一种具有抗病毒活性的化合物及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种新化合物，具体而言，本发明涉及一种抗病毒的新化合物及其制备方法。
背景技术
艾替开韦(Entecavir)是一种抗病毒剂，其化学名称为：[1S-(1α，3α，4β)-2-氨基-1，9-二氢-9-[4-羟基-3-(羟甲基)-2-亚甲基环戊基]-6H-嘌呤-6-酮，专利公开说明书CN91110831公开了该化合物的制备方法，专利公开说明书CN1310999A公开了低剂量艾替开韦的制剂及其应用，专利公开说明书CN91110831还公开了下式化合物。
a b c
R1 PO3M H PO3M
R2 H PO3M PO3M
M＝Na，K，Mg，or Ca
但是，艾替开韦在水中的溶解性很差，限制了其水溶液剂型的制备和在治疗上的应用，虽然上述结构式的盐按照本领域技术人员的理解也会增加水溶性，但由于其合成条件较苛刻，成本很高，至今未见上述结构式的盐的报道。
专利公开说明书CN91110831公开的艾替开韦的制备方法，该合成方法采用逐步合成的方法，合成步骤长，烦琐；要用到大量严重污染环境的苄溴；脱保护时要采用不同的反应条件，分步进行，而且要大量地用到三氯化硼作为脱保护剂，该步反应条件苛刻，工业生产成本高。
【发明内容】
针对上述问题，本发明提供了一种具有通式(I)结构的化合物：
其水溶性非常好，并且制备方法简便，为多种制剂方式提供了可能。本发明地技术方案：提供一种具有通式(I)结构的化合物：
其中M是各种金属离子，铵离子及取代的铵离子；优选的是碱金属和碱土金属离子和铵离子。更进一步说，M是钠；或者，M是钾；或者，M是铵；或者，M是钙。
在式(I)和整个说明书中，最优选的式(I)化合物是：
本发明还提供一种式(I)化合物的制备方法，该方法包括下列步骤：
a、以化合物2为原料，钯碳催化氢化，得到化合物3；
b、将化合物3与2，2-二甲氧基丙烷反应，得到化合物4；
c、化合物4与2-(4-甲氧苯基二苯甲氨基)-6-苯甲氧基鸟嘌呤钠盐反应得到化合物5；
d、以Dess-Martin试剂氧化化合物5，得到对应的化合物6；
e、化合物6与锌/四氯化钛/二溴甲烷作用，得到亚甲基化产物7；
f、稀盐酸脱保护得到化合物8；
g、化合物8与等摩尔的氢氧化物反应得到具有下式结构的化合物1。
本发明还提供具有通式(I)结构所示的化合物在制备抗病毒感染药物中的应用，具体的说，所述药物是抗乙肝病毒感染和/或并发感染；或者，是抗丙肝病毒感染和/或并发感染；或者，是抗疱疹病毒感染；或者，是抗乳头状病毒感染；或者，是抗痘病毒感染；或者，是抗HIV病毒感染的药物。
本发明还提供一种抗病毒的药物组合物，含有通式(I)结构的化合物。更进一步，所述的药物组合物是以具有通式(I)结构的化合物为活性成分，加上可接受的药用辅料或载体组成，它可以被制备成各种药物制剂，具体的说是口服制剂或注射制剂。
本发明的化合物的水溶性比艾替开韦提高了几百倍，而且该类化合物在水中具有更好的稳定性；这些化合物惊人的和显著的稳定性和水溶解性提供了有效制剂和大量使用上的优点，特别是在制备膏剂和水溶液剂型方面给予了极大的方便；同时由于这些化合物水溶性的改进，该类化合物在吸收和生物利用度方面得到了提高；而且该类化合物表现出了更好的抗病毒活性。
本发明的式(I)化合物比艾替开韦相比在水中有显著的溶解性，有更好的抗病毒活性，它们可用于治疗哺乳动物类如家畜(如狗，猫，马，猪等)和人，以及禽类(如鸡，鸭，鹅等)的病毒感染。
式(I)所示化合物对下列一种或多种病毒有效：巨细胞病毒和人体免疫缺陷病毒(HIV)，单纯性疱疹病毒1和2以及水痘带状疱疹病毒。
除了上述的病毒以外，式(I)化合物还对其它典型的DNA病毒包括其它疱疹病毒(例如Epstein-Barr病毒，假性狂犬病病毒，人体疱疹病毒6等)，逗病毒(例如牛痘苗病毒，猴痘苗病毒和肌瘤病毒)，乳头多瘤空泡病毒(如乳头状瘤病毒)，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒和腺病毒具有良好的活性。
本发明的化合物由于具有很好的水溶性，可以根据治疗的需要制成各种剂型，方便的实现多种途径给药。本发明的化合物可经胃肠外(例如通过静脉内，腹膜内或肌内注射)，口服或局部进行给药。
这些化合物可以以治疗传染病的有效剂量经口服或胃肠外给药。当然剂量要取决于感染的严重程度。所需剂量可以以合适的间隔时间每天给药一次或几次。
对于眼睛或其它外部组织(例如口和皮肤)的传染病，这些组合物可以以软膏，乳膏，气雾剂，洗剂，粉剂，凝胶，悬浮剂，溶液或溶胶等形式局部用于患者身体的感染部位。化合物在载体中的浓度取决于感染的严重程度，但其可能的范围是0.05至7％的重量范围内。
本发明提供的制备式(I)化合物的方法是采用降低成本的汇聚式合成，使合成步数大为减少，而且避免了使用严重污染环境的苄溴，而改用更为环保的原料；脱保护的试剂也价廉易得，而且脱保护可以一步完成，所以合成收率得到提高。
本发明化合物的合成路线中涉及到了新的中间体化合物，因此，本发明的还提供了制备式(I)化合物的中间体化合物的方法。
以[1S-(1α，3α，4β)-2-氨基-1，9-二氢-9-[4-羟基-3-(羟甲基)-2-亚甲基环戊基]-6H-嘌呤-6-酚钠盐(1A)为例说明本发明，本发明式(IA)化合物的合成路线如下：
式(I)化合物的制备是以[1S-(1α，2α，3β，5α)-2-[(苯甲氧基)甲基]-6-氧杂二环[3.1.0]己-3-醇，即化合物2为原料，在钯碳催化下还原去保护得到[1S-(1α，2α，3β，5α)-2-羟甲基]-6-氧杂二环[3.1.0]己-3-醇，即化合物3；将化合物3与2，2-二甲氧基丙烷反应，得到化合物4；化合物4与2-[[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]氨基]-6-(苯甲氧基)-9H-嘌呤反应，得到6-[2-[[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]氨基]-6-苯甲氧基--9H-嘌呤-9-基]-2，2-二甲基六氢-环戊基[1，3]二噁烷-5-醇，即化合物5；以Dess-Martin试剂氧化化合物5得到6-[2-[[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]氨基]-6-苯甲氧基--9H-嘌呤-9-基]-2，2-二甲基六氢-环戊基[1，3]二噁烷-5-酮，即化合物6；以锌/四氯化钛/二溴甲烷试剂处理化合物6得到[6-苯甲氧基-9-(2，2-二甲基-5-亚甲基-六氢-环戊基[1，3]二噁烷-6-基)-9H-2-基]-(4-甲氧基苯基)二苯基甲基胺，即化合物7；化合物7脱保护得到[1S-(1α，3α，4β)-2-氨基-1，9-二氢-9-[4-羟基-3-(羟甲基)-2-亚甲基环戊基]-6H-嘌呤-6-酮，即化合物8；化合物8与对应的氢氧化物反应得到[1S-(1α，3α，4β)-2-氨基-1，9-二氢-9-[4-羟基-3-(羟甲基)-2-亚甲基环戊基]-6H-嘌呤-6-酚钠盐，即化合物1。
下面通过实施例形式的具体实施方式进一步说明本发明。应该理解的是，本发明实施例的制备方法及化合物的应用仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
【具体实施方式】
实施例1[1S-(1α，2α，3β，5α)-2-羟甲基]-6-氧杂二环[3.1.0]己-3-醇(化合物3)的制备：
将[1S-(1α，2α，3β，5α)-2-[(苯甲氧基)甲基]-6-氧杂二环[3.1.0]己-3-醇16g(67.8mmol)溶于100ml四氢呋喃中，加入10％钯碳0.5g，室温催化氢化8小时。过滤掉催化剂，减压蒸干溶剂，得到9.8g纯的化合物3。
实施例2 化合物4的制备：
将[1S-(1α，2α，3β，5α)-2-羟甲基]-6-氧杂二环[3.1.0]己-3-醇9.5g溶于无水丙酮100ml中，然后加入2，2-二甲氧基丙烷10ml和催化量的对甲苯磺酸。室温搅拌24小时。减压蒸干溶剂，然后溶于二氯甲烷100ml，以饱和碳酸氢钠(20ml×2)，饱和食盐水(20ml×2)洗，无水硫酸钠干燥，得到11g纯的化合物4。
实施例3 6-[2-[[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]氨基]-6-苯甲氧基--9H-嘌呤-9-基]-2，2-二甲基六氢-环戊基[1，3]二噁烷-5-醇(化合物5)的制备：
氮气保护下，将[2-[[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]氨基]-6-苯甲氧基--9H-嘌呤36.5g和氢化钠(60％)2.85g溶于DMF200ml中。室温搅拌2小时。然后，将10g化合物4的DMF20ml溶液加入，并升温至120℃，搅拌10小时。减压浓缩，将残留物用硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯(2∶1)洗脱得到29.3g纯的化合物5。
实施例4 6-[2-[[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]氨基]-6-苯甲氧基--9H-嘌呤-9-基]-2，2-二甲基六氢-环戊基[1，3]二噁烷-5-酮(化合物6)的制备：
氮气保护下，将叔丁醇3.6ml加到15％的Dess-Martin二氯甲烷100ml中，并室温搅拌10分钟。然后用注射器将6-[2-[[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]氨基]-6-苯甲氧基--9H-嘌呤-9-基]-2，2-二甲基六氢-环戊基[1，3]二噁烷-5-醇25g的二氯甲烷200ml溶液加入。加完后，室温搅拌至反应完全。所得混合物也乙酸乙酯(2L)稀释后，剧烈搅拌下滴加1.5∶1∶1的10％亚硫酸氢钠-饱和碳酸氢钠-饱和食盐水700ml，加完后搅拌1小时。分出有机层，水层以乙酸乙酯(1×300ml)萃取。合并有机层，并以饱和食盐水(200ml×2)洗涤。无水硫酸钠干燥，减压浓缩得26g化合物6。
实施例5 [6-苯甲氧基-9-(2，2-二甲基-5-亚甲基-六氢-环戊基[1，3]二噁烷-6-基)-9H-2-基]-(4-甲氧基苯基)二苯基甲基胺(化合物7)的制备：
氮气保护下，向6-[2-[[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]氨基]-6-苯甲氧基--9H-嘌呤-9-基]-2，2-二甲基六氢-环戊基[1，3]二噁烷-5-酮(10g，14.7mmol)的二氯甲烷(200ml)溶液中，加入锌-四氯化钛-二溴甲烷络合物[Tetr.Let.，23，4293(1982)](220ml，78mmol)。该混合物在室温下搅拌3小时至反应完全，然后缓慢倒入到饱和碳酸氢钠的水溶液中(1000ml)和二氯甲烷(1000ml)和混合溶液中。搅拌20分钟，硅藻土过滤，二氯甲烷洗涤硅藻土，分出有机层。水层以二氯甲烷萃取，将合并的有机层以无水硫酸钠干燥，减压浓缩。残留物重新溶于二氯甲烷中，硅藻土过滤，浓缩得到8.7g化合物7。
实施例6 [1S-(1α，3α，4β)-2-氨基-1，9-二氢-9-[4-羟基-3-(羟甲基)-2-亚甲基环戊基]-6H-嘌呤-6-酮(化合物8)的制备：
将[6-苯甲氧基-9-(2，2-二甲基-5-亚甲基-六氢-环戊基[1，3]二噁烷-6-基)-9H-2-基]-(4-甲氧基苯基)二苯基甲基胺(10g)，四氢呋喃(200ml)，甲醇(200ml)和3N的盐酸(50ml)的混合物在50℃下加热3小时至反应完全，冷至室温。减压浓缩，残留物溶于甲醇(100ml)和水(100ml)中，用1N的氢氧化钠调pH至6.8。减压浓缩后。残留物用CHP-20P树脂纯化，用水至2％的乙腈水溶液梯度洗脱，减压浓缩得到1.32g化合物8。
实施例7 [1S-(1α，3α，4β)-2-氨基-1，9-二氢-9-[4-羟基-3-(羟甲基)-2-亚甲基环戊基]-6H-嘌呤-6-酚钠盐(化合物1A)的制备：
将[1S-(1α，3α，4β)-2-氨基-1，9-二氢-9-[4-羟基-3-(羟甲基)-2-亚甲基环戊基]-6H-嘌呤-6-酮(1g，3.6mmol)和0.1N的氢氧化钠溶液(38ml)混合搅拌至溶解，然后室温真空干燥得1.079g化合物1A。
其结构式图谱数据如下：
1H NMR(DMSO，ppm))：7.44(s，1H)，5.515(br，1H)，5.345(t,J＝9Hz，1H)，5.170(br，2H)，5.508s，1H)，4.977(br，1H)，4.565(s，1H)，4.250(s，1H)，3.591(t，J＝5.5Hz，2H)，2.544(s，1H)，2.269(m，1H)，2.010(m，1H)；
13C NMR(DMSO，ppm)：168.10，161.05，152.34，151.88，134.43，118.68，109.92，71.49，63.99，55.91，54.61，39.63.
UV：255nm
实施例8 [1S-(1α，3α，4β)-2-氨基-1，9-二氢-9-[4-羟基-3-(羟甲基)-2-亚甲基环戊基]-6H-嘌呤-6-酚钾(化合物1B)的制备：
将[1S-(1α，3α，4β)-2-氨基-1，9-二氢-9-[4-羟基-3-(羟甲基)-2-亚甲基环戊基]-6H-嘌呤-6-酮(1g，3.6mmol)和0.1N的氢氧化钾溶液(38ml)混合搅拌至溶解，然后冷冻干燥得1.137g化合物1B。
其结构式图谱数据与实施例7相同。
实施例9 化合物8，化合物1A，化合物1B的溶解度实验：
水中的溶解度按中华人民共和国药典(2000年版)凡例中规定测定。结果如表所示。
表I溶解性实验结果 化合物 8 1A 1B 溶解度 1.5升/克 4毫升/克 3.5毫升/克
实施例10 检测化合物1A、化合物1B在体外的抗病毒活性：
在细胞培养体系中进行实验以确定化合物1A、化合物1B能有效防止各类病毒感染的程度。
(1)人体免疫缺损病毒(HIV)抗病毒实验：
MT-2细胞悬浮于培养液中，于37℃长成单层培养板，用HIV感染，于37℃吸附2小时后，在生长介质中将被感染的细胞稀释。每一浓度作3个试样。同样方法制备未感染的MT-2细胞培养物，并同样稀释，一式两份。所有实验均在96孔细胞培养皿中进行。未处置的细胞作对照。所有培养物于37℃下在含5％CO2的潮湿空气中孵育七天后，用XTT-PMS溶液通过细胞培养后的比色实验计算每孔中的活细胞数目。通过用药物处理过的病毒感染细胞和未处理的比较得出病毒的细胞病变效应CPE减少百分数，抑制CPE达50％的最低药物浓度为ID50值。
(2)丙肝病毒(HCV)和乳头状病毒(HPV)抗病毒实验：
取已长成单层的培养板，倒掉培养液，接种1000TCID50的不同病毒液50μl，置37℃5％CO2培养箱中吸附1小时后，倒掉病毒液，用含2％小牛血清的Eagle’s维持液洗细胞面3次，加入相应稀释度的药液100μl/孔。同时设病毒对照组及正常细胞对照组。将药用培养液做1∶4-1∶1024倍比稀释，置37℃5％CO2培养箱中培养评价。从药物浓度确定ID50的值，它是指病毒病变为50％时的浓度。
(3)1型单纯疱疹病毒(HSV-1)，2型单纯疱疹病毒(HSV-2)，人体巨细胞病毒(HCMV)，水痘带状疱疹病毒(VZV)抗病毒实验：
在加入含稀释两倍的实验化合物的维持介质前，在6穴培养皿中，将病毒吸附到WI-38单细胞培养层上达1小时。对于HSV-1和HSV-2而言，于37℃孵化四天后，在固定并染色的单细胞层上评价斑点扩展的抑制情况；对于HCMV和VZV，于37℃孵化7天后进行评价。从药物浓度确定ID50的值，它是指与病毒对照组比较，至少减少斑点50％时的浓度。
表II对几种病毒的ID50(μM) HIV HCV HPV VZV HCMV HSV-1 HSV-2 1A 11 2.2 3 15 75 3 6 1B 9 2.7 2.8 12 80 2.8 5.8
实施例11 化合物1A、化合物1B对鸭乙型肝炎病毒感染的治疗效果：
实验采用一日龄北京鸭，48只，静脉注射鸭乙型肝炎病毒，7天后按每组6只分成8组，即化合物1A：高剂量组、中剂量组、低剂量组，化合物1B：高剂量组、中剂量组、低剂量组，阿昔洛韦阳性对照组，病毒对照组(以生理盐水代替药物)；化合物1A、化合物1B的高剂量组为1.0mg/kg(体重)，中剂量组为0.1mg/kg，低剂量组为0.01mg/kg，阿昔洛韦的剂量为100mg/kg；口服1天1次，给药21天，给药前(T0)，给药后第10天(T10)和21天(T21)及停药后3天(P3)取血，分离血清，同时进行斑点杂交，测定鸭血清DHBV-DNA的OD值。计算血清DHBV-DNAR抑制率，观察药效。
结果表明：化合物1A、化合物1B的高剂量组(1.0mg/kg)、中剂量组(0.1mg/kg)均对鸭乙型肝炎病毒感染鸭给药21天有治疗效果，中剂量(0.1mg/kg)为最适有效剂量。而且化合物1A、化合物1B具有相同的药效。阳性药阿昔洛韦有显著抑制作用，说明实验可信。