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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010859364.0 (22)申请日 2020.08.24 (71)申请人 泉州南京大学环保产业研究院 地址 362000 福建省泉州市丰泽区北峰街 道泉州软件园研发2号楼1-3层 (72)发明人 邓东阳王永峰胡大波季荣 智锁红陈继锡 (74)专利代理机构 泉州市宽胜知识产权代理事 务所(普通合伙) 35229 代理人 廖秀玲 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/08(2006.01) G01N 30/14(2006.01) (。
2、54)发明名称 沉积物中多种痕量雄激素的定量分析及生 态风险评价方法 (57)摘要 本发明提出沉积物中多种痕量雄激素的定 量分析及生态风险评价方法， 包括： 沉积物中雄 激素的提取浓缩， 沉积物中雄激素的净化， 雄激 素的定量分析， 沉积物中雄激素的生态风险评 价。 本发明能够检测的雄激素污染物多达12种， 方法回收率高， 基质干扰小， 检测结果准确可靠， 同时定量分析沉积物雄激素含量的基础上利用 生态风险评价模型计算雄激素的生态风险， 为沉 积物雄激素污染控制与治理提供科学依据。 权利要求书1页 说明书8页 附图4页 CN 111929387 A 2020.11.13 CN 11192938。
3、7 A 1.沉积物中多种痕量雄激素的定量分析， 其特征在于： 包括如下步骤： (1)沉积物中雄激素的提取浓缩： 取冻干的河口沉积物于容器中， 加入第一有机溶剂进 行超声萃取， 静置澄清后取上清液， 萃取1-5次， 萃取液旋蒸浓缩得到萃取浓缩液； (2)沉积物中雄激素的净化： 将萃取浓缩液配到水中， 通过固相萃取柱萃取， 利用第二 有机溶剂洗脱固相萃取柱得到洗脱液， 将洗脱液旋蒸、 氮吹浓缩、 定容、 保存得到待测样品 液； (3)雄激素的定量分析： 利用液相色谱质谱联用仪对待测样品液中雄激素进行检测， 使 用内标法对雄激素进行定量分析。 2.根据权利要求1所述的沉积物中多种痕量雄激素的定量分析。
4、， 其特征在于： 所述第一 有机溶剂为甲醇和丙酮的混合溶液， 甲醇和丙酮体积配比为1： 1-3， 混合溶液体积为15- 20mL； 所述超声萃取中超声频率为40KHz， 超声功率为600W， 温度为35， 超声时间为15min。 3.根据权利要求1所述的沉积物中多种痕量雄激素的定量分析， 其特征在于： 所述固相 萃取柱为为Waters Oasis HLB或C18固相萃取小柱， 固相萃取柱在使用之前依次用乙酸乙 酯、 乙腈、 去离子水活化。 4.根据权利要求1所述的沉积物中多种痕量雄激素的定量分析， 其特征在于： 所述第二 有机溶剂包括乙酸乙酯、 乙酸乙酯和乙腈的混合溶液， 乙酸乙酯的体积为15。
5、-20mL， 乙酸乙 酯和乙腈体积配比为1-3： 1， 乙酸乙酯和乙腈混合溶液体积为6-10mL。 5.根据权利要求1所述的沉积物中多种痕量雄激素的定量分析， 其特征在于： 萃取浓缩 液配到水中， 水中加入甲醇， 甲醇的含量为1-5。 6.根据权利要求1所述的沉积物中多种痕量雄激素的定量分析， 其特征在于： 所述雄激 素为雄烯酮、 诺龙、 雄烯二酮、 宝丹酮、 睾酮、 雄酮、 雄诺龙、 表雄酮、 美雄酮、 甲睾酮、 福美司 坦、 甲氢睾酮中的一种或多种。 7.利用权利要求1-6对沉积物中雄激素的生态风险评价， 其特征在于： 利用雄激素在沉 积物-孔隙水的分配平衡模型计算出孔隙水中雄激素的浓度，。
6、 进而利用风险商计算公式获 得雄激素的风险商值， 评价沉积物中雄激素的生态风险。 8.根据权利要求7所述的沉积物中雄激素的生态风险评价， 其特征在于： 所述分配平衡 模型如公式(1)和(2)所示： Koc0.63Kow (2) 9.根据权利要求6所述的沉积物中雄激素的生态风险评价， 其特征在于： 所述风险商计 算公式如(3)所示： 权利要求书 1/1 页 2 CN 111929387 A 2 沉积物中多种痕量雄激素的定量分析及生态风险评价方法 技术领域 0001 本发明涉及痕量有机物的检测分析及生态风险评价领域， 特别涉及沉积物中多种 痕量雄激素的定量分析及生态风险评价方法。 背景技术 000。
7、2 随着经济的高速发展和城市化进程的加快， 大量的化学品包括内分泌干扰物等污 染物释放并进入环境， 已有研究报道内分泌干扰物会干扰生殖和发育， 诱导水生生物雌雄 同体， 增加人类患乳腺癌和睾丸癌的可能性。 类固醇激素是一类由胆固醇合成代谢具有生 物活性的化合物， 作为一类典型的环境内分泌干扰物， 具有很强的内分泌干扰作用， 即使在 极低浓度(-0.1ng/L)下也会对生物体的生殖、 神经和免疫系统产生严重危害， 导致生物体 的内分泌系统失衡。 类固醇激素按照生理功能可分为雌激素、 雄激素、 孕激素、 糖皮质激素 和盐皮质激素， 按照来源可以分为天然类固醇激素和人工合成类固醇激素。 天然类固醇激。
8、 素主要来自于人和动物的排泄物如尿液和粪便， 人工合成类固醇激素广泛用于日常生活和 畜牧业如避孕、 人类和兽医治疗、 生长促进剂等。 张芊芊等人利用建模的方法估算7种类固 醇激素的排放量并预测它们在环境中的归趋状况， 结果表明进入环境的类固醇激素排放量 达到2486吨/年， 其中大约有83进入水体环境， 17进入土壤环境， 经过降解、 扩散、 蓄积 等 过 程 最 终 2 0 的 类 固 醇 激 素 在 水 中 ， 7 3 在 沉 积 物 ， 7 在 土 壤 中 (Environ.Sci.Technol.48(2014)7982-7992)， 沉积物成为类固醇激素污染物的汇。 0003 雄激素。
9、作为一类典型的类固醇激素， 人工合成的雄激素如康力龙， 甲睾酮， 群勃龙 和诺龙等不仅用于临床治疗， 还作为促生长剂非法用于畜禽养殖过程尤其是肉牛的养殖， 作为促进剂用于提高运动员成绩等。 为保证动物源性食品安全， 中华人民共和国农业部第 193号公告 食品动物禁用的兽药及其它化合物清单 中禁止将甲睾酮和丙酸睾酮作为促进 动物生长为目的在食品动物饲养过程中使用。 中华人民共和国农业部第235号公告 动物性 食品中兽药最高残留限量 中允许丙酸睾酮作治疗用， 但不得在动物性食品中检出， 将甲睾 酮和群勃龙列为禁止使用的药物， 在动物性食品中不得检出。 目前农业部只对甲睾酮、 丙酸 睾酮、 群勃龙3。
10、种雄激素进行了限制， 还有大量其他人工合成的雄激素不受管控限制。 雄激 素作为一类亲脂性有机物， 通过污水处理厂、 畜禽养殖场、 药厂污水排放口等进入环境， 经 扩散、 降解等过程最终主要分汇集于沉积物。 因此， 迫切需要开发一种灵敏、 可靠、 准确的方 法用于沉积物多种雄激素的分析， 并评价其潜在的生态风险。 0004 通过检索发现专利CN110132707B公开了一种超声辅助萃取沉积物中多种甾体激 素的预处理方法， 未对沉积物提取物进行净化处理直接检测， 由于沉积物基质复杂将造成 该方法的基质干扰大， 影响分析结果的准确性； 同时该方法仅对雄烯二酮、 睾酮和甲睾酮3 种雄激素进行分析， 分。
11、析的雄激素种类有限、 通量低， 也未对沉积物中雄激素进行生态风险 评价。 专利CN108663471B公开了一种测定河口沉积物中多种内分泌干扰物含量的方法， 采 用氧化铝和硅藻土对河口沉积物样品进行预处理， 联用索氏提取和固相萃取法提纯得到富 集样品， 利用LC-MS/MS对沉积物中双氯芬酸、 双酚A、 17 -雌二醇、 雌酮、 17 -乙炔雌二醇、 4- 说明书 1/8 页 3 CN 111929387 A 3 辛基苯酚、 4-壬基酚、 扑米酮、 睾酮、 黄体酮进行检测分析。 该方法需要消耗大量的溶剂和时 间， 并且仅对睾酮1种雄激素进行分析， 分析的雄激素种类非常少， 沉积物中雄激素的生态。
12、 风险不得而知。 发明内容 0005 因此， 针对上述的问题， 本发明的目的是针对沉积物样品基质复杂， 多种痕量雄激 素共存检测技术难度大， 雄激素的生态风险未知等问题， 提供沉积物中多种痕量雄激素的 定量分析及生态风险评价方法， 采用超声提取联合固相萃取净化的前处理方法， 接着利用 液相色谱质谱联用仪(LC-MS/MS)对多种雄激素进行定量分析， 最后利用生态风险评价模型 计算雄激素的生态风险， 为沉积物雄激素污染控制与治理提供科学依据。 0006 为实现上述目的， 本发明的技术方案是提供了沉积物中多种痕量雄激素的定量分 析， 包括如下步骤： 0007 (1)沉积物中雄激素的提取浓缩： 取冻。
13、干的河口沉积物于容器中， 加入第一有机溶 剂进行超声萃取， 静置澄清后取上清液， 萃取1-5次， 萃取液旋蒸浓缩得到萃取浓缩液； 0008 (2)沉积物中雄激素的净化： 将萃取浓缩液配到水中， 通过固相萃取柱萃取， 利用 第二有机溶剂洗脱固相萃取柱得到洗脱液， 将洗脱液旋蒸、 氮吹浓缩、 定容、 保存得到待测 样品液； 0009 (3)雄激素的定量分析： 利用液相色谱质谱联用仪对待测样品液中雄激素进行检 测， 使用内标法对雄激素进行定量分析。 0010 进一步改进的是： 所述第一有机溶剂为甲醇和丙酮的混合溶液， 甲醇和丙酮体积 配比为1： 1-3， 混合溶液体积为15-20mL； 所述超声萃取。
14、中超声频率为40KHz， 超声功率为 600W， 温度为35， 超声时间为15min。 0011 进一步改进的是： 所述固相萃取柱为为Waters Oasis HLB或C18固相萃取小柱， 固 相萃取柱在使用之前依次用乙酸乙酯、 乙腈、 去离子水活化。 0012 进一步改进的是： 所述第二有机溶剂包括乙酸乙酯、 乙酸乙酯和乙腈的混合溶液， 乙酸乙酯的体积为15-20mL， 乙酸乙酯和乙腈体积配比为1-3： 1， 乙酸乙酯和乙腈混合溶液 体积为6-10mL。 0013 进一步改进的是： 萃取浓缩液配到水中， 水中加入甲醇， 甲醇的含量为1-5。 0014 进一步改进的是： 所述雄激素为雄烯酮、 。
15、诺龙、 雄烯二酮、 宝丹酮、 睾酮、 雄酮、 雄诺 龙、 表雄酮、 美雄酮、 甲睾酮、 福美司坦、 甲氢睾酮中的一种或多种。 0015 沉积物中雄激素的生态风险评价， 利用雄激素在沉积物-孔隙水的分配平衡模型 计算出孔隙水中雄激素的浓度， 进而利用风险商计算公式获得雄激素的风险商值， 评价沉 积物中雄激素的生态风险。 0016 进一步改进的是： 所述分配平衡模型如公式(1)和(2)所示： 0017 0018 Koc0.63Kow (2) 0019 进一步改进的是： 所述风险商计算公式如(3)所示： 说明书 2/8 页 4 CN 111929387 A 4 0020 0021 本发明的优点和有益。
16、效果在于： 0022 1、 本方法利用超声辅助不同极性有机溶剂对沉积物中12种雄激素萃取， 目标物萃 取效率高、 操作简单快速， 相较于索氏抽提法萃取时间大大缩短、 溶剂用量大大减少。 0023 2、 本方法利用超声萃取耦合固相萃取净化的前处理步骤将沉积物中的腐殖酸等 杂质去除， 净化效果好， 降低了分析检测时沉积物样品带来的基质干扰， 同时利用液质联用 的多反应监测模式产生的特征碎片离子进行定量分析， 进一步提高了分析结果的准确性。 0024 3、 本方法除了雄烯酮(66.5)和福美司坦(60.2)外其余10中雄激素的回收率 为80-120， 回收率较好， 检测限低， 结果可靠， 能实现对沉。
17、积物样品中12种雄激素的定量 检测。 0025 4、 能够对沉积物中雄激素对生态风险的评估， 为沉积物和水环境中雄激素的污染 控制与治理提供科学依据。 附图说明 0026 图1为沉积物中雄激素的测定流程示意图； 0027 图2为12种雄激素目标物的总离子流图； 0028 图3为雄烯酮、 诺龙、 雄烯二酮、 宝丹酮、 睾酮、 雄酮、 雄诺龙、 表雄酮、 美雄酮、 甲睾 酮、 福美司坦、 甲氢睾酮及相应内标物的提取色谱图； 0029 图4为12种雄激素目标物的回收率图。 具体实施方式 0030 下面结合附图和实施例， 对本发明的具体实施方式作进一步描述。 以下实施例仅 用于更加清楚地说明本发明的技。
18、术方案， 而不能以此来限制本发明的保护范围。 0031 如图1-图4所示， 沉积物中多种痕量雄激素的定量分析， 其步骤为： 0032 (1)沉积物中雄激素的提取浓缩： 取冻干的河口沉积物于25mL具塞刻度玻璃尖底 离心管， 先加入100 L浓度为0.5mg/L的12种雄激素混标和100 L浓度为1.0mg/L的睾酮-D3 内标， 接着加入20mL体积比为1:1的甲醇和丙酮混合溶液超声萃取， 超声频率为40KHz， 超声 功率为600W， 温度为35， 超声时间为15min， 静置澄清后取上清液， 超声萃取3次， 萃取液在 30-35下旋蒸浓缩至2mL左右， 得到萃取浓缩液； 0033 (2)沉。
19、积物中雄激素的净化： 将2mL萃取浓缩液配到200mL水中， 水中有机溶剂甲醇 的含量控制在1-5， 利用Waters Oasis HLB固相萃取小柱富集溶液中的雄激素目标物， 固 相萃取小柱在使用之前依次用6mL乙酸乙酯、 6mL乙腈、 12mL去离子水活化， 流速控制在1-2 滴/秒， 萃取结束后氮吹30min除去萃取小柱部分水分， 接着在5000r/min条件下离心5min除 去萃取小柱剩余的水分并将其放在干燥器中。 依次用15mL乙酸乙酯、 6mL体积比为1:1的乙 酸乙酯和乙腈混合溶液洗脱干燥后的固相萃取小柱， 洗脱液旋蒸、 氮吹浓缩， 定容至2mL保 存在棕色进样小瓶； 0034 。
20、(3)雄激素的定量分析： 基于液相色谱质谱联用仪建立的多反应监测模式对待测 样品液中雄烯酮、 诺龙、 雄烯二酮、 宝丹酮、 睾酮、 雄酮、 雄诺龙、 表雄酮、 美雄酮、 甲睾酮、 福 说明书 3/8 页 5 CN 111929387 A 5 美司坦和甲氢睾酮12种雄激素进行检测分析， 利用内标法对雄激素进行定量， 参数如下： 0035 高效液相色谱仪HPLC： Agilent 1260； 0036 质谱仪： API4000 QTrap-AB SCIEX； 0037 色谱柱： Waters XBridge BEH C18 XP分析柱(2.1mm50mm,2.5 m)； 柱温： 40； 0038 。
21、流动相： A： 含1甲酸的水， B： 甲醇； 流速： 0.4mL/min； 进样体积为10 L； 0039 流动相梯度见表1。 0040 0041 表1 0042 质谱条件见表2。 0043 0044 表2 0045 利用多反应监测模式对雄激素定量分析的参数见表3。 说明书 4/8 页 6 CN 111929387 A 6 0046 说明书 5/8 页 7 CN 111929387 A 7 0047 0048 表3 0049 以上为多反应监测模式的离子对参数： 雄烯酮为273.2159.2(定性)， 273.293.1 (定量)； 诺龙为275.1257.3(定性)， 275.1109.1(定。
22、量)； 雄烯二酮为287.2109.1(定性)， 287.297.1(定量)； 宝丹酮为287.2135.2(定性)， 287.2121.1(定量)； 睾酮为289.297.1 (定性)， 289.2109.1(定量)； 雄酮为291.2255.3(定性)， 291.2273.4(定量)； 雄诺龙为 291.2273.4(定性)， 291.2255.3(定量)； 表雄酮为291.2255.3(定性)， 291.2273.4(定 量)； 美雄酮为301.2149.2(定性)， 301.2121.1(定量)； 甲睾酮为303.297.1(定性)， 303.2109.2(定量)； 福美司坦为303.。
23、2173.2(定性)， 303.2125.1(定量)； 甲氢睾酮为 305.2173.2(定性)， 305.2269.3(定量)； 内标睾酮-D3为292.397.1， 292.3109.1。 0050 利用超声萃取-固相萃取净化-液相色谱质谱联用多反应监测模式定量分析沉积 物中12种雄激素的回收率数据见表4。 0051 0052 表4 0053 沉积物中雄激素的生态风险评价： 0054 利用雄激素在沉积物-孔隙水的分配平衡模型计算出孔隙水中雄激素的浓度如公 式(1)和(2)所示， 利用风险商计算公式获得雄激素的风险商值如公式(3)所示。 欧盟风险评 价技术指南采用评价因子(Assessmen。
24、t factor,AF)法来推导PNEC， 表6给出了推导PNEC所 用的评价因子的选取原则。 对于第一种情况， PNEC为半数致死(效应)浓度L(E)C50的最小值 说明书 6/8 页 8 CN 111929387 A 8 与对应评价因子AF的比值。 对于第二至第四种情况， PNEC为最大观测无效应浓度NOEC的最 小值与对应评价因子AF的比值。 对于第五种情况， 以污染物慢性毒性数据对横坐标， 以效应 累积概率为纵坐标， 得到物种敏感度分布SSD曲线。 通常采用Log-normal或Log-logistic模 型进行SSD曲线拟合， 然后以KS检验(Kolmogorov-Smirnov t。
25、est)或采用AD拟合优度检验 (AndersonDarling goodness of fit test)判断其合理性。 最终采用SSD曲线5概率所 对应的浓度(HC5值)除以AF来推导PNEC， 并取与该浓度相关联的50置信区间(c.i.)， 如公 式(4)所示。 那么该PNEC值意味着污染物浓度低于此浓度时， 有50的可能性可以保护95 以上的生物免受毒害污染物的不利效应影响。 0055 雄烯二酮、 雄诺龙、 福美司坦、 甲睾酮、 睾酮、 群勃龙的PNEC数值如表5所示。 若RQ 0.01则表明污染物的生态风险低； 0.01RQ1则表示污染物的生态风险中等； RQ1则表示 污染物污染物的。
26、生态风险高。 0056 0057 Koc0.63Kow (2) 0058 0059 0060 Cpore： 孔隙水中污染物的浓度， ng/L； Csed： 沉积物中污染物的浓度， ng/g； foc： 沉 积物中总有机碳含量， g/kg； Koc： 污染物在沉积物-孔隙水的分配系数， L/kg； Kow： 污染物的 正辛醇-水分配系数-孔隙水的分配系数。 RQ： 风险商； PNEC： 预测无效应浓度。 0061 0062 表5 0063 表6推导PNEC所用的评价因子(AF)的取值要求： 说明书 7/8 页 9 CN 111929387 A 9 0064 0065 表6 0066 以上显示和描。
27、述了本发明的基本原理和主要特征及其优点， 本行业的技术人员应 该了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明中描述的只是说明本发明的原 理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下， 本发明还会有各种变化和改进， 这些变化和改进 都落入要求保护的本发明范围内， 本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界 定。 说明书 8/8 页 10 CN 111929387 A 10 图1 说明书附图 1/4 页 11 CN 111929387 A 11 图2 说明书附图 2/4 页 12 CN 111929387 A 12 图3 说明书附图 3/4 页 13 CN 111929387 A 13 图4 说明书附图 4/4 页 14 CN 111929387 A 14 。