变基因双突变位点样本例数(例)备注 1BRAF,PTENV600E,Q149*1与BRAF基因双突变 2KRAS,PTENG12D,M264I1与KRAS基因双突变 0190 (5)DDR2、 ERBB2、 NRAS、 SMAD4基因突变位点例数分析 0191 DDR2基因突变阳性样本例数为3例， 其中H110D位点突变为3例。 0192 ERBB2基因突变阳性样本例数为19例， 其中Y772_A775dup位点突变为12例、 V842I 位点突变为3例、 G778_P780dup位点突变为2例、 R784H位点突变为2例。。

46、 0193 NRAS基因突变阳性样本例数为9例， 其中Q61K位点突变为3例、 Q61L位点突变为2 例、 E31K位点突变为2例、 G12V位点突变为2例。 0194 SMAD4基因突变阳性样本例数为1例， 为BRAF， SMAD4双基因的V600E， R361H双位点 突变。 0195 (6)单位点突变例数分析 0196 表26结直肠癌靶向用药相关基因单位点突变例数分析 说明书 23/26 页 26 CN 111676285 A 26 0197 0198 (7)双位点突变例数分析 0199 表27结直肠癌靶向用药相关基因双位点突变例数分析 0200 0201 5.检测范围的基因和突变位点 。

47、0202 表28检测范围的基因和突变位点 说明书 24/26 页 27 CN 111676285 A 27 0203 0204 6.热点突变位点比例分析 0205 表29结直肠癌靶向用药相关基因热点突变位点比例分析 0206 序号基因突变位点例数(例)比例 1BRAFV600E1417.72 2ERBB2Y772_A775dup1215.19 3PIK3CAE545K56.33 4PIK3CAH1047R56.33 5PTENL320S56.33 6DDR2H110D33.80 7ERBB2V842I33.80 8KRASG12D33.80 9NRASQ61K33.80 10ERBB2G778。

48、_P780dup22.53 11ERBB2R784H22.53 12KRASG12C22.53 13NRASE31K22.53 14NRASG12V22.53 说明书 25/26 页 28 CN 111676285 A 28 15NRASQ61L22.53 16PIK3CAH1047L22.53 17PTENE242K22.53 18BRAF,PIK3CAV600E,E542K11.27 19BRAF,PTENV600E,Q149*11.27 20BRAF,SMAD4V600E,R361H11.27 21KRASG12A11.27 22KRASG13D,G12C11.27 23KRAS,PIK。

49、3CAG12D,E545K11.27 24KRAS,PIK3CAG12V,H1047L11.27 25KRAS,PIK3CAG13D,H1047R11.27 26KRAS,PTENG12D,M264I11.27 27PTENR335*11.27 0207 五.实验结论 0208 通过153例临床样本的验证， 碱基识别质量百分比(Q30)均大于80， 有效测序深 度平均值均大于500， 总比对碱基数的比例均大于90， 质控标准均合格。 0209 采用临床样本进行验证， 符合率100。 验证了高通量测序检测结直肠癌的文库构 建试剂盒有较好的准确性和特异性。 0210 对于结直肠癌患者的年龄分布主要。

50、集中在5160岁的区段中， 性别比例分析， 结 直肠癌患者男性略高于女性。 在153例样本中， 阳性样本为79例， 阳性率为51.63。 结直肠 癌靶向用药基因(含双突变基因)样本为86例， 其中单突变位点为71例， 双突变位点为15例。 试剂盒检测范围为25个位点。 0211 筛选出27个结直肠癌靶向用药相关基因热点突变， 其中包括19个单突变和8个双 突变。 结直肠癌靶向用药相关基因热点突变位点比例前5位分别为： BRAF基因V600E位点、 ERBB2基因Y772_A775dup位点、 PIK3CA基因E545K位点和H1047R位点、 PTEN基因L320S位点。 0212 以上所述实。