双锁型聚合物及其制备方法和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010861678.4 (22)申请日 2020.08.25 (71)申请人 华南理工大学 地址 510641 广东省广州市天河区五山路 381号 (72)发明人 袁友永郑锐宗庆瑜肖炫 姜茂麟 (74)专利代理机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 44205 代理人 齐键 (51)Int.Cl. C08G 65/333(2006.01) C08G 65/334(2006.01) C08G 65/332(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 4。

2、9/00(2006.01) A61K 47/69(2017.01) A61K 47/60(2017.01) A61K 41/00(2020.01) (54)发明名称 一种双锁型聚合物及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种双锁型聚合物及其制备 方法和应用。 本发明的双锁型聚合物的结构式 为：式中， x 为110117的自然数， y为7080的自然数， z为1 3的自然数。 本发明的双锁型聚合物具有良好 的生物相容性和可降解性， 由其自组装形成的纳 米颗粒可以用于肿瘤成像与治疗。 权利要求书3页 说明书10页 附图12页 CN 111995745 A 2020.11.27 CN 111。

3、995745 A 1.一种双锁型聚合物， 其特征在于， 结构式为： 式中， x为110117的自然 数， y为7080的自然数， z为13的自然数。 2.权利要求1所述的双锁型聚合物的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)进行二异丙基乙醇胺和甲基丙烯酰氯的反应， 得到2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙 酯； 2)进行甲氧基聚乙二醇和4-氰基-4-(硫代苯甲硫基)戊酸的酯化反应， 得到 即PEG-CPDB； 3)进行PEG-CPDB、 2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸的聚合反应， 得到 即PEG-b-(PDPA-co-MAA)； 4)进行和L-瓜氨酸的反应， 得到 即Fmoc。

4、-Val-Cit； 5)进行和Fmoc-Val-Cit的反应， 得到 即Fmoc-Val-Cit-NH-Cy； 权利要求书 1/3 页 2 CN 111995745 A 2 6)Fmoc-Val-Cit-NH-Cy转化成 7) 进行PEG-b- (PDPA-co-MAA) 和的反应 ， 得到 3.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于： 步骤1)所述二异丙基乙醇胺、 甲基丙 烯酰氯的摩尔比为1： (1.01.2)。 4.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于： 步骤2)所述甲氧基聚乙二醇、 4-氰基- 4-(硫代苯甲硫基)戊酸的摩尔比为1： (45)。 5.根据权利要求2所述的制备方法。

5、， 其特征在于： 步骤3)所述PEG-CPDB、 2-(二异丙基氨 基)甲基丙烯酸乙酯、 甲基丙烯酸的摩尔比为1： (8090)： (34)。 6.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于： 步骤4)所述L- 瓜氨酸的摩尔比为1： (1.61.8)。 权利要求书 2/3 页 3 CN 111995745 A 3 7.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于： 步骤5)所述Fmoc- Val-Cit的摩尔比为1： (2.53.0)。 8.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于： 步骤7)所述PEG-b-(PDPA-co-MAA)、 的摩尔比为1： (13)。 9.权利要求1所述的双锁型聚。

6、合物用于制备抗肿瘤药物的应用。 权利要求书 3/3 页 4 CN 111995745 A 4 一种双锁型聚合物及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及聚合物荧光探针技术领域， 具体涉及一种双锁型聚合物及其制备方法 和应用。 背景技术 0002 光学成像是以发光探针的发光强度为检测信号的可视化成像技术， 主要包括生物 发光技术和荧光技术， 已经广泛应用于癌症的早期、 准确诊断。 激活型荧光探针可以对肿瘤 微环境发出响应信号， 具有较低的背景噪声和较高的信号-背景比， 能对肿瘤进行灵敏、 准 确的诊断， 效果要显著优于 “常开” 光学探针。 0003 近年来， 随着前体药物和纳米技术在药。

7、物传递领域的广泛应用， 极大地丰富了抗 肿瘤药物的传递策略， 而基于小分子前药的自组装纳米递送系统结合了前体药物策略和纳 米技术的优点， 载药量高、 稳定性好、 毒副作用小， 成为了研究的热点。 无论是前药还是纳米 给药系统， 智能地触发药物在靶点的选择性释放对制剂的有效性和安全性都非常重要。 与 正常细胞相比， 肿瘤细胞特殊的微环境已被广泛应用于设计刺激反应药物传递系统。 0004 目前， 大多数用于癌症成像和治疗的纳米材料都可能对健康组织造成非特异性背 景和毒性， 并引起严重的副作用。 为了提高特异性， 许多对癌症特异性生物标志物(如低pH 值、 过表达酶或谷胱甘肽)有反应的刺激反应纳米材。

8、料已经被开发用于癌症成像和治疗， 但 大多数刺激反应型纳米材料仅对单一刺激产生反应， 可能并不足以区分肿瘤组织， 并会导 致成像的高背景信号和治疗的副作用。 为了改善位点的特异性转运和降低非靶标细胞的毒 性， 开发能够对多种癌症相关生物标志物共存做出反应的智能纳米材料是非常可取的。 然 而， 开发能够同时对正交刺激做出反应， 并具有集成的成像和治疗功能的纳米探针仍是一 项挑战。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种双锁型聚合物及其制备方法和应用。 0006 本发明所采取的技术方案是： 0007 一种双锁型聚合物， 结构式为： 说明书 1/10 页 5 CN 111995745 A 5 。

9、0008式中， x为110117的 自然数， y为7080的自然数， z为13的自然数。 0009 上述双锁型聚合物的制备方法， 包括以下步骤： 0010 1)进行二异丙基乙醇胺和甲基丙烯酰氯的反应， 得到2-(二异丙基氨基)甲基丙烯 酸乙酯； 0011 2)进行甲氧基聚乙二醇和4-氰基-4-(硫代苯甲硫基)戊酸的酯化反应， 得到 即PEG-CPDB； 0012 3)进行PEG-CPDB、 2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸的聚合反应， 得到即PEG-b-(PDPA-co-MAA)； 00134)进行和L-瓜氨酸的反应， 得到 即Fmoc-Val-Cit； 00145)进行和Fmo。

10、c-Val-Cit的反应， 得到 说明书 2/10 页 6 CN 111995745 A 6 0015即Fmoc-Val-Cit-NH-Cy； 00166)Fmoc-Val-Cit-NH-Cy转化成 00177)进行PEG-b-(PDPA-co-MAA)和的反应， 得到 0018 0019 优选的， 步骤1)所述二异丙基乙醇胺、 甲基丙烯酰氯的摩尔比为1： (1.01.2)。 0020 优选的， 步骤1)所述反应的时间为2030h。 0021 优选的， 步骤2)所述甲氧基聚乙二醇、 4-氰基-4-(硫代苯甲硫基)戊酸的摩尔比为 1： (45)。 0022 优选的， 步骤2)所述酯化反应的时间为。

11、4070h。 0023 优选的， 步骤3)所述PEG-CPDB、 2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯、 甲基丙烯酸的 摩尔比为1： (8090)： (34)。 0024 优选的， 步骤3)所述聚合反应的时间为1020h。 说明书 3/10 页 7 CN 111995745 A 7 0025优选的， 步骤4)所述L-瓜氨酸的摩尔比为1： (1.61.8)。 0026 优选的， 步骤4)所述反应的时间为1020h。 0027优选的， 步骤5)所述Fmoc-Val-Cit的摩尔比为1： (2.53.0)。 0028 优选的， 步骤5)所述反应的时间为1525h。 0029优选的， 步骤7)所述PEG。

12、-b-(PDPA-co-MAA)、的摩尔 比为1： (13)。 0030 优选的， 步骤7)所述反应的时间为2030h。 0031 本发明的有益效果是： 本发明的双锁型聚合物具有良好的生物相容性和可降解 性， 由其自组装形成的纳米颗粒可以用于肿瘤成像与治疗。 0032 具体来说： 0033 本发明的双锁型聚合物自组装形成的纳米颗粒， 在肿瘤细胞内的内涵体/溶酶体 酸性环境中会通过质子化使颗粒内核由疏水性向亲水性转变， 颗粒崩解， 使小分子肽和荧 光分子连接键暴露出来， 并且在溶酶体内组织蛋白酶B的作用下， 连接键断裂， 荧光分子Cy- NH2释放出来， 小分子Cy-NH2不仅可以荧光成像， 而。

13、且能够靶向至肿瘤细胞线粒体， 使线粒体 活性氧上升， ATP下降， 从而杀死肿瘤细胞， 达到诊疗一体的目的， 具有巨大的临床应用潜 能。 附图说明 0034 图1为实施例中的S-PPDPA-VC-Cy的合成路线图。 0035 图2为实施例中的PEG-CPDB的核磁共振氢谱图。 0036 图3为实施例中的PEG-b-(PDPA-co-MAA)的核磁共振氢谱图。 0037 图4为实施例中的Fmoc-Val-Cit-NH-Cy的核磁共振氢谱图。 0038 图5为实施例中的S-PPDPA-VC-Cy的核磁共振氢谱图。 0039 图6为对比例中的inS-PPDPA-VC-Cy的合成路线图。 0040 图。

14、7为对比例中的inS-PPDPA-VC-Cy的核磁共振氢谱图。 0041 图8为纳米颗粒在水溶液中的粒径及粒径分布图。 说明书 4/10 页 8 CN 111995745 A 8 0042 图9为纳米颗粒在酸性条件下和中性条件下酶作用后的荧光光谱图。 0043 图10为S-NP在酸性条件下酶作用不同时间后的荧光光谱图。 0044 图11为S-NP和inS-NP在不同pH环境下酶作用后的荧光光谱图。 0045 图12为S-NP和inS-NP对4T1细胞杀伤效果实验图。 0046 图13为流式检测细胞摄取两种纳米颗粒后细胞凋亡情况图。 0047 图14为激光共聚焦观察4T1细胞和MEF细胞摄取纳米。

15、颗粒后的荧光恢复情况图。 0048 图15为激光共聚焦观察肿瘤细胞摄取纳米颗粒后荧光分子的胞内分布情况图。 0049 图16为激光共聚焦观察肿瘤细胞摄取纳米颗粒后胞内ROS和ATP水平情况图。 0050 图17为小动物活体成像情况图。 具体实施方式 0051 下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释和说明。 0052 Cy-NH2： 参照 “Activity-Based Near-Infrared Fluorogenic Probe for Enabling in Vitroand in Vivo Profiling of Neutrophil Elastase， Anal.Chem.2019。

16、, 91,3877-3884” 制备。 0053 Fmoc-Val-NHS： 参照 “Cathepsin B-Labile Dipeptide Linkers for Lysosomal Release of Doxorubicin from Internalizing Immunoconjugates:Model Studies of Enzymatic Drug Release and Antigen-Specific In Vitro Anticancer Activity， Bioconjugate Chem.2002,13,855-869” 制备。 0054 实施例： 0055 一种。

17、双锁型聚合物S-PPDPA-VC-Cy(合成路线图见图1)， 其制备方法包括以下步 骤： 0056 1)将0.1mol的二异丙基乙醇胺、 0.1mol的三乙胺和0.001mol的对苯二酚分散在 100mL的四氢呋喃中， 再滴加0.1mol的甲基丙烯酰氯， 滴加完后在氩气气氛下室温搅拌反应 24h， 过滤除去沉淀的三乙胺盐酸盐， 旋转蒸发除去四氢呋喃， 85真空(0.05mmHg)蒸馏， 得 到2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯(无色液体)； 0057 2)将0.4mmol的mPEG114分散在20mL的无水二氯甲烷中， 再加入1.6mmol的4-氰基- 4-(硫代苯甲硫基)戊酸和0.2mmol。

18、的4-二甲基氨基吡啶， 再在冰浴下滴加10mL的二环己基 碳二亚胺的二氯甲烷溶液(含二环己基碳二亚胺1.6mmol)， 滴加完后室温搅拌反应48h， 减 压浓缩， 用乙醚沉淀3次， 得到(PEG-CPDB， 核磁共振氢谱 如图2所示)； 0058 3)将0.1mmol的PEG-CPDB、 8mmol的2-(二异丙基氨基)甲基丙烯酸乙酯(DPA)和 0.02mmol的偶氮二异丁腈分散在5mL的1,4-二氧六环中， 60反应12h， 再加入0.3mmol的甲 基丙烯酸， 继续反应12h， 将产物先后用二甲基甲酰胺和纯水透析， 再冷冻干燥， 得到 说明书 5/10 页 9 CN 111995745 。

19、A 9 (PEG-b-(PDPA-co-MAA)， 核磁共振氢谱如图3 所示)； 0059 4)将0.033mol的L-瓜氨酸和3.24mmol的NaHCO3分散在60mL的水中， 再加入由 0.02mol的(Fmoc-Val-NHS)、 60mL的二甲醚和39mL的四氢呋喃组成 的混合溶液， 搅拌反应16h， 再边搅拌边加入103mL质量分数15的柠檬酸水溶液， 反应混合 物用2-丙醇/乙酸乙酯(100mL， 2-丙醇的质量分数为10)萃取3次， 有机层用水(100mL)洗 涤2次， 用无水MgSO4干燥， 将有机层蒸发至干， 得到 (Fmoc-Val-Cit， 白色粉末状， 收率84)； 。

20、0060 5)将0.22mmol的Fmoc-Val-Cit和0.34mmol的2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N,N- 四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)分散在10mL的二甲基甲酰胺中， 再加入0.16mmol的N,N-二异丙 基乙胺， 室温搅拌反应2h， 再加入5mL的(Cy-NH2)的二甲基甲酰胺溶液(含 0.088mmol的Cy-NH2)， 室温搅拌反应16h， 减压除去溶剂， 再将粗产物通过硅胶柱色谱法纯 化， 得到(Fmoc-Val-Cit-NH-Cy， 收率40， 核磁共 振氢谱如图4所示)； 0061 6)将600 L的无水哌啶加入2mL的Fmoc-Val-Cit-NH-Cy的二。

21、甲基甲酰胺溶液(含 0 .02mmol的Fmoc-Val-Cit-NH-Cy)中 ， 在氩气气氛下室温搅拌反应2h ， 得到 说明书 6/10 页 10 CN 111995745 A 10 0062 7)将0.02mmol的PEG-b-(PDPA-co-MAA)、 0.024mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙 基碳二亚胺盐酸盐和0.02mmol的N-羟基琥珀酰亚胺分散在2mL的二甲基甲酰胺中， 再将得 到的混合液加入步骤6)的反应液中， 室温反应24h， 将产物先后用二甲基甲酰胺和纯水透 析， 再冷冻干燥， 得到(S-PPDPA- VC-Cy， 核磁共振氢谱图如图5所示)。 0063 。

22、对比例： 0064 一种双锁型聚合物inS-PPDPA-VC-Cy(合成路线图见图6)， 其制备方法包括以下步 骤： 0065 将步骤1)中的 “二异丙基乙醇胺” 替换成 “异戊醇” 进行反应， 其余同实施例1， 得到 (inS-PPDPA-VC-Cy， 核磁共 振氢谱如图7所示)。 说明书 7/10 页 11 CN 111995745 A 11 0066 性能测试： 0067 一、 纳米颗粒的制备： 0068 通过纳米沉淀法制备纳米颗粒， 具体方法如下： 0069 将10mg的S-PPDPA-VC-Cy分散在1mL的四氢呋喃中， 再边搅拌边滴加10mL的超纯 水， 滴加完后搅拌2h， 将得到。

23、的颗粒溶液转移到透析袋(MWCO 7000)中， 在超纯水中透析24h 除去四氢呋喃， 再将颗粒溶液用0.45 m过滤器过滤， 得到的纳米颗粒标记为S-NP。 同样， 将 S-PPDPA-VC-Cy替换成inS-PPDPA-VC-Cy， 经过相同的制备过程得到的纳米颗粒标记为inS- NP。 0070 二、 双锁型聚合物S-PPDPA-VC-Cy的酸响应性： 0071 纳米颗粒的酸响应： 0072 将S-NP和inS-NP分别加入pH5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 6.8、 7.4的0.2mol/L的PBS缓冲 液(模拟内涵体/溶酶体酸性微环境)中， 孵育培养10min， 测试纳米颗粒。

24、在水溶液中的粒径 及粒径分布， 测试结果如图8所示。 0073 由图8可知： 随着pH的下降S-NP的尺寸减小到10nm左右， 而inS-NP的尺寸变化很 小。 0074 三、 双锁型聚合物S-PPDPA-VC-Cy的体外荧光光谱： 0075 1)纳米颗粒在酸性条件下和中性条件下酶作用后的荧光光谱： 0076 将S-NP和inS-NP分别加入pH5.5和pH7.4的0.2mol/L的PBS缓冲液(模拟内涵 体/溶酶体酸性微环境)中， 并加入木瓜蛋白酶(2 M)， 孵育培养12h， S-NP和inS-NP在酸性条 件下酶作用后的荧光光谱图如图9所示。 0077 由图9可知： S-NP在酸性条件下。

25、酶作用后有明显的荧光恢复， 而中性条件下未有荧 光恢复， 并且在相同条件下inS-NP不存在荧光恢复。 0078 2)纳米颗粒在酸性条件下酶作用不同时间后的荧光光谱： 0079 将S-NP加入pH5.5的0.2mol/L的PBS缓冲液(模拟内涵体/溶酶体酸性微环境) 中， 并加入木瓜蛋白酶(6 M)， 孵育培养0、 0.5h、 1.0h、 1.5h、 2.0h、 2.5h、 3.0h、 3.5h、 4.0h， S- NP在酸性环境中酶作用不同时间后的荧光光谱图如图10所示。 0080 由图10可知： S-NP在酸性条件随着酶作用后时间的延长， 荧光逐渐增强。 0081 3)纳米颗粒在不同pH条。

26、件下酶作用后的荧光光谱： 0082 将S-NP和inS-NP分别加入pH5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 6.8、 7.4的0.2mol/L的PBS缓冲 液(模拟内涵体/溶酶体酸性微环境)中， 并加入木瓜蛋白酶(2 M)， 孵育培养12h， S-NP和 inS-NP在不同pH环境下酶作用后的荧光光谱图如图11所示。 0083 由图11可知： S-NP在酸性条件下酶作用后有明显的荧光恢复， 而中性条件下未有 荧光恢复， 并且在相同条件下inS-NP不存在荧光恢复。 0084 四、 双锁型聚合物的体外细胞实验： 0085 1)S-NP和inS-NP对小鼠乳腺癌细胞(4T1)和小鼠成纤维细胞(。

27、MEF)的杀伤效果实 验： 0086 将MEF或4T1细胞接种于96孔组织培养板(1104细胞/孔)中培养12h， 然后在所需 的Cy-NH2、 Val-Cit-NH-Cy、 S-NP或inS-NP浓度下培养细胞， 培养24h后用标准的商用甲基噻 唑四唑蓝(MTT)法测定细胞活性； 流式细胞术分析细胞凋亡； 4T1细胞(每孔1105细胞)在 说明书 8/10 页 12 CN 111995745 A 12 24孔培养板上培养12h， 然后用PBS、 Cy-NH2、 Cy-NH2+Vc(维生素C)、 S-NP、 S-NP+Vc、 S-NP+ inhibitor(CA-074组织蛋白酶B抑制剂)、 。

28、inS-NP、 inS-NP+inhibitor等剂量(Cy-NH2： 6 g/ mL， 抑制剂： 10mM， Vc:50 M)处理4T1细胞6h； 使用膜联蛋白V FITC和碘化丙啶的死细胞凋亡 试剂盒(KeyGEN BioTECH， 中国)检测细胞凋亡水平； 最后， 将细胞用PBS缓冲液洗涤3次， 收 集并通过流式细胞术分析， S-NP和inS-NP对4T1细胞杀伤效果实验图和流式检测细胞摄取 两种纳米颗粒后细胞凋亡情况图分别如图12和图13所示。 0087 由图12和图13可知： 在7个浓度梯度下， 游离的Cy-NH2对4T1和MEF细胞的杀伤效果 最强， 但是相对于正常细胞， Cy-N。

29、H2对肿瘤细胞的杀伤效果更好， 另外S-NP对肿瘤细胞的杀 伤效果比inS-NP的效果更好， 对正常细胞MEF的杀伤效果较弱； 流式结果与MTT结果一致。 0088 2)激光共聚焦观察肿瘤细胞摄取纳米颗粒后的荧光恢复实验： 0089 细胞共聚焦荧光成像： 将MEF和4T1细胞(每孔2105细胞)在玻璃盖玻片上培养 12h， 4T1细胞用S-NP、 S-NP+inhibitor、 inS-NP、 inS-NP+inhibitor等剂量(Cy-NH2： 6 g/mL) 处理6h， MEF细胞用S-NP、 inS-NP等剂量(Cy-NH2： 6 g/mL)处理6h； 用PBS缓冲液洗涤3次， 用 4。

30、甲醛溶液固定细胞； 最后， 用CLSM观察细胞， 激光共聚焦观察肿瘤细胞摄取纳米颗粒后 的荧光恢复情况图如图14所示。 0090 由图14可知： S-NP经细胞摄取胞内有明显的荧光， 而添加了组织蛋白酶抑制剂的 组和inS-NP组细胞内无明显的荧光， 说明在胞内溶酶体酸性环境和组织蛋白酶B的存在下， S-NP在胞内才会有荧光的恢复。 0091 3)激光共聚焦观察肿瘤细胞摄取纳米颗粒后荧光分子的胞内分布： 0092 将4T1细胞(3105细胞/孔)在35mm共焦培养皿中培养12h， 然后用S-NP(Cy-NH2： 6 g/mL)培养4h， 然后在37下用Lyso-Tracker Green DN。

31、D-26(150nM)染色2h， 线粒体在37 下用Mito-Tracker Green FM(100nM)染色0.5h， 用PBS缓冲液洗涤三次， 然后置于无血清的 新鲜培养基中， 用CLSM观察细胞， 激光共聚焦观察肿瘤细胞摄取纳米颗粒后荧光分子的胞 内分布情况图如图15所示。 0093 由图15可知： S-NP在经细胞摄取后通过酸性条件和组织蛋白酶B响应后释放出Cy- NH2， Cy-NH2会迅速靶向至线粒体， 在细胞线粒体处富集。 0094 4)激光共聚焦观察肿瘤细胞摄取纳米颗粒后胞内活性氧(ROS)和5-三磷酸腺苷 (ATP)水平： 0095 在96孔黑色组织培养板中培养4T1细胞(。

32、1106细胞/孔)， 用PBS、 Cy-NH2、 Cy-NH2+ Vc、 S-NP、 S-NP+Vc、 S-NP+inhibitor、 inS-NP、 inS-NP+inhibitor处理6h， 将细胞用PBS缓冲 液冲洗3次， 然后用2,7-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)(20 M)染色， 使用微孔板系统 (DCF： Ex/Em480/525nm)分析ROS水平， 激光共聚焦观察肿瘤细胞摄取纳米颗粒后胞内ROS 和ATP水平情况图如图16所示。 0096 线粒体膜电位测定： 使用JC-1探针评估4T1细胞中的线粒体去极化。 将细胞在35mm 共聚焦培养皿中培养(3106个细胞/孔)12。

33、h， 然后用PBS、 Cy-NH2、 Cy-NH2+Vc、 S-NP、 S-NP+ Vc、 S-NP+inhibitor处理， 处理12h后， 将细胞与等体积的含JC-1染料(5mg/L)的无血清培养 基在37下孵育20min。 染色结束时， 将探针用PBS缓冲液洗涤3次， 然后置于无血清的新鲜 培养基中。 最后， 通过CLSM观察细胞。 0097 细胞ATP水平的测量： 将4T1细胞(每孔1106个细胞)在24孔板上培养12h， 然后用 说明书 9/10 页 13 CN 111995745 A 13 PBS、 Cy-NH2、 Cy-NH2+Vc、 S-NP、 S-NP+Vc、 S-处理NP+。

34、inhibitor、 inS-NP、 inS-NP+ inhibitor12h。 之后， 将细胞用PBS缓冲液洗涤3次， 在37下用胰蛋白酶消化1min， 然后加 入RPMI1640培养基以终止反应和通过离心收集细胞。 使用5-三磷酸腺苷(ATP)生物发光分 析试剂盒和微孔板系统评估ATP水平。 0098 由图16可知： S-NP经细胞摄取以后能够使细胞内的ROS水平上升， 胞内ATP的水平 下降， 通过破坏线粒体膜电位影响细胞活性， 最终杀死肿瘤细胞。 0099 五、 动物水平实验： 0100 小动物活体成像： 0101 将荷瘤小鼠随机分组(n3)， 当肿瘤体积达到200mm3时， 静脉注射。

35、S-NP(Cy-NH2： 1.25mg/kg， 100 L)， S-NP+inhibitor(Cy-NH2： 1.25mg/kg， 100 L， 抑制剂： 5mg/kg， 腹腔注 射)， inS-NP(Cy-NH2： 1.25mg/kg， 100 L)， inS-NP+inhibitor(Cy-NH2： 1.25mg/kg， 100 L， 抑 制剂： 5mg/kg， 腹腔注射)。 所有小鼠分别于注射前0h、 2h、 4h、 8h、 12h、 24h和36h， 用Xtreme (德国布鲁克)活体荧光仪采集全身荧光图(Ex/Em650/700nm)。 给药后36h处死小鼠， 采集 主要脏器(肝、 。

36、肾、 肺、 脾、 心)和肿瘤组织， 进行Cy-NH2分布的离体检测， 小动物活体成像情 况图如图17所示。 0102 由图17可知： S-NP组可以很好的富集在肿瘤部位， 并且其他对照组不能在肿瘤部 位有很好的成像效果。 0103 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说明书 10/10 页 14 CN 111995745 A 14 图1 说明书附图 1/12 页 15 CN 111995745 A 15 图2。

37、 说明书附图 2/12 页 16 CN 111995745 A 16 图3 说明书附图 3/12 页 17 CN 111995745 A 17 图4 说明书附图 4/12 页 18 CN 111995745 A 18 图5 说明书附图 5/12 页 19 CN 111995745 A 19 图6 说明书附图 6/12 页 20 CN 111995745 A 20 图7 图8 说明书附图 7/12 页 21 CN 111995745 A 21 图9 图10 说明书附图 8/12 页 22 CN 111995745 A 22 图11 图12 说明书附图 9/12 页 23 CN 111995745 A 23 图13 图14 说明书附图 10/12 页 24 CN 111995745 A 24 图15 说明书附图 11/12 页 25 CN 111995745 A 25 图16 图17 说明书附图 12/12 页 26 CN 111995745 A 26 。